Name: contact mode atomic force microscopy as a rapid technique for morphological observation and bacterial cell damage analysis
Uploaded: 2023-06-30T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Contact Mode Atomic Force Microscopy as a Rapid Technique for Morphological Observation and Bacterial Cell Damage Analysis at JoVE.com

Ramiro Muniz-Diaz takker CONACyT for stipendiet.

1. Bakteriel isolering og identifikation
<ol><li>Isolering af en endofytisk stamme fra hvidløgspæremeristemer:<ol><li>2 mm fragmenter af meristemer fra tidligere skrællede, desinficerede og skårne hvidløgsløg anbringes på trypticase sojaagar (TSA) som et rigt vækstmedium, og de inkuberes ved 25 °C i 1 dag.</li>
		<li>Baseret på de morfologiske forskelle i bakteriekolonierne - form, størrelse, farve, kant, transmitteret lys, reflekteret lys, tekstur, konsistens og pigmentproduktion - beskrive...

<ol>
	<li>Koch, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+form+of+the+bacterial+cell+wall.">Growth and form of the bacterial cell wall.</a> American Scientist. 78 (4), 327-341 (1990).</li><li>Si, F., Li, B., Margolin, W., Sun, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+growth+and+form+under+mechanical+compression.">Bacterial growth and form under mechanical compression.</a> Scientific Report. 5, 11367 (2015).</li><li>Pavlova, M. D., Asaturova, A. M., Kozitsyn, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+cell+shape:+Some+features+of+ultrastructure,+evolution,+and+ecology.">Bacterial cell shape: Some features of ultrastructure, evolution, and ecology.</a> Biology Bulletin Reviews. 12, 254-265 (2022).</li><li>Cabeen, M. T., Jacobs-Wagner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+cell+shape.">Bacterial cell shape.</a> Nature Reviews Microbiology. 3 (8), 601-610 (2005).</li><li>Smith, W. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+morphology+drives+spatial+patterning+in+microbial+communities.">Cell morphology drives spatial patterning in microbial communities.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 114 (3), E280-E286 (2017).</li><li>Volke, D. C., Nikel, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+bacteria+in+shape:+Synthetic+morphology+approaches+for+the+design+of+efficient+microbial+cell+factories.">Getting bacteria in shape: Synthetic morphology approaches for the design of efficient microbial cell factories.</a> Advanced Biosystems. 2 (11), 1800111 (2018).</li><li>Mi, L., Ning, X., Lianqing, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peak+force+tapping+atomic+force+microscopy+for+advancing+cell+and+molecular+biology.">Peak force tapping atomic force microscopy for advancing cell and molecular biology.</a> Nanoscale. 13 (18), 8358-8375 (2021).</li><li>Hoffman, C. S., Winston, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ten-minute+DNA+preparation+from+yeast+efficiently+releases+autonomous+plasmids+for+transformation+of+Escherichia+coli.">A ten-minute DNA preparation from yeast efficiently releases autonomous plasmids for transformation of Escherichia coli.</a> Gene. 57 (2-3), 267-272 (1987).</li><li>Weisburg, W. G., Barns, S. M., Pelletier, D. A., Lane, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=16S+ribosomal+DNA+amplification+for+phylogenetic+study.">16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study.</a> Journal of Bacteriology. 173 (2), 697-703 (1991).</li><li>Behr, S., M&#228;tzig, M., Levin, A., Eickhoff, H., Heller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fully+automated+multicapillary+electrophoresis+device+for+DNA+analysis.">A fully automated multicapillary electrophoresis device for DNA analysis.</a> ELECTROPHORESIS. 20 (7), 1492-1507 (1999).</li><li>Seliger, H., Groger, G., Jirikowksi, G., Ortigao, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+methods+for+the+solid-phase+sequence+analysis+of+nucleic+acid+fragments+using+the+Sanger+dideoxy+procedure.">New methods for the solid-phase sequence analysis of nucleic acid fragments using the Sanger dideoxy procedure.</a> Nucleosides &amp; Nucleotides. 9 (3), 383-388 (1990).</li><li>Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+local+alignment+search+tool.">Basic local alignment search tool.</a> Journal of Molecular Biology. 215 (3), 403-410 (1990).</li><li>Stackebrandt, E., Ebers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taxonomic+parameter+revisited:+Tarnished+gold+standards.">Taxonomic parameter revisited: Tarnished gold standards.</a> Microbiology Today. 33, 152-155 (2006).</li><li>Mu&#241;iz Diaz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+triethylamine-based+synthesis+of+MgO+nanoparticles+and+their+antibacterial+effect+against+pathogenic+bacteria.">Two-step triethylamine-based synthesis of MgO nanoparticles and their antibacterial effect against pathogenic bacteria.</a> Nanomaterials. 11 (2), 410 (2021).</li><li>Andrews, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+minimum+inhibitory+concentrations.">Determination of minimum inhibitory concentrations.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 48, 5-16 (2001).</li><li>Sarker, S. D., Nahar, L., Kumarasamy, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtitre+plate-based+antibacterial+assay+incorporating+resazurin+as+an+indicator+of+cell+growth,+and+its+application+in+the+in+vitro+antibacterial+screening+of+phytochemicals.">Microtitre plate-based antibacterial assay incorporating resazurin as an indicator of cell growth, and its application in the in vitro antibacterial screening of phytochemicals.</a> Methods. 42 (4), 321-324 (2007).</li><li>Giesbrecht, P., Kersten, T., Maidhof, H., Wecke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcal+cell+wall:+Morphogenesis+and+fatal+variations+in+the+presence+of+penicillin.">Staphylococcal cell wall: Morphogenesis and fatal variations in the presence of penicillin.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (4), 1371-1414 (1998).</li><li>Yamada, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=autolysin+ring+associated+with+cell+separation+of+Staphylococcus+aureus.">autolysin ring associated with cell separation of Staphylococcus aureus.</a> Journal of Bacteriology. 178 (6), 1565-1571 (1996).</li><li>Zuttion, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anti-adhesive+effect+of+glycoclusters+on+Pseudomonas+aeruginosa+bacteria+adhesion+to+epithelial+cells+studied+by+AFM+single+cell+force+spectroscopy.">The anti-adhesive effect of glycoclusters on Pseudomonas aeruginosa bacteria adhesion to epithelial cells studied by AFM single cell force spectroscopy.</a> Nanoscale. 10 (26), 12771-12778 (2018).</li><li>Kahli, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+growth+conditions+on+Pseudomonas+fluorescens+morphology+characterized+by+atomic+force+microscopy.">Impact of growth conditions on Pseudomonas fluorescens morphology characterized by atomic force microscopy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 23 (17), 9579 (2022).</li><li>Kambli, P., Valavade, A., Kothari, D. C., Kelkar-Mane, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphostructural+changes+induced+in+E.+coli+exposed+to+copper+ions+in+water+at+increasing+concentrations.">Morphostructural changes induced in E. coli exposed to copper ions in water at increasing concentrations.</a> World Journal of Pharmaceutical Research. 4 (10), 837-852 (2015).</li><li>Kochan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+In+vivo+atomic+force+microscopy-infrared+spectroscopy+of+bacteria.">et al. In vivo atomic force microscopy-infrared spectroscopy of bacteria.</a> Journal of the Royal Society Interface. 15, 140 (2018).</li><li>Stoimenov, P. K., Klinger, R. L., Marchin, G. L., Klabunde, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+oxide+nanoparticles+as+bactericidal+agents.">Metal oxide nanoparticles as bactericidal agents.</a> Langmuir. 18, 6679-6686 (2002).</li><li>Lee, H. -. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NaCl+influences+thermal+resistance+and+cell+morphology+of+Escherichia+coli+strains.">NaCl influences thermal resistance and cell morphology of Escherichia coli strains.</a> Journal of Food Safety. 36 (1), 62-68 (2016).</li><li>Song, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibacterial+effects+of+Schisandra+chinensis+extract+on+and+its+application+in+food.">Antibacterial effects of Schisandra chinensis extract on and its application in food.</a> Journal of Food Safety. 38 (5), e12503 (2018).</li><li>Mohamed, W. M., Khallaf, M. F., Hassan, A. A., Elbayoumi, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermotolerance+of+Staphylococcus+aureus+after+sublethal+heat+shock.">Thermotolerance of Staphylococcus aureus after sublethal heat shock.</a> Arab Universities Journal of Agricultural Sciences. 27 (1), 467-477 (2019).</li><li>Shar, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomineralization+of+platinum+by+Escherichia+coli.">Biomineralization of platinum by Escherichia coli.</a> Metals. 9 (4), 407 (2019).</li><li>Baidamshina, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+microbial+biofilms+using+Ficin,+a+nonspecific+plant+protease.">Targeting microbial biofilms using Ficin, a nonspecific plant protease.</a> Scientific Reports. 7, 46068 (2017).</li><li>Ovchinnikova, E. S., vander Mei, H. C., Krom, B. P., Busscher, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exchange+of+adsorbed+serum+proteins+during+adhesion+of+Staphylococcus+aureus+to+an+abiotic+surface+and+Candida+albicans+hyphae-An+AFM+study.">Exchange of adsorbed serum proteins during adhesion of Staphylococcus aureus to an abiotic surface and Candida albicans hyphae-An AFM study.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 110, 45-50 (2013).</li></ol>

Mikroskopi er en teknik, der almindeligvis anvendes i biologiske laboratorier, der muliggør undersøgelse af strukturen, størrelsen, morfologien og det cellulære arrangement af biologiske prøver. For at forbedre denne teknik kan der anvendes flere typer mikroskoper, der adskiller sig fra hinanden med hensyn til deres optiske eller elektroniske egenskaber, som bestemmer instrumentets opløsningseffekt.
I videnskabelig forskning kræves brugen af mikroskopi til karakterisering af bakteriecel...

Forskellige bakterieformer blev først bemærket af Antony van Leeuwenhoek i det 17. århundrede1. Bakterier har eksisteret i en stor mangfoldighed af former siden oldtiden, lige fra kugler til forgreningsceller2. Celleform er en grundlæggende betingelse for bakterielle taxonomer til at beskrive og klassificere hver bakterieart, hovedsageligt til morfologisk adskillelse af gram-positiv og gram-negativ phyla3. Flere elementer er kendt for at bestemme bakterielle celleformer, som alle er involveret i celledækslerne og støtten som komponenter i cellevæggen og membranen såvel som i cytoskelettet. På denne måde belyser forskere stadig de kemiske, biokemiske og fysiske mekanismer og processer, der er involveret i bestemmelse af bakteriecelleformer, som alle er defineret af klynger af gener, der definerer bakterieformer 2,4.
Derudover har forskere vist, at stavformen sandsynligvis er den forfædres form af bakterieceller, da denne celleform synes optimal i cellesignifikante parametre. Således betragtes kokker, spiral, vibrio, filamentøse og andre former som tilpasninger til forskellige miljøer; Faktisk har bestemte morfologier udviklet sig uafhængigt flere gange, hvilket tyder på, at bakteriernes former kunne være tilpasninger til bestemte miljøer 3,5. Men i løbet af bakteriecellens livscyklus ændres celleformen, og dette sker også som en genetisk reaktion på skadelige miljøforhold3. Bakteriens celleform og størrelse bestemmer stærkt bakteriernes stivhed, robusthed og overflade-til-volumen-forhold, og denne egenskab kan udnyttes til bioteknologiske processer6.
Elektronisk mikroskopi bruges til at studere biologiske prøver på grund af den høje forstørrelse, der kan nås ud over lysbaserede mikroskoper. Transmissionselektronmikroskopi (TEM) og scanningelektronmikroskopi (SEM) er de mest almindeligt anvendte teknikker til dette formål; Prøver kræver dog nogle behandlinger, før de placeres i mikroskopets kammer for at opnå passende billeder. Et gulddæksel på prøverne er påkrævet, og den tid, der bruges til total billedoptagelse, bør ikke være for lang. I modsætning hertil er atomkraftmikroskopi (AFM) en teknik, der i vid udstrækning anvendes til analyse af overflader, men anvendes også til undersøgelse af biologiske prøver.
Der er flere typer AFM-tilstande, der anvendes i overfladeanalyse, såsom kontakttilstand, berøringsfri tilstand eller tapping, magnetisk kraftmikroskopi (MFM), ledende AFM, piezoelektrisk kraftmikroskopi (PFM), peak force tapping (PFT), kontaktresonans og kraftvolumen. Hver tilstand bruges til analyse af materialer og giver forskellige oplysninger om materialernes overflade og deres mekaniske og fysiske egenskaber. Imidlertid anvendes nogle AFM-tilstande til analyse af biologiske prøver in vitro, såsom PFT, fordi PFT giver mulighed for at opnå topografiske og mekaniske data om celler i et flydende medium7.
I dette arbejde brugte vi den mest basale tilstand, der er inkluderet i enhver gammel og enkel AFM-model - kontakttilstanden. AFM bruger en skarp sonde (ca. <50 nm i diameter) til at scanne områder mindre end 100 μm. Sonden er justeret til prøven for at interagere med de kraftfelter, der er knyttet til prøven. Overfladen scannes med sonden for at holde kraften konstant. Derefter genereres et billede af overfladen ved at overvåge udkragningens bevægelse, når den bevæger sig over overfladen. De indsamlede oplysninger giver overfladens nanomekaniske egenskaber, såsom vedhæftning, elasticitet, viskositet og forskydning.
I AFM-kontakttilstand scannes udkragningen hen over prøven ved en fast afbøjning. Dette gør det muligt at bestemme højden af prøverne (Z), og dette repræsenterer en fordel i forhold til de andre elektroniske mikroskopteknikker. AFM-softwaren tillader generering af en 3D-billedscanning ved interaktionen mellem spidsen og prøveoverfladen, og spidsafbøjningen er korreleret med prøvens højde gennem en laser og en detektor.
I statisk tilstand (kontakttilstand) med konstant kraft præsenterer udgangen to forskellige billeder: højden (z-topografi) og afbøjnings- eller fejlsignalet. Statisk tilstand er en værdifuld, enkel billeddannelsestilstand, især for robuste prøver i luft, der kan håndtere de høje belastninger og vridningskræfter, der udøves af statisk tilstand. Afbøjnings- eller fejltilstanden betjenes i konstant krafttilstand. Topografibilledet forbedres dog yderligere ved at tilføje afbøjningssignalet til overfladestrukturen. I denne tilstand kaldes afbøjningssignalet også fejlsignalet, da afbøjningen er feedbackparameteren; Alle funktioner eller morfologi, der vises i denne kanal, skyldes "fejlen" i feedback-sløjfen eller rettere på grund af den feedback-sløjfe, der kræves for at opretholde et konstant afbøjningssætpunkt.
AFM's unikke design gør den kompakt - lille nok til at passe på en bordplade - samtidig med at den har høj nok opløsning til at løse atomtrin. AFM-udstyret har lavere omkostninger end udstyret til andre elektroniske mikroskoper, og vedligeholdelsesomkostningerne er minimale. Mikroskopet kræver ikke et laboratorium med særlige forhold såsom et rent rum eller et isoleret rum; Det behøver kun et vibrationsfrit skrivebord. For AFM behøver prøverne ikke at gennemgå omfattende forberedelse som for andre teknikker (gulddæksel, slankning); Der må kun fastgøres en tør prøve til prøveholderen.
Vi bruger AFM-kontakttilstand til at observere bakterielle morfologier og virkningerne af NP'er. Populationen og cellulær morfologi af bakterier fastgjort på en støtte kan observeres, såvel som den cellulære skade produceret af nanopartikler på bakteriearterne. Billederne opnået ved AFM-kontakttilstand bekræfter, at det er et kraftfuldt værktøj og ikke er begrænset af reagenser og komplicerede procedurer, hvilket gør det til en enkel, hurtig og økonomisk metode til bakteriel karakterisering.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AFM EasyScan 2</td>
			<td>NanoSurf</td>
			<td>discontinued</td>
			<td>Measurement Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bacteriological loop</td>
			<td>No aplica</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>instrument for bacterial inoculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BigDye Terminator v3.1</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4337455</td>
			<td>Matrix installation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioedit</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>version 7.2.5</td>
			<td>Sequence alignment editor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cary 60 spectrometer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ceftriazone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>to remove particles that interfere with AFM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ContAI-G Silicon cantilever</td>
			<td>BudgetSensors</td>
			<td>ContAl-G-10</td>
			<td>Measurement Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eosin and methylene blue agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>bacterial culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC 25922</td>
			<td>bacterial strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq Flexi DNA Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M8295</td>
			<td>PCR of 16S rRNA gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microplate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10558295</td>
			<td>for microdilution analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M&#252;ller-Hinton broth</td>
			<td>Merck</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>bacterial culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nutrient agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>bacterial culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nutritious broth</td>
			<td>Merck</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>bacterial culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>growth of bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas hunanensis 9AP</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>isolated from the garlic bulb by CNRG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sanger sequencing</td>
			<td>Macrogen</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>sequencing service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScienceDesk Anti-Vibration workstation</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>slides</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>glass holder for bacterial sample analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staphylococcus aureus</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC 25923</td>
			<td>bacterial strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermalcycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>Veriti-4375786</td>
			<td>PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticasein soy agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>BA-256665</td>
			<td>growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrasonicator</td>
			<td>Cole-Parmer Ultrasonic Processor, 220 VAC</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>for mixing the nanoparticle dilutions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

contact mode atomic force microscopy as a rapid technique for morphological observation and bacterial cell damage analysis

Elektronmikroskopi er et af de værktøjer, der kræves for at karakterisere cellulære strukturer. Proceduren er imidlertid kompliceret og dyr på grund af prøveforberedelsen til observation. Atomkraftmikroskopi (AFM) er en meget nyttig karakteriseringsteknik på grund af dens høje opløsning i tre dimensioner og på grund af fraværet af ethvert krav til vakuum og prøveledningsevne. AFM kan afbilde en lang række prøver med forskellige topografier og forskellige typer materialer. 
AFM giver 3D-topografiinformation i høj opløsning fra angstrom-niveau til mikronskala. I modsætning til traditionel mikroskopi bruger AFM en sonde til at generere et billede af overfladetopografien af en prøve. I denne protokol foreslås brugen af denne type mikroskopi til morfologisk og celleskadekarakterisering af bakterier fastgjort på en støtte. Stammer af Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922) og Pseudomonas hunanensis (isoleret fra hvidløgsløgprøver) blev anvendt. I dette arbejde blev bakterieceller dyrket i specifikke kulturmedier. For at observere celleskader blev Staphylococcus aureus og Escherichia coli inkuberet med forskellige koncentrationer af nanopartikler (NP'er). 
En dråbe bakteriel suspension blev fastgjort på en glasstøtte, og billeder blev taget med AFM i forskellige skalaer. De opnåede billeder viste bakteriens morfologiske egenskaber. Ved anvendelse af AFM var det endvidere muligt at observere skaden på den cellulære struktur forårsaget af effekten af NP'er. Baseret på de opnåede billeder kan kontakt-AFM bruges til at karakterisere morfologien af bakterieceller fastgjort på en understøtning. AFM er også et velegnet værktøj til undersøgelse af NP'ers virkninger på bakterier. Sammenlignet med elektronmikroskopi er AFM en billig og brugervenlig teknik.

Billeder af morfologien og størrelsen af S. aureus og P. hunanensis stammer samt befolkningsorganisationen af begge stammer blev taget ved atomkraftmikroskopi i kontakttilstand.  S. aureus-billederne viste, at dens befolkning var fordelt på zoner med aggregater af kokker (figur 1A). Med en stigning i skala var der en større forståelse af populationsfordelingen og morfologien af kokkerne (figur 1B). Mikroskopirapporterne viste, at ...

Watch this Scientific Journal Video about Contact Mode Atomic Force Microscopy as a Rapid Technique for Morphological Observation and Bacterial Cell Damage Analysis at JoVE.com

Contact Mode Atomic Force Microscopy as a Rapid Technique for Morphological Observation and Bacterial Cell Damage Analysis

Her præsenterer vi anvendelsen af atomkraftmikroskopi (AFM) som en enkel og hurtig metode til bakteriel karakterisering og analyserer detaljer såsom bakteriestørrelse og form, bakteriekulturbiofilm og aktiviteten af nanopartikler som baktericider.

Kontakttilstand Atomic Force mikroskopi som en hurtig teknik til morfologisk observation og bakteriel celleskadeanalyse

Electron microscopy is one of the tools required to characterize cellular structures. However, the procedure is complicated and expensive due to the ...

Denne protokol viser brugen af kontaktmodus atomkraftmikroskopi til at observere ændringer i cellemorfologi på grund af en bestemt sygdom eller behandling. Det anbefales stærkt at bruge forseglede beholdere til denne procedure for at undgå forurening og analysere den faste prøve så hurtigt som muligt for at undgå aldring. Begynd med at fastgøre prøverne på diaset ved forsigtigt at føre diaset over en flamme flere gange, indtil prøven er tør.Placer de faste prøver i en petriskål og transporter dem til atomkraftmikroskopudstyret til observation. Tænd derefter computeren og atomkraftmikroskopet. Vælg derefter kontakttilstand, ContAI-G-sonder og indstillinger for automatisk hældning i softwaren.Indstil standardværdierne for Z-controlleren ved at indstille sætpunktet til 20 nanometer, P-forstærkning ved 10.000, jeg vinder ved 1.000, D-forstærkning ved nul og spidsspænding til nul millivolt. Brug 70 mikrometer scanningsområdehovedet til at placere prøverne i AFM-kontakttilstand. Få et hurtigt overblik over overfladen af området under sonden ved hjælp af et kamera monteret på to objektiver, der er integreret i scanningshovedet.Vælg nu det ønskede område ved manuelt at forskyde det i XY-planet. Lad sonden nærme sig prøveoverfladen elektronisk, indtil kontakten er nået. Juster XY-måleplanet på scanneren og prøveoverfladen elektronisk ved at reducere XY-hældningsretningen.Indstil standardparametrene for softwaren til en linje pr. Sekund og 256 point pr. Linje. Udfør derefter et fuldt scanningsområde på et område på 70 x 70 mikrometer. Vælg det mindre område ved hjælp af zoomværktøjet.Vælg et nyt område fra prøven ved at trække udkragningen elektronisk tilbage og flytte prøven langs XY-planet. Udfør derefter en ny scanning som vist før. Brug derefter linje for linje nivellering i værktøjets menu i billedet i filtervalget til at udføre databehandling.Optimer den maksimale og minimale højde i farvebjælken for at opnå den bedste billedopløsning. Til sidst skal du udføre billedanalysen ved hjælp af analysemenuen. Vælg de indledende og sidste punkter med det ønskede værktøj for at bestemme længden og afstanden.Atomkraftmikroskopisk analyse af bakteriekulturerne viste, at Staphylococcus aureus-kulturerne blev fordelt efter zoner med kokosaggregater. Forhøjede skalaer viste, at der var en større forståelse af befolkningsfordeling og kokosmorfologi. AFM-kontakttilstandsbillederne tillod bestemmelse af størrelsen af cocci, som viste en gennemsnitlig bredde på 1,25 mikrometer.Pseudomonas hunanensis viste en homogen fordeling på hele glasstøttefladen og dannede et klæbende monolag. Kulturerne var stangformede med en længde på 1, 9 mikrometer og en bredde på 0, 9 mikrometer. Mikrofortyndingseksponering af magnesiumoxidnanopartikler af Staphylococcus aureus resulterede i tab af en glat overflade og homogene konturer på grund af alvorlig forringelse af cellulær struktur.Vesikeldannelse og frigivelse af cytosolisk materiale blev observeret i kulturer ved højere koncentrationer end MIC. Lignende resultater blev opnået i E. coli-kulturer, hvor kontrollerne viste glatte overflader, der fremhævede dens homogene stavlignende form. Strukturen forsvandt fuldstændigt ved 1.000 PPM nanopartikeleksponering med kun skelnelige silhuetter.Det er vigtigt at udføre prøvefiksering korrekt, da det er vigtigt for yderligere analyse. Billedfilteret hjælper med at give god billedopløsning og eksempeldetaljer. Ved hjælp af fastgørelsesmetoden kan AFM-berøringsfri tilstande anvendes, hvilket kan være nyttigt i undersøgelsen af mekaniske egenskaber.Denne metode kunne være et billigt og nyttigt værktøj til medicinsk og mikrobiologisk forskning med fokus på analyse af bakteriecelleskader.

Research

JoVE Journal

Biology

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Live Cell Response to Mechanical Stimulation Studied by Integrated Optical and Atomic Force Microscopy

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to ...

Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3.  On the macro scale the stiffness of tissues and organs ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Hurtig analyse og udforskningen af ​​fluorescensmikroskopi Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Prøve forberedelse til single virion Atomic Force mikroskopi og superopløsning fluorescens Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Design and Development of Aptamer&#8211;Gold Nanoparticle Based Colorimetric Assays for In-the-field Applications

Design og Udvikling af aptamer-Gold Nanopartikel kolorimetrisk Analyser for In-the-field Applications

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Måling stivheden af<em&gt; Ex vivo</em&gt; Mus Aortas Brug Atomic force mikroskopi

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM)

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy SEM

Forberedelse af prokaryote og eukaryote organismer ved hjælp af kemiske tørring til morfologisk analyse i Scanning elektronmikroskopi (SEM)

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to ...

Rapid, Affordable, and Uncomplicated Production of Bacterial Cell-free Lysate

Hurtig, overkommelig og ukompliceret produktion af bakteriecellefri lysat

Cell-free gene expression offers the power of biology without the complications of a living organism. Although many such gene expression systems exist, ...

Characterizing Mechanical Properties of Primary Cell Wall in Living Plant Organs Using Atomic Force Microscopy

Karakterisering af mekaniske egenskaber ved primær cellevæg i levende planteorganer ved hjælp af atomkraftmikroskopi

The mechanical properties of the primary cell walls determine the direction and rate of plant cell growth and, therefore, the future size and shape of the ...