Name: contact mode atomic force microscopy as a rapid technique for morphological observation and bacterial cell damage analysis
Uploaded: 2023-06-30T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Contact Mode Atomic Force Microscopy as a Rapid Technique for Morphological Observation and Bacterial Cell Damage Analysis at JoVE.com

רמירו מוניז-דיאז מודה ל-CONACyT על המלגה.

1. בידוד וזיהוי חיידקים
<ol><li>בידוד זן אנדופיטי מריסטמים של פקעת שום:<ol><li>הניחו 2 מ"מ של שברי מריסטמים מפקעות שום קלופות, מחוטאות וחתוכות בעבר על אגר סויה טריפטיקייס (TSA) כמצע צמיחה עשיר, ודגרו בטמפרטורה של 25°C למשך יום אחד.</li>
		<li>בהתבסס על ההבדלים המורפולוגיים של מושבות החיידקים - צור...

<ol>
	<li>Koch, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+form+of+the+bacterial+cell+wall.">Growth and form of the bacterial cell wall.</a> American Scientist. 78 (4), 327-341 (1990).</li><li>Si, F., Li, B., Margolin, W., Sun, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+growth+and+form+under+mechanical+compression.">Bacterial growth and form under mechanical compression.</a> Scientific Report. 5, 11367 (2015).</li><li>Pavlova, M. D., Asaturova, A. M., Kozitsyn, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+cell+shape:+Some+features+of+ultrastructure,+evolution,+and+ecology.">Bacterial cell shape: Some features of ultrastructure, evolution, and ecology.</a> Biology Bulletin Reviews. 12, 254-265 (2022).</li><li>Cabeen, M. T., Jacobs-Wagner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+cell+shape.">Bacterial cell shape.</a> Nature Reviews Microbiology. 3 (8), 601-610 (2005).</li><li>Smith, W. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+morphology+drives+spatial+patterning+in+microbial+communities.">Cell morphology drives spatial patterning in microbial communities.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 114 (3), E280-E286 (2017).</li><li>Volke, D. C., Nikel, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+bacteria+in+shape:+Synthetic+morphology+approaches+for+the+design+of+efficient+microbial+cell+factories.">Getting bacteria in shape: Synthetic morphology approaches for the design of efficient microbial cell factories.</a> Advanced Biosystems. 2 (11), 1800111 (2018).</li><li>Mi, L., Ning, X., Lianqing, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peak+force+tapping+atomic+force+microscopy+for+advancing+cell+and+molecular+biology.">Peak force tapping atomic force microscopy for advancing cell and molecular biology.</a> Nanoscale. 13 (18), 8358-8375 (2021).</li><li>Hoffman, C. S., Winston, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ten-minute+DNA+preparation+from+yeast+efficiently+releases+autonomous+plasmids+for+transformation+of+Escherichia+coli.">A ten-minute DNA preparation from yeast efficiently releases autonomous plasmids for transformation of Escherichia coli.</a> Gene. 57 (2-3), 267-272 (1987).</li><li>Weisburg, W. G., Barns, S. M., Pelletier, D. A., Lane, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=16S+ribosomal+DNA+amplification+for+phylogenetic+study.">16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study.</a> Journal of Bacteriology. 173 (2), 697-703 (1991).</li><li>Behr, S., M&#228;tzig, M., Levin, A., Eickhoff, H., Heller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fully+automated+multicapillary+electrophoresis+device+for+DNA+analysis.">A fully automated multicapillary electrophoresis device for DNA analysis.</a> ELECTROPHORESIS. 20 (7), 1492-1507 (1999).</li><li>Seliger, H., Groger, G., Jirikowksi, G., Ortigao, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+methods+for+the+solid-phase+sequence+analysis+of+nucleic+acid+fragments+using+the+Sanger+dideoxy+procedure.">New methods for the solid-phase sequence analysis of nucleic acid fragments using the Sanger dideoxy procedure.</a> Nucleosides &amp; Nucleotides. 9 (3), 383-388 (1990).</li><li>Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+local+alignment+search+tool.">Basic local alignment search tool.</a> Journal of Molecular Biology. 215 (3), 403-410 (1990).</li><li>Stackebrandt, E., Ebers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taxonomic+parameter+revisited:+Tarnished+gold+standards.">Taxonomic parameter revisited: Tarnished gold standards.</a> Microbiology Today. 33, 152-155 (2006).</li><li>Mu&#241;iz Diaz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+triethylamine-based+synthesis+of+MgO+nanoparticles+and+their+antibacterial+effect+against+pathogenic+bacteria.">Two-step triethylamine-based synthesis of MgO nanoparticles and their antibacterial effect against pathogenic bacteria.</a> Nanomaterials. 11 (2), 410 (2021).</li><li>Andrews, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+minimum+inhibitory+concentrations.">Determination of minimum inhibitory concentrations.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 48, 5-16 (2001).</li><li>Sarker, S. D., Nahar, L., Kumarasamy, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtitre+plate-based+antibacterial+assay+incorporating+resazurin+as+an+indicator+of+cell+growth,+and+its+application+in+the+in+vitro+antibacterial+screening+of+phytochemicals.">Microtitre plate-based antibacterial assay incorporating resazurin as an indicator of cell growth, and its application in the in vitro antibacterial screening of phytochemicals.</a> Methods. 42 (4), 321-324 (2007).</li><li>Giesbrecht, P., Kersten, T., Maidhof, H., Wecke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcal+cell+wall:+Morphogenesis+and+fatal+variations+in+the+presence+of+penicillin.">Staphylococcal cell wall: Morphogenesis and fatal variations in the presence of penicillin.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (4), 1371-1414 (1998).</li><li>Yamada, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=autolysin+ring+associated+with+cell+separation+of+Staphylococcus+aureus.">autolysin ring associated with cell separation of Staphylococcus aureus.</a> Journal of Bacteriology. 178 (6), 1565-1571 (1996).</li><li>Zuttion, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anti-adhesive+effect+of+glycoclusters+on+Pseudomonas+aeruginosa+bacteria+adhesion+to+epithelial+cells+studied+by+AFM+single+cell+force+spectroscopy.">The anti-adhesive effect of glycoclusters on Pseudomonas aeruginosa bacteria adhesion to epithelial cells studied by AFM single cell force spectroscopy.</a> Nanoscale. 10 (26), 12771-12778 (2018).</li><li>Kahli, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+growth+conditions+on+Pseudomonas+fluorescens+morphology+characterized+by+atomic+force+microscopy.">Impact of growth conditions on Pseudomonas fluorescens morphology characterized by atomic force microscopy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 23 (17), 9579 (2022).</li><li>Kambli, P., Valavade, A., Kothari, D. C., Kelkar-Mane, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphostructural+changes+induced+in+E.+coli+exposed+to+copper+ions+in+water+at+increasing+concentrations.">Morphostructural changes induced in E. coli exposed to copper ions in water at increasing concentrations.</a> World Journal of Pharmaceutical Research. 4 (10), 837-852 (2015).</li><li>Kochan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+In+vivo+atomic+force+microscopy-infrared+spectroscopy+of+bacteria.">et al. In vivo atomic force microscopy-infrared spectroscopy of bacteria.</a> Journal of the Royal Society Interface. 15, 140 (2018).</li><li>Stoimenov, P. K., Klinger, R. L., Marchin, G. L., Klabunde, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+oxide+nanoparticles+as+bactericidal+agents.">Metal oxide nanoparticles as bactericidal agents.</a> Langmuir. 18, 6679-6686 (2002).</li><li>Lee, H. -. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NaCl+influences+thermal+resistance+and+cell+morphology+of+Escherichia+coli+strains.">NaCl influences thermal resistance and cell morphology of Escherichia coli strains.</a> Journal of Food Safety. 36 (1), 62-68 (2016).</li><li>Song, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibacterial+effects+of+Schisandra+chinensis+extract+on+and+its+application+in+food.">Antibacterial effects of Schisandra chinensis extract on and its application in food.</a> Journal of Food Safety. 38 (5), e12503 (2018).</li><li>Mohamed, W. M., Khallaf, M. F., Hassan, A. A., Elbayoumi, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermotolerance+of+Staphylococcus+aureus+after+sublethal+heat+shock.">Thermotolerance of Staphylococcus aureus after sublethal heat shock.</a> Arab Universities Journal of Agricultural Sciences. 27 (1), 467-477 (2019).</li><li>Shar, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomineralization+of+platinum+by+Escherichia+coli.">Biomineralization of platinum by Escherichia coli.</a> Metals. 9 (4), 407 (2019).</li><li>Baidamshina, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+microbial+biofilms+using+Ficin,+a+nonspecific+plant+protease.">Targeting microbial biofilms using Ficin, a nonspecific plant protease.</a> Scientific Reports. 7, 46068 (2017).</li><li>Ovchinnikova, E. S., vander Mei, H. C., Krom, B. P., Busscher, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exchange+of+adsorbed+serum+proteins+during+adhesion+of+Staphylococcus+aureus+to+an+abiotic+surface+and+Candida+albicans+hyphae-An+AFM+study.">Exchange of adsorbed serum proteins during adhesion of Staphylococcus aureus to an abiotic surface and Candida albicans hyphae-An AFM study.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 110, 45-50 (2013).</li></ol>

מיקרוסקופיה היא טכניקה נפוצה במעבדות ביולוגיות המאפשרת לחקור את המבנה, הגודל, המורפולוגיה והסידור התאי של דגימות ביולוגיות. כדי לשפר טכניקה זו, ניתן להשתמש במספר סוגים של מיקרוסקופים השונים זה מזה מבחינת המאפיינים האופטיים או האלקטרוניים שלהם, הקובעים את כוח הרזולוציה של המכשיר.
<p class="...

צורות חיידקים שונות זוהו לראשונה על ידי אנטוני ואן לוונהוק במאה ה-171. חיידקים קיימים במגוון גדול של צורות מאז ימי קדם, החל מכדוריות ועד תאים מסתעפים2. צורת התא היא תנאי בסיסי עבור טקסונומים חיידקיים לתאר ולסווג כל מין חיידקי, בעיקר עבור ההפרדה המורפולוגית של פילה גראם-חיובי וגרם שליליפילה 3. מספר אלמנטים ידועים כקובעים את צורות התא החיידקי, כולם מעורבים בכיסויי התא ותומכים בהם כמרכיבים של דופן התא וקרום התא, כמו גם בשלד התא. בדרך זו, מדענים עדיין מבהירים את המנגנונים והתהליכים הכימיים, הביוכימיים והפיזיקליים המעורבים בקביעת צורות תאי חיידקים, שכולם מוגדרים על-ידי צבירי גנים המגדירים צורות חיידקים 2,4.
בנוסף, מדענים הראו כי צורת המוט היא ככל הנראה הצורה הקדומה של תאי חיידקים, שכן צורת תא זו נראית אופטימלית בפרמטרים משמעותיים לתא. לפיכך, צורות קוקוס, ספירלה, ויבריו, נימה וצורות אחרות נחשבות כהתאמות לסביבות שונות; ואכן, מורפולוגיות מסוימות התפתחו באופן עצמאי מספר פעמים, מה שמרמז על כך שצורות של חיידקים יכולות להיות התאמות לסביבות מסוימות 3,5. עם זאת, לאורך מחזור החיים של תא החיידק, צורת התא משתנה, וזה קורה גם כתגובה גנטית לתנאי סביבה מזיקים3. צורת תא החיידק וגודלו, קובעים במידה רבה את הנוקשות, החוסן והיחס בין פני השטח לנפח של החיידקים, וניתן לנצל תכונה זו לתהליכים ביוטכנולוגיים6.
מיקרוסקופיה אלקטרונית משמשת לחקר דגימות ביולוגיות בשל ההגדלה הגבוהה שניתן להגיע אליה מעבר למיקרוסקופים מבוססי אור. מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM) ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) הן הטכניקות הנפוצות ביותר למטרה זו; עם זאת, דגימות דורשות כמה טיפולים לפני שהם ממוקמים לתוך החדר של המיקרוסקופ על מנת לקבל תמונות מתאימות. כיסוי זהב על הדגימות נדרש, ואת הזמן המשמש לרכישת התמונה הכוללת לא צריך להיות ארוך מדי. לעומת זאת, מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) היא טכניקה בשימוש נרחב בניתוח משטחים, אך משמשת גם בחקר דגימות ביולוגיות.
ישנם מספר סוגים של מצבי AFM המשמשים בניתוח פני שטח, כגון מצב מגע, מצב ללא מגע או הקשה, מיקרוסקופ כוח מגנטי (MFM), AFM מוליך, מיקרוסקופ כוח פיאזואלקטרי (PFM), הקשה על כוח שיא (PFT), תהודה במגע ועוצמת כוח. כל מצב משמש בניתוח חומרים ומספק מידע שונה על פני השטח של החומרים ותכונותיהם המכניות והפיזיקליות. עם זאת, מצבי AFM מסוימים משמשים לניתוח דגימות ביולוגיות במבחנה, כגון PFT, מכיוון ש- PFT מאפשר קבלת נתונים טופוגרפיים ומכניים על תאים בתווך נוזלי7.
בעבודה זו השתמשנו במצב הבסיסי ביותר הכלול בכל דגם AFM ישן ופשוט – מצב המגע. AFM משתמש בגשושית חדה (בקוטר של כ-<50 ננומטר) כדי לסרוק אזורים שגודלם פחות מ-100 מיקרומטר. הגשושית מיושרת למדגם על מנת לקיים אינטראקציה עם שדות הכוח המשויכים לדגימה. פני השטח נסרקים עם הגשושית כדי לשמור על כוח קבוע. לאחר מכן, תמונה של פני השטח נוצרת על ידי ניטור התנועה של המגן כפי שהוא נע על פני המשטח. המידע שנאסף מספק את התכונות הננו-מכניות של פני השטח, כגון היצמדות, גמישות, צמיגות וגזירה.
במצב מגע AFM, הקנטייבר נסרק על פני הדגימה בסטייה קבועה. זה מאפשר לקבוע את גובה הדגימות (Z), וזה מייצג יתרון על פני טכניקות מיקרוסקופ אלקטרוני אחרות. תוכנת AFM מאפשרת יצירת סריקת תמונה תלת-ממדית על ידי אינטראקציה בין קצה הדגימה למשטח הדגימה, והסטייה של החוד מתואמת לגובה הדגימה באמצעות לייזר וגלאי.
במצב סטטי (מצב מגע) עם כוח קבוע, הפלט מציג שתי תמונות שונות: הגובה (טופוגרפיית z) והסטייה או אות השגיאה. מצב סטטי הוא מצב הדמיה פשוט ובעל ערך, במיוחד עבור דגימות חזקות באוויר שיכולות להתמודד עם העומסים הגבוהים וכוחות הפיתול המופעלים על ידי מצב סטטי. מצב הסטייה או השגיאה מופעל במצב כוח קבוע. עם זאת, תמונת הטופוגרפיה משופרת עוד יותר על ידי הוספת אות ההסטה למבנה פני השטח. במצב זה, אות הסטייה מכונה גם אות השגיאה מכיוון שהסטייה היא פרמטר המשוב; כל התכונות או המורפולוגיה המופיעות בערוץ זה נובעות מה"שגיאה" בלולאת המשוב או, ליתר דיוק, בשל לולאת המשוב הנדרשת כדי לשמור על נקודת סטייה קבועה.
העיצוב הייחודי של AFM הופך אותו לקומפקטי - קטן מספיק כדי להתאים לשולחן - ובו בזמן ברזולוציה גבוהה מספיק כדי לפתור צעדים אטומיים. לציוד AFM יש עלות נמוכה יותר מאשר לציוד למיקרוסקופים אלקטרוניים אחרים, ועלויות התחזוקה מינימליות. המיקרוסקופ אינו דורש מעבדה עם תנאים מיוחדים כמו חדר נקי או חלל מבודד; הוא זקוק רק לשולחן עבודה נטול רטט. עבור AFM, הדגימות אינן צריכות לעבור הכנה משוכללת כמו בטכניקות אחרות (כיסוי זהב, הרזיה); יש לצרף רק דגימה יבשה למחזיק הדגימה.
אנו משתמשים במצב מגע AFM כדי לצפות במורפולוגיות חיידקיות ובהשפעות של NPs. ניתן לצפות באוכלוסייה ובמורפולוגיה התאית של חיידקים המקובעים על תמיכה, כמו גם בנזק התאי המיוצר על ידי ננו-חלקיקים על מיני החיידקים. התמונות המתקבלות על ידי מצב מגע AFM מאשרות כי זהו כלי רב עוצמה ואינו מוגבל על ידי ריאגנטים ופרוצדורות מסובכות, מה שהופך אותו לשיטה פשוטה, מהירה וחסכונית לאפיון חיידקים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AFM EasyScan 2</td>
			<td>NanoSurf</td>
			<td>discontinued</td>
			<td>Measurement Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bacteriological loop</td>
			<td>No aplica</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>instrument for bacterial inoculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BigDye Terminator v3.1</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4337455</td>
			<td>Matrix installation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioedit</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>version 7.2.5</td>
			<td>Sequence alignment editor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cary 60 spectrometer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ceftriazone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>to remove particles that interfere with AFM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ContAI-G Silicon cantilever</td>
			<td>BudgetSensors</td>
			<td>ContAl-G-10</td>
			<td>Measurement Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eosin and methylene blue agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>bacterial culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC 25922</td>
			<td>bacterial strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq Flexi DNA Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M8295</td>
			<td>PCR of 16S rRNA gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microplate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10558295</td>
			<td>for microdilution analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M&#252;ller-Hinton broth</td>
			<td>Merck</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>bacterial culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nutrient agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>bacterial culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nutritious broth</td>
			<td>Merck</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>bacterial culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>growth of bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas hunanensis 9AP</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>isolated from the garlic bulb by CNRG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sanger sequencing</td>
			<td>Macrogen</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>sequencing service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScienceDesk Anti-Vibration workstation</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>slides</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>glass holder for bacterial sample analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staphylococcus aureus</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC 25923</td>
			<td>bacterial strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermalcycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>Veriti-4375786</td>
			<td>PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticasein soy agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>BA-256665</td>
			<td>growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrasonicator</td>
			<td>Cole-Parmer Ultrasonic Processor, 220 VAC</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>for mixing the nanoparticle dilutions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

contact mode atomic force microscopy as a rapid technique for morphological observation and bacterial cell damage analysis

מיקרוסקופ אלקטרונים הוא אחד הכלים הדרושים לאפיון מבנים תאיים. עם זאת, ההליך מסובך ויקר בשל הכנת הדגימה לתצפית. מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) היא טכניקת אפיון שימושית מאוד בשל הרזולוציה הגבוהה שלה בתלת מימד ובשל היעדר כל דרישה למוליכות ואקום ודגימה. AFM יכול לצלם מגוון רחב של דגימות עם טופוגרפיות שונות וסוגים שונים של חומרים. 
AFM מספק מידע טופוגרפי תלת-ממדי ברזולוציה גבוהה מרמת האנגסטרום ועד לסולם המיקרון. שלא כמו מיקרוסקופיה מסורתית, AFM משתמש בגשושית כדי ליצור תמונה של טופוגרפיית פני השטח של דגימה. בפרוטוקול זה, השימוש במיקרוסקופ מסוג זה מוצע לאפיון מורפולוגי ונזק תאי של חיידקים המקובעים על תמיכה. נעשה שימוש בזנים של Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922) ו-Pseudomonas hunanensis (שבודדו מדגימות פקעת שום). בעבודה זו גודלו תאי חיידק בתרבית ספציפית. כדי לצפות בנזק לתאים, Staphylococcus aureus ו- Escherichia coli הודגרו עם ריכוזים שונים של ננו-חלקיקים (NPs). 
טיפה של מתלה חיידקי נקבעה על תומך זכוכית, ותמונות צולמו עם AFM בקני מידה שונים. התמונות שהתקבלו הראו את המאפיינים המורפולוגיים של החיידקים. יתר על כן, באמצעות AFM, ניתן היה לצפות בנזק למבנה התא שנגרם על ידי ההשפעה של NPs. בהתבסס על התמונות שהתקבלו, AFM מגע יכול לשמש כדי לאפיין את המורפולוגיה של תאי חיידקים קבועים על תמיכה. AFM הוא גם כלי מתאים לחקר ההשפעות של NPs על חיידקים. בהשוואה למיקרוסקופ אלקטרונים, AFM היא טכניקה זולה וקלה לשימוש.

תמונות של המורפולוגיה והגודל של הזנים S. aureus ו- P. hunanensis , כמו גם ארגון האוכלוסייה של שני הזנים, צולמו במיקרוסקופ כוח אטומי במצב מגע. התמונות של S. aureus הראו שהאוכלוסייה שלו התפזרה לפי אזורים עם אגרגטים של קוקוס (איור 1A). עם הגידול בקנה המידה, הייתה הערכה גדולה יותר...

Watch this Scientific Journal Video about Contact Mode Atomic Force Microscopy as a Rapid Technique for Morphological Observation and Bacterial Cell Damage Analysis at JoVE.com

Contact Mode Atomic Force Microscopy as a Rapid Technique for Morphological Observation and Bacterial Cell Damage Analysis

כאן אנו מציגים את היישום של מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) כשיטה פשוטה ומהירה לאפיון חיידקים ומנתחים פרטים כגון גודל וצורת החיידקים, ביופילמים של תרבית חיידקים ופעילות ננו-חלקיקים כקוטלי חיידקים.

מצב מגע מיקרוסקופ כוח אטומי כטכניקה מהירה לתצפית מורפולוגית וניתוח נזק לתאי חיידקים

Electron microscopy is one of the tools required to characterize cellular structures. However, the procedure is complicated and expensive due to the ...

פרוטוקול זה מראה את השימוש במיקרוסקופ כוח אטומי במצב מגע כדי לצפות בשינויים במורפולוגיה של התא עקב מחלה או טיפול ספציפיים. מומלץ מאוד להשתמש במיכלים אטומים להליך זה כדי למנוע זיהום ולנתח את המדגם הקבוע בהקדם האפשרי כדי למנוע הזדקנות. התחל על ידי קיבוע הדגימות בשקופית על ידי העברה עדינה של המגלשה מעל להבה מספר פעמים עד שהדגימה יבשה.מניחים את הדגימות הקבועות בצלוחית פטרי ומעבירים אותן לציוד מיקרוסקופ הכוח האטומי לתצפית. לאחר מכן, הפעל את המחשב ואת מיקרוסקופ הכוח האטומי. לאחר מכן בחר את מצב איש הקשר, בדיקות ContAI-G ואפשרויות שיפוע אוטומטי בתוכנה.הגדר את ערכי ברירת המחדל עבור בקר Z על ידי הגדרת נקודת ההגדרה ל- 20 ננומטר, רווח P ב- 10, 000, רווח I ב- 1, 000, רווח D באפס ומתח קצה לאפס מיליוולט. באמצעות ראש טווח סריקה של 70 מיקרומטר, מקם את הדגימות במצב מגע AFM. קבל תצוגה מהירה של פני השטח מתחת לגשושית באמצעות מצלמה המורכבת על שתי עדשות המשולבות בראש הסריקה.עכשיו, בחר את האזור הרצוי על ידי עקירה ידנית אותו במישור XY. אפשר לגשושית להתקרב אלקטרונית למשטח הדגימה עד שתגיע למגע. התאם אלקטרונית את מישור המדידה XY של הסורק ומשטח הדגימה על-ידי הפחתת כיוון שיפוע XY.הגדר את הפרמטרים הסטנדרטיים של התוכנה לקו אחד לשנייה ו 256 נקודות לשורה. לאחר מכן בצע טווח סריקה מלא של שטח של 70 על 70 מיקרומטר. בחרו באזור הקטן יותר בעזרת הכלי זום.בחר אזור חדש מהדגימה על-ידי משיכת המגן באופן אלקטרוני והזזת הדגימה לאורך מישור XY. לאחר מכן בצע סריקה חדשה כפי שהודגם בעבר. לאחר מכן, השתמש בפילוס שורה אחר שורה בתפריט הכלים של התמונה בבחירת המסנן כדי לבצע עיבוד נתונים.מטבו את הגובה המרבי והמינימלי בסרגל הצבע לקבלת רזולוציית התמונה הטובה ביותר. לבסוף, בצע את ניתוח התמונה באמצעות תפריט הניתוח. בחר את הנקודות הראשוניות והסופיות בעזרת הכלי הרצוי כדי לקבוע את האורך והמרחק.ניתוח מיקרוסקופי של כוח אטומי של תרביות החיידקים הראה כי תרביות Staphylococcus aureus התפזרו לפי אזורים עם אגרגטים קוקוס. סולמות מוגברים הראו שיש הערכה גדולה יותר של התפלגות האוכלוסייה ומורפולוגיה של קוקוס. תמונות מצב המגע AFM אפשרו לקבוע את גודל הקוקוס שהראה רוחב ממוצע של 1.25 מיקרומטר.Pseudomonas hunanensis הראה פיזור הומוגני על כל משטח התמיכה בזכוכית ויצר חד-שכבה דבקה. התרביות היו בצורת מוט באורך של 1.9 מיקרומטר וברוחב של 0.9 מיקרומטר. חשיפה לדילול מיקרו של ננו-חלקיקי תחמוצת מגנזיום של סטפילוקוקוס זהוב גרמה לאובדן משטח חלק וקווי מתאר הומוגניים עקב הידרדרות חמורה במבנה התאים.היווצרות שלפוחית ושחרור חומר ציטוסולי נצפו בתרביות בריכוזים גבוהים יותר מאשר המיקרופון. תוצאות דומות התקבלו בתרביות E.coli, כאשר הבקרות הראו משטחים חלקים המדגישים את צורתו ההומוגנית דמוית המוט. המבנה נעלם לחלוטין בחשיפה של 1, 000 PPM לננו-חלקיקים עם צלליות מובחנות בלבד.חשוב לבצע תיקון מדגם כראוי כפי שהוא חיוני לניתוח נוסף. מסנן התמונה מסייע לספק רזולוציית תמונה טובה ופרטים לדוגמה. באמצעות שיטת התיקון, ניתן ליישם מצבי AFM ללא מגע שיכולים להיות מועילים בחקר תכונות מכניות.מתודולוגיה זו יכולה להיות כלי זול ושימושי למחקר רפואי ומיקרוביולוגי המתמקד בניתוח נזק לתאי חיידקים.

Research

JoVE Journal

Biology

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

ניתוח ופיתוח של הפנוטיפ מורפולוגי כפונקציה של ריכוז חלבון שמרים הנצה

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Live Cell Response to Mechanical Stimulation Studied by Integrated Optical and Atomic Force Microscopy

תגובת תא חי כדי גירוי מכני שנלמדה על ידי מיקרוסקופית כוח משולב אופטי אטומית

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to ...

Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

מיקרו מכונות אפיון רקמת הריאה באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3.  On the macro scale the stiffness of tissues and organs ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

ראפיד ניתוח וחקירה של תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

הכנה לדוגמה למיקרוסקופיה של כוח אטומי של Virion יחיד והדמיית פלואורסצנטיות ברזולוציה גבוהה במיוחד

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Design and Development of Aptamer&#8211;Gold Nanoparticle Based Colorimetric Assays for In-the-field Applications

עיצוב ופיתוח של מבוסס Nanoparticle Aptamer-זהב מדד-צבע מבחנים עבור יישומי in-the-השדה

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

מדידת הקשיחות של<em&gt; Ex Vivo</em&gt; עכבר Aortas באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM)

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy SEM

הכנה של אורגניזמים Prokaryotic ו האיקריוטים באמצעות ייבוש כימיים עבור ניתוח מורפולוגי סריקה מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM)

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to ...

Rapid, Affordable, and Uncomplicated Production of Bacterial Cell-free Lysate

ייצור מהיר, זול ולא מסובך של ליסאט נטול תאים חיידקי

Cell-free gene expression offers the power of biology without the complications of a living organism. Although many such gene expression systems exist, ...

Characterizing Mechanical Properties of Primary Cell Wall in Living Plant Organs Using Atomic Force Microscopy

אפיון תכונות מכניות של דופן התא הראשוני באיברים חיים בצמחים באמצעות מיקרוסקופיה של כוח אטומי

The mechanical properties of the primary cell walls determine the direction and rate of plant cell growth and, therefore, the future size and shape of the ...