Name: contact mode atomic force microscopy as a rapid technique for morphological observation and bacterial cell damage analysis
Uploaded: 2023-06-30T13:40:00
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Ramiro Muniz-Diaz ringrazia CONACyT per la borsa di studio.

1. Isolamento batterico e identificazione
<ol><li>Isolamento di un ceppo endofitico dai meristemi del bulbo d'aglio:<ol><li>Posizionare frammenti di meristemi di 2 mm provenienti da bulbi d'aglio precedentemente sbucciati, disinfettati e tagliati su agar di soia tripticasi (TSA) come mezzo di crescita ricco e incubare a 25 °C per 1 giorno.</li>
		<li>Sulla base delle differenze morfologiche delle colonie batteriche - forma, dimensione, colore, bordo, luce trasmessa, luce riflessa, consistenza, consist...

<ol>
	<li>Koch, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+form+of+the+bacterial+cell+wall.">Growth and form of the bacterial cell wall.</a> American Scientist. 78 (4), 327-341 (1990).</li><li>Si, F., Li, B., Margolin, W., Sun, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+growth+and+form+under+mechanical+compression.">Bacterial growth and form under mechanical compression.</a> Scientific Report. 5, 11367 (2015).</li><li>Pavlova, M. D., Asaturova, A. M., Kozitsyn, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+cell+shape:+Some+features+of+ultrastructure,+evolution,+and+ecology.">Bacterial cell shape: Some features of ultrastructure, evolution, and ecology.</a> Biology Bulletin Reviews. 12, 254-265 (2022).</li><li>Cabeen, M. T., Jacobs-Wagner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+cell+shape.">Bacterial cell shape.</a> Nature Reviews Microbiology. 3 (8), 601-610 (2005).</li><li>Smith, W. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+morphology+drives+spatial+patterning+in+microbial+communities.">Cell morphology drives spatial patterning in microbial communities.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 114 (3), E280-E286 (2017).</li><li>Volke, D. C., Nikel, P. 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S., Winston, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ten-minute+DNA+preparation+from+yeast+efficiently+releases+autonomous+plasmids+for+transformation+of+Escherichia+coli.">A ten-minute DNA preparation from yeast efficiently releases autonomous plasmids for transformation of Escherichia coli.</a> Gene. 57 (2-3), 267-272 (1987).</li><li>Weisburg, W. G., Barns, S. M., Pelletier, D. A., Lane, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=16S+ribosomal+DNA+amplification+for+phylogenetic+study.">16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study.</a> Journal of Bacteriology. 173 (2), 697-703 (1991).</li><li>Behr, S., M&#228;tzig, M., Levin, A., Eickhoff, H., Heller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fully+automated+multicapillary+electrophoresis+device+for+DNA+analysis.">A fully automated multicapillary electrophoresis device for DNA analysis.</a> ELECTROPHORESIS. 20 (7), 1492-1507 (1999).</li><li>Seliger, H., Groger, G., Jirikowksi, G., Ortigao, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+methods+for+the+solid-phase+sequence+analysis+of+nucleic+acid+fragments+using+the+Sanger+dideoxy+procedure.">New methods for the solid-phase sequence analysis of nucleic acid fragments using the Sanger dideoxy procedure.</a> Nucleosides &amp; Nucleotides. 9 (3), 383-388 (1990).</li><li>Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+local+alignment+search+tool.">Basic local alignment search tool.</a> Journal of Molecular Biology. 215 (3), 403-410 (1990).</li><li>Stackebrandt, E., Ebers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taxonomic+parameter+revisited:+Tarnished+gold+standards.">Taxonomic parameter revisited: Tarnished gold standards.</a> Microbiology Today. 33, 152-155 (2006).</li><li>Mu&#241;iz Diaz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+triethylamine-based+synthesis+of+MgO+nanoparticles+and+their+antibacterial+effect+against+pathogenic+bacteria.">Two-step triethylamine-based synthesis of MgO nanoparticles and their antibacterial effect against pathogenic bacteria.</a> Nanomaterials. 11 (2), 410 (2021).</li><li>Andrews, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+minimum+inhibitory+concentrations.">Determination of minimum inhibitory concentrations.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 48, 5-16 (2001).</li><li>Sarker, S. D., Nahar, L., Kumarasamy, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtitre+plate-based+antibacterial+assay+incorporating+resazurin+as+an+indicator+of+cell+growth,+and+its+application+in+the+in+vitro+antibacterial+screening+of+phytochemicals.">Microtitre plate-based antibacterial assay incorporating resazurin as an indicator of cell growth, and its application in the in vitro antibacterial screening of phytochemicals.</a> Methods. 42 (4), 321-324 (2007).</li><li>Giesbrecht, P., Kersten, T., Maidhof, H., Wecke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcal+cell+wall:+Morphogenesis+and+fatal+variations+in+the+presence+of+penicillin.">Staphylococcal cell wall: Morphogenesis and fatal variations in the presence of penicillin.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (4), 1371-1414 (1998).</li><li>Yamada, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=autolysin+ring+associated+with+cell+separation+of+Staphylococcus+aureus.">autolysin ring associated with cell separation of Staphylococcus aureus.</a> Journal of Bacteriology. 178 (6), 1565-1571 (1996).</li><li>Zuttion, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anti-adhesive+effect+of+glycoclusters+on+Pseudomonas+aeruginosa+bacteria+adhesion+to+epithelial+cells+studied+by+AFM+single+cell+force+spectroscopy.">The anti-adhesive effect of glycoclusters on Pseudomonas aeruginosa bacteria adhesion to epithelial cells studied by AFM single cell force spectroscopy.</a> Nanoscale. 10 (26), 12771-12778 (2018).</li><li>Kahli, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+growth+conditions+on+Pseudomonas+fluorescens+morphology+characterized+by+atomic+force+microscopy.">Impact of growth conditions on Pseudomonas fluorescens morphology characterized by atomic force microscopy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 23 (17), 9579 (2022).</li><li>Kambli, P., Valavade, A., Kothari, D. C., Kelkar-Mane, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphostructural+changes+induced+in+E.+coli+exposed+to+copper+ions+in+water+at+increasing+concentrations.">Morphostructural changes induced in E. coli exposed to copper ions in water at increasing concentrations.</a> World Journal of Pharmaceutical Research. 4 (10), 837-852 (2015).</li><li>Kochan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+In+vivo+atomic+force+microscopy-infrared+spectroscopy+of+bacteria.">et al. In vivo atomic force microscopy-infrared spectroscopy of bacteria.</a> Journal of the Royal Society Interface. 15, 140 (2018).</li><li>Stoimenov, P. K., Klinger, R. L., Marchin, G. L., Klabunde, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+oxide+nanoparticles+as+bactericidal+agents.">Metal oxide nanoparticles as bactericidal agents.</a> Langmuir. 18, 6679-6686 (2002).</li><li>Lee, H. -. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NaCl+influences+thermal+resistance+and+cell+morphology+of+Escherichia+coli+strains.">NaCl influences thermal resistance and cell morphology of Escherichia coli strains.</a> Journal of Food Safety. 36 (1), 62-68 (2016).</li><li>Song, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibacterial+effects+of+Schisandra+chinensis+extract+on+and+its+application+in+food.">Antibacterial effects of Schisandra chinensis extract on and its application in food.</a> Journal of Food Safety. 38 (5), e12503 (2018).</li><li>Mohamed, W. M., Khallaf, M. F., Hassan, A. A., Elbayoumi, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermotolerance+of+Staphylococcus+aureus+after+sublethal+heat+shock.">Thermotolerance of Staphylococcus aureus after sublethal heat shock.</a> Arab Universities Journal of Agricultural Sciences. 27 (1), 467-477 (2019).</li><li>Shar, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomineralization+of+platinum+by+Escherichia+coli.">Biomineralization of platinum by Escherichia coli.</a> Metals. 9 (4), 407 (2019).</li><li>Baidamshina, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+microbial+biofilms+using+Ficin,+a+nonspecific+plant+protease.">Targeting microbial biofilms using Ficin, a nonspecific plant protease.</a> Scientific Reports. 7, 46068 (2017).</li><li>Ovchinnikova, E. S., vander Mei, H. C., Krom, B. P., Busscher, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exchange+of+adsorbed+serum+proteins+during+adhesion+of+Staphylococcus+aureus+to+an+abiotic+surface+and+Candida+albicans+hyphae-An+AFM+study.">Exchange of adsorbed serum proteins during adhesion of Staphylococcus aureus to an abiotic surface and Candida albicans hyphae-An AFM study.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 110, 45-50 (2013).</li></ol>

La microscopia è una tecnica comunemente usata nei laboratori biologici che consente di studiare la struttura, le dimensioni, la morfologia e la disposizione cellulare dei campioni biologici. Per migliorare questa tecnica, possono essere utilizzati diversi tipi di microscopi che differiscono tra loro in termini di caratteristiche ottiche o elettroniche, che determinano la potenza di risoluzione dello strumento.
Nella ricerca scientifica, l'uso della microscopia è richiesto per la caratterizz...

Diverse forme batteriche sono state notate per la prima volta da Antony van Leeuwenhoek nel 17 ° secolo1. I batteri sono esistiti in una grande diversità di forme fin dai tempi antichi, che vanno dalle sfere alle cellule ramificate2. La forma cellulare è una condizione fondamentale per i tassonomisti batterici per descrivere e classificare ogni specie batterica, principalmente per la separazione morfologica dei phyla gram-positivi e gram-negativi3. Diversi elementi sono noti per determinare le forme cellulari batteriche, che sono tutti coinvolti nelle coperture cellulari e nel supporto come componenti della parete cellulare e della membrana, nonché nel citoscheletro. In questo modo, gli scienziati stanno ancora chiarendo i meccanismi e i processi chimici, biochimici e fisici implicati nella determinazione delle forme cellulari batteriche, che sono tutti definiti da gruppi di geni che definiscono le forme batteriche 2,4.
Inoltre, gli scienziati hanno dimostrato che la forma dell'asta è probabilmente la forma ancestrale delle cellule batteriche, poiché questa forma cellulare appare ottimale nei parametri significativi delle cellule. Pertanto, cocchi, spirale, vibrione, filamentoso e altre forme sono considerati adattamenti a vari ambienti; Infatti, particolari morfologie si sono evolute indipendentemente più volte, suggerendo che le forme dei batteri potrebbero essere adattamenti a particolari ambienti 3,5. Tuttavia, durante tutto il ciclo di vita delle cellule batteriche, la forma della cellula cambia, e questo si verifica anche come risposta genetica a condizioni ambientali dannose3. La forma e le dimensioni delle cellule batteriche determinano fortemente la rigidità, la robustezza e il rapporto superficie-volume dei batteri, e questa caratteristica può essere sfruttata per processi biotecnologici6.
La microscopia elettronica viene utilizzata per studiare campioni biologici a causa dell'elevato ingrandimento che può essere raggiunto oltre i microscopi basati sulla luce. La microscopia elettronica a trasmissione (TEM) e la microscopia elettronica a scansione (SEM) sono le tecniche più comunemente utilizzate per questo scopo; Tuttavia, i campioni richiedono alcuni trattamenti prima di essere inseriti nella camera del microscopio al fine di ottenere immagini appropriate. È necessaria una copertina dorata sui campioni e il tempo utilizzato per l'acquisizione totale dell'immagine non dovrebbe essere troppo lungo. Al contrario, la microscopia a forza atomica (AFM) è una tecnica ampiamente utilizzata nell'analisi delle superfici, ma è anche impiegata nello studio di campioni biologici.
Esistono diversi tipi di modalità AFM utilizzate nell'analisi delle superfici, come la modalità di contatto, la modalità senza contatto o la maschiatura, la microscopia a forza magnetica (MFM), l'AFM conduttivo, la microscopia a forza piezoelettrica (PFM), la maschiatura della forza di picco (PFT), la risonanza di contatto e il volume della forza. Ogni modalità viene utilizzata nell'analisi dei materiali e fornisce informazioni diverse sulla superficie dei materiali e sulle loro proprietà meccaniche e fisiche. Tuttavia, alcune modalità AFM sono utilizzate per l'analisi di campioni biologici in vitro, come PFT, perché PFT consente di ottenere dati topografici e meccanici su cellule in un mezzo liquido7.
In questo lavoro, abbiamo utilizzato la modalità più semplice inclusa in ogni vecchio e semplice modello AFM: la modalità di contatto. AFM utilizza una sonda affilata (circa <50 nm di diametro) per scansionare aree inferiori a 100 μm. La sonda è allineata al campione per interagire con i campi di forza associati al campione. La superficie viene scansionata con la sonda per mantenere costante la forza. Quindi, viene generata un'immagine della superficie monitorando il movimento del cantilever mentre si muove sulla superficie. Le informazioni raccolte forniscono le proprietà nano-meccaniche della superficie, come l'adesione, l'elasticità, la viscosità e il taglio.
Nella modalità di contatto AFM, il cantilever viene scansionato attraverso il campione con una deflessione fissa. Ciò consente di determinare l'altezza dei campioni (Z), e questo rappresenta un vantaggio rispetto alle altre tecniche di microscopio elettronico. Il software AFM consente la generazione di una scansione di immagini 3D mediante l'interazione tra la punta e la superficie del campione e la deflessione della punta è correlata all'altezza del campione attraverso un laser e un rivelatore.
