3.3K Views
•
10:34 min
•
December 9th, 2022
DOI :
December 9th, 2022
•0:04
Introduction
0:36
Gene‐Specific In Vitro DMS Modification
2:49
Gene‐Specific RT‐PCR of Modified RNA
4:19
Whole‐Genome DMS‐MaP Using Virus‐Infected Cells
7:17
Analysis of the Sequencing Data
8:12
Results: Probing RNA Structure with Dimethyl Sulfate Mutational Profiling and Sequencing
10:00
Conclusion
Transcript
DMS-MaP er en sekvenseringsbasert metode som lar oss få et øyeblikksbilde av RNA-strukturen, og lære hvordan den endres under forskjellige forhold. I motsetning til konvensjonelle strukturbestemmelsesmetoder, som krystallografi og elektronmikroskopi, kan DMS-MaP brukes i celler og dekonvoluerte RNA-strukturensembler. Siden RNA-struktur har implikasjoner i en rekke biologiske fenomener, kan vår metode gi mekanistisk innsikt i nesten alle felt av biologisk forskning.
Begynn med å overføre 89 mikroliter av omfoldingsbufferen til et utpekt 1, 5 milliliter rør for hver reaksjon med et endelig volum på 100 mikroliter. Forvarm røret ved 37 grader Celsius i en termoshaker plassert under en kjemisk hette. Tilsett 10 mikroliter nukleasefritt vann i et PCR-rør, og overfør en til 10 picomol RNA i den.
Inkuber den i en termocykler ved 95 grader Celsius i ett minutt for å denaturere RNA. Og legg deretter røret umiddelbart på en isblokk for å unngå feilfolding av RNA. Nå, for å brette RNA på nytt, legg prøven til det angitte røret som inneholder omfoldingsbufferen ved 37 grader Celsius og bland den godt før du inkuberer den i 10 til 20 minutter.
Deretter legger du til en mikroliter 100% dimetylsulfat, eller DMS, med en konsentrasjon på 10,5 molar i røret som inneholder RNA-prøven, og inkuberer reaksjonsblandingen i fem minutter mens du rister den ved 800 til 1.400 rotasjoner per minutt. Etter fem minutters reaksjon, slukk den med 60 mikroliter 100% beta-merkaptoetanol, og bland den godt før vortexing og umiddelbart plassere RNA på is. Rengjør deretter RNA og eluere det i 10 mikroliter nukleasefritt vann.
Kvantifiser RNA ved hjelp av et spektrofotometer. Til slutt lagrer du det modifiserte RNA ved minus 80 grader Celsius. Etter tilsetning av reaksjonsblandingen i PCR-røret, overfør minst 100 nanogram av det eluerte modifiserte RNA i 10 mikroliter nukleasefritt vann til PCR-røret.
Inkuber blandingen ved 57 grader Celsius i 30 minutter til 1,5 timer i en termocycler. 30 minutter er tilstrekkelig til å lage et produkt som inneholder 500 nukleotider. Deretter legger du til en mikroliter fire molar natriumhydroksyd til det, bland godt med pipette, og inkuber ved 95 grader Celsius i tre minutter for å nedbryte RNA, og frigjør TGIRT fra komplementært DNA.
Bruk en kolonnebasert tilnærming for å fjerne primerne, rydd opp komplementært DNA. Og utfør PCR for å forsterke den. Bekreft PCR-suksessen ved å kjøre to mikroliter av PCR-produktet på en agarosegel før du går videre til bibliotekpreparatet.
Kvantifiser deretter de ekstraherte fragmentene ved hjelp av et spektrofotometer før du indekserer fragmentene for sekvensering. Overfør de virusinfiserte cellene som er vokst til ønsket infeksjonsstadium til en dedikert og passende avtrekkshette med det nødvendige biosikkerhetsnivået. Tilsett 2,5% volum DMS til kulturmediet som inneholder cellene, og forsegle beholderen med parafilm.
Inkuber beholderen umiddelbart ved 37 grader Celsius i fem minutter. Etter inkubasjon, pipetter forsiktig ut og kast det DMS-holdige mediet i passende kjemisk avfall. Tilsett deretter forsiktig 10 milliliter stoppbuffer i cellene, skrap cellene og overfør dem til et 15 milliliter konisk rør.
Pellet ned cellene ved å sentrifugere røret i tre minutter ved 3.000 g. Fjern supernatanten, og vask cellepelleten to ganger med 10 ml PBS. Fjern forsiktig resterende PBS så mye som mulig etter vasken.
Oppløs pelleten i en passende mengde RNA-isolasjonsreagens for å utføre RNA-ekstraksjon. Deretter tilsettes 200 mikroliter kloroform til en milliliter homogeniserte celler i RNA-isolasjonsreagenset, og hvirvel det i 15 til 20 sekunder til celleoppløsningen blir lys rosa. Vent til faseseparasjon har skjedd, noe som indikeres av den rosa lipidfasen som legger seg nederst.
Spinn røret med en hastighet på rundt 20.000 g i 15 minutter ved fire grader Celsius før du overfører den øvre vandige fasen til et nytt rør. Rengjør RNA og eluere i et tilstrekkelig volum nukleasefritt vann. Etter å ha utført ribosomal RNA-uttømming ved hjelp av den foretrukne tilnærmingen, eluerer du RNA i et tilstrekkelig volum nukleasefritt vann og kvantifiserer det ved hjelp av et spektrofotometer.
Det rensede RNA kan brukes igjen i RT-PCR. Ved hjelp av den nevnte webserveren kan DMS-MaP-dataene enkelt analyseres. Avlesningene er kartlagt til en referanse, og per basemutasjoner telles.
De resulterende gjennomsnittlige populasjonsfilene kan brukes som begrensninger i velkjent RNA-strukturprediksjonsprogramvare. De resulterende minimum frie energistrukturene kan visualiseres ved hjelp av programvare som VARNA. Per nå er det bare den stabile versjonen av DREAM som kan dekonvoluere RNA-strukturensembler.
Arbeidet med å gjøre denne funksjonen mer tilgjengelig for hele samfunnet pågår imidlertid. In vitro transkripsjon av gBlock-fragmentet langstrakt ved festing av en T7-polymerasepromotor genererte RNA av interesse, som vises som et enkelt bånd ved 300 nukleotider på en 1% agarosegel. Suksessen til den genspesifikke RT-PCR utført på DMS-modifisert RNA ble indikert av et enkelt bånd ved 300 basepar på en 2% agarosegel.
Det indekserte fragmentet virket omtrent 150 basepar høyere som forventet. DMS-behandling ble utført på HCT-8-celler som viste cytopatisk effekt fire dager etter infeksjon med viruset. Det ekstraherte totale RNA dukket opp på agarosegelen som to lyse bånd, som utgjorde 40S- og 60S-underenhetene.
Etter ribosomal RNA-uttømming forsvant de to lyse båndene, og etterlot et smør i den tilsvarende banen. Etter bibliotekforberedelse hadde prøvene varierende størrelsesfordelinger og fremsto som et smør. Båndet ble skåret ut mellom 200 og 500 nukleotider, og adapterdimerne ble skilt ut.
Strukturmodellen til SARS-CoV-2-genomet viste at baser med åpen konformasjon har høyere reaktivitet sammenlignet med de som er engasjert i baseparing. Reaktivitetsprofilen til basene indikerte at uracil og guanin hadde lave reaktivitetsverdier og ikke ble modifisert av DMS. Med vår metode er vi i stand til å forutsi strukturer i celler på en høy gjennomstrømningsmåte uten størrelsesbegrensninger.
Kontrollberegninger er svært viktige, fordi de gir innsikt i nøyaktigheten av strukturforutsigelsene. For ytterligere å verifisere nøyaktigheten av prediksjonen, bør flere eksperimenter som forstyrrer eller endrer strukturen utføres.
Protokollen gir instruksjon for modifisering av RNA med dimetylsulfat for mutasjonsprofileringseksperimenter. Det inkluderer in vitro og in vivo sondering med to alternative biblioteksforberedelsesmetoder.
Explore More Videos
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved