בדיקת מבנה RNA עם פרופיל מוטציה של דימתיל סולפט עם ריצוף במבחנה ובתאים

DMS-MaP היא שיטה מבוססת ריצוף המאפשרת לנו לקבל תמונת מצב של מבנה הרנ"א, וללמוד כיצד הוא משתנה בתנאים שונים. בניגוד לשיטות קונבנציונליות לקביעת מבנה, כמו קריסטלוגרפיה ומיקרוסקופיית אלקטרונים, ניתן להשתמש ב-DMS-MaP בתאים ובהרכבי מבנה RNA דה-קונבולוטיים. מכיוון שלמבנה הרנ"א יש השלכות על שלל תופעות ביולוגיות, השיטה שלנו יכולה לספק תובנות מכניסטיות כמעט בכל תחום של מחקר ביולוגי.

התחל על ידי העברת 89 מיקרוליטרים של המאגר המתקפל לתוך צינור ייעודי של 1.5 מיליליטר עבור כל תגובה בעלת נפח סופי של 100 מיקרוליטר. מחממים את הצינור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתרמושייקר המונח מתחת למכסה המנוע הכימי. הוסיפו 10 מיקרוליטרים של מים נטולי נוקלאז לתוך צינור PCR, והעבירו לתוכו 10 פיקומולים של RNA.

דגרו אותו בתרמוציקלר בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת כדי לנטרל את הרנ"א. ואז מיד להניח את הצינור על גוש קרח כדי למנוע קיפול שגוי של RNA. כעת, כדי לשחזר את הרנ"א, הוסיפו את הדגימה לצינור הייעודי המכיל את החיץ המתקפל מחדש בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס וערבבו היטב לפני הדגירה שלו במשך 10 עד 20 דקות.

לאחר מכן, הוסף מיקרוליטר אחד של 100% דימתיל סולפט, או DMS, בעל ריכוז של 10.5 טוחנת לתוך הצינור המכיל את דגימת ה- RNA, ודגירה של תערובת התגובה במשך חמש דקות תוך ניעור זה 800 עד 1, 400 סיבובים לדקה. לאחר התגובה בת חמש הדקות, הרוו אותה עם 60 מיקרוליטרים של 100% בטא-מרקפטואתנול, וערבבו אותה היטב לפני המערבולת ומיד מניחים את הרנ"א על הקרח. לאחר מכן נקו את הרנ"א והכניסו אותו ל-10 מיקרוליטרים של מים נטולי נוקלאז.

לכמת את הרנ"א באמצעות ספקטרופוטומטר. לבסוף, לאחסן את RNA שונה במינוס 80 מעלות צלזיוס. לאחר הוספת תערובת התגובה לצינור ה-PCR, העבירו לפחות 100 ננוגרם של ה-RNA המותאם ב-10 מיקרוליטרים של מים נטולי נוקלאז לצינור ה-PCR.

לדגום את התערובת בטמפרטורה של 57 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות עד 1.5 שעות בתרמו-ציקלר. 30 דקות מספיקות כדי ליצור מוצר המכיל 500 נוקלאוטידים. לאחר מכן, מוסיפים לו מיקרוליטר אחד של ארבעה נתרן הידרוקסיד טוחנת, מערבבים היטב על ידי פיפטה, ודוגרים בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות כדי להשפיל את הרנ"א, ולשחרר TGIRT מהדנ"א המשלים.

באמצעות גישה מבוססת עמודות להסרת הפריימרים, נקו את הדנ"א המשלים. ולבצע PCR כדי להגביר אותו. ודא את הצלחת ה- PCR על ידי הפעלת שני מיקרוליטרים של מוצר ה- PCR על ג'ל אגרוז לפני שתמשיך להכנת הספרייה.

לאחר מכן כימתו את השברים שחולצו באמצעות ספקטרופוטומטר לפני יצירת אינדקס של השברים לריצוף. העבירו את התאים הנגועים בנגיף שגודלו לשלב ההדבקה הרצוי לתוך קולט אדים ייעודי ומתאים בעל רמת הבטיחות הביולוגית הנדרשת. הוסף נפח של 2.5% של DMS למדיום התרבית המכיל את התאים, ואטם את המיכל באמצעות פרפילם.

מיד לדגור את המיכל ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. לאחר הדגירה, יש לבצע פיפטה בזהירות ולהשליך את המדיום המכיל DMS לפסולת כימית מתאימה. לאחר מכן מוסיפים בעדינות 10 מיליליטר של מאגר עצירה לתוך התאים, מגרדים את התאים ומעבירים אותם לצינור חרוטי של 15 מיליליטר.

גלולה למטה את התאים על ידי צנטריפוגה הצינור במשך שלוש דקות ב 3, 000 גרם. הסר את supernatant, ולשטוף את כדור התא פעמיים עם 10 מיליליטר של PBS. הסר בזהירות PBS שיורי ככל האפשר לאחר הכביסה.

ממיסים את הכדור בכמות מתאימה של מגיב בידוד RNA לביצוע מיצוי RNA. לאחר מכן, הוסיפו 200 מיקרוליטרים של כלורופורם למיליליטר אחד של תאים הומוגניים בריאגנט בידוד RNA, ומערבבים אותו למשך 15 עד 20 שניות עד שתמיסת התא הופכת ורודה בהירה. המתן עד שהתרחשה הפרדת פאזה, המסומנת על ידי שלב השומנים הוורוד המתיישב בתחתית.

סובב את הצינור במהירות של כ -20, 000 גרם במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס לפני העברת השלב המיימי העליון לצינור חדש. נקו את ה-RNA והוסיפו כמות מספקת של מים נטולי נוקלאזות. לאחר מכן, לאחר ביצוע דלדול RNA ריבוזומלי בגישה המועדפת, יש לדחוס את הרנ"א בנפח הולם של מים נטולי נוקלאזה, ולכמת אותו באמצעות ספקטרופוטומטר.

ניתן להשתמש שוב ב-RNA המטוהר ב-RT-PCR. באמצעות שרת האינטרנט שהוזכר, ניתן לנתח בנוחות את נתוני DMS-MaP. הקריאות ממופות להפניה, והמוטציות לכל בסיס נספרות.

הקבצים הממוצעים של האוכלוסייה המתקבלים יכולים לשמש כאילוצים בתוכנת חיזוי מבנה RNA ידועה. ניתן לדמיין את מבני האנרגיה החופשית המינימליים המתקבלים באמצעות תוכנה כמו VARNA. נכון לעכשיו, רק הגרסה היציבה של DREAM יכולה לנטרל הרכבי מבנה RNA.

עם זאת, העבודה כדי להפוך תכונה זו לנגישה יותר לכל הקהילה נמצאת בעיצומה. שעתוק במבחנה של מקטע gBlock המוארך על ידי חיבור של מקדם פולימראז T7 יצר את ה-RNA המעניין, והופיע כלהקה יחידה ב-300 נוקלאוטידים על ג'ל 1%agarose. ההצלחה של RT-PCR ספציפי לגן שבוצע על RNA שונה DMS צוינה על ידי פס יחיד ב 300 זוגות בסיס על ג'ל 2% agarose.

הקטע האינדקס הופיע כ-150 זוגות בסיסים גבוה כצפוי. טיפול DMS בוצע בתאי HCT-8 בעלי השפעה ציטופתית ארבעה ימים לאחר ההדבקה בנגיף. הרנ"א הכולל שחולץ הופיע על ג'ל האגרוז כשני פסים בהירים, המהווים את יחידות המשנה 40S ו-60S.

לאחר דלדול הרנ"א הריבוזומלי, נעלמו שני הפסים הבהירים, והותירו כתם בנתיב המתאים. לאחר הכנת הספרייה, הדוגמאות היו בחלוקות בגדלים שונים והופיעו כמריחה. הרצועה נכרתה בין 200 ל-500 נוקלאוטידים, ודימרים של המתאם הופרדו החוצה.

מודל המבנה של הגנום של SARS-CoV-2 הראה כי לבסיסים עם קונפורמציה פתוחה יש תגובתיות גבוהה יותר בהשוואה לאלה העוסקים בזיווג בסיסים. פרופיל התגובה של הבסיסים הצביע על כך שלאורציל וגואנין היו ערכי תגובתיות נמוכים ולא שונו על ידי DMS. בעזרת השיטה שלנו, אנו מסוגלים לחזות מבנים בתאים באופן בעל תפוקה גבוהה ללא מגבלות גודל.

מדדי בקרה חשובים מאוד, מכיוון שהם מספקים תובנה לגבי הדיוק של תחזיות המבנה. כדי לאמת עוד יותר את דיוק החיזוי, יש לערוך ניסויים נוספים שמפריעים או משנים את המבנה.