In modalità statica (modalità contatto) con forza costante, l'uscita presenta due immagini diverse: l'altezza (topografia z) e il segnale di deflessione o errore. La modalità statica è una modalità di imaging preziosa e semplice, in particolare per campioni robusti in aria in grado di gestire gli elevati carichi e le forze torsionali esercitate dalla modalità statica. La modalità di deflessione o errore viene azionata in modalità forza costante. Tuttavia, l'immagine topografica viene ulteriormente migliorata aggiungendo il segnale di deflessione alla struttura della superficie. In questa modalità, il segnale di deflessione viene anche definito segnale di errore poiché la deflessione è il parametro di feedback; Qualsiasi caratteristica o morfologia che appare in questo canale è dovuta all'"errore" nel ciclo di feedback o, meglio, al ciclo di feedback richiesto per mantenere un setpoint di deflessione costante.
Il design unico di AFM lo rende compatto - abbastanza piccolo da stare su un tavolo - pur avendo una risoluzione abbastanza alta per risolvere i passaggi atomici. L'apparecchiatura AFM ha un costo inferiore rispetto alle apparecchiature per altri microscopi elettronici e i costi di manutenzione sono minimi. Il microscopio non richiede un laboratorio con condizioni particolari come una camera bianca o uno spazio isolato; Ha solo bisogno di una scrivania priva di vibrazioni. Per l'AFM, i campioni non devono essere sottoposti a una preparazione elaborata come per altre tecniche (copertura dorata, dimagrimento); Solo un campione secco deve essere attaccato al portacampioni.
Utilizziamo la modalità di contatto AFM per osservare le morfologie batteriche e gli effetti delle NP. Si può osservare la popolazione e la morfologia cellulare dei batteri fissati su un supporto, così come il danno cellulare prodotto dalle nanoparticelle sulle specie batteriche. Le immagini ottenute dalla modalità di contatto AFM confermano che si tratta di uno strumento potente e non limitato da reagenti e procedure complicate, rendendolo un metodo semplice, veloce ed economico per la caratterizzazione batterica.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AFM EasyScan 2</td>
			<td>NanoSurf</td>
			<td>discontinued</td>
			<td>Measurement Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bacteriological loop</td>
			<td>No aplica</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>instrument for bacterial inoculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BigDye Terminator v3.1</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4337455</td>
			<td>Matrix installation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioedit</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>version 7.2.5</td>
			<td>Sequence alignment editor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cary 60 spectrometer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ceftriazone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>to remove particles that interfere with AFM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ContAI-G Silicon cantilever</td>
			<td>BudgetSensors</td>
			<td>ContAl-G-10</td>
			<td>Measurement Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eosin and methylene blue agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>bacterial culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC 25922</td>
			<td>bacterial strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq Flexi DNA Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M8295</td>
			<td>PCR of 16S rRNA gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microplate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10558295</td>
			<td>for microdilution analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M&#252;ller-Hinton broth</td>
			<td>Merck</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>bacterial culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nutrient agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>bacterial culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nutritious broth</td>
			<td>Merck</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>bacterial culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>growth of bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas hunanensis 9AP</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>isolated from the garlic bulb by CNRG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sanger sequencing</td>
			<td>Macrogen</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>sequencing service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScienceDesk Anti-Vibration workstation</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>slides</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>glass holder for bacterial sample analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staphylococcus aureus</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC 25923</td>
			<td>bacterial strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermalcycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>Veriti-4375786</td>
			<td>PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticasein soy agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>BA-256665</td>
			<td>growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrasonicator</td>
			<td>Cole-Parmer Ultrasonic Processor, 220 VAC</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>for mixing the nanoparticle dilutions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

contact mode atomic force microscopy as a rapid technique for morphological observation and bacterial cell damage analysis

La microscopia elettronica è uno degli strumenti necessari per caratterizzare le strutture cellulari. Tuttavia, la procedura è complicata e costosa a causa della preparazione del campione per l'osservazione. La microscopia a forza atomica (AFM) è una tecnica di caratterizzazione molto utile grazie alla sua alta risoluzione in tre dimensioni e all'assenza di qualsiasi requisito per il vuoto e la conduttività del campione. AFM può visualizzare un'ampia varietà di campioni con diverse topografie e diversi tipi di materiali. 
AFM fornisce informazioni topografiche 3D ad alta risoluzione dal livello di angstrom alla scala dei micron. A differenza della microscopia tradizionale, AFM utilizza una sonda per generare un'immagine della topografia superficiale di un campione. In questo protocollo, l'uso di questo tipo di microscopia è suggerito per la caratterizzazione morfologica e del danno cellulare di batteri fissati su un supporto. Sono stati utilizzati ceppi di Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922) e Pseudomonas hunanensis (isolati da campioni di bulbo d'aglio). In questo lavoro, le cellule batteriche sono state coltivate in specifici terreni di coltura. Per osservare il danno cellulare, Staphylococcus aureus ed Escherichia coli sono stati incubati con diverse concentrazioni di nanoparticelle (NP). 
Una goccia di sospensione batterica è stata fissata su un supporto di vetro e le immagini sono state scattate con AFM a diverse scale. Le immagini ottenute hanno mostrato le caratteristiche morfologiche dei batteri. Inoltre, utilizzando l'AFM, è stato possibile osservare il danno alla struttura cellulare causato dall'effetto delle NP. Sulla base delle immagini ottenute, l'AFM a contatto può essere utilizzato per caratterizzare la morfologia delle cellule batteriche fissate su un supporto. L'AFM è anche uno strumento adatto per lo studio degli effetti delle NP sui batteri. Rispetto alla microscopia elettronica, l'AFM è una tecnica economica e facile da usare.

Le immagini della morfologia e delle dimensioni dei ceppi di S. aureus e P. hunanensis , così come l'organizzazione della popolazione di entrambi i ceppi, sono state prese mediante microscopia a forza atomica in modalità contatto. Le immagini di S. aureus hanno mostrato che la sua popolazione era distribuita per zone con aggregati di cocchi (Figura 1A). Con l'aumento della scala, c'è stato un maggiore apprezzamento della distribuzione della popolazione e della ...

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Contact Mode Atomic Force Microscopy as a Rapid Technique for Morphological Observation and Bacterial Cell Damage Analysis

Qui, presentiamo l'applicazione della microscopia a forza atomica (AFM) come metodo semplice e veloce per la caratterizzazione batterica e analizziamo dettagli come la dimensione e la forma batterica, i biofilm di coltura batterica e l'attività delle nanoparticelle come battericidi.

Modalità di contatto Microscopia a forza atomica come tecnica rapida per l'osservazione morfologica e l'analisi del danno cellulare batterico

Electron microscopy is one of the tools required to characterize cellular structures. However, the procedure is complicated and expensive due to the ...

Questo protocollo mostra l'uso della microscopia a forza atomica in modalità contatto per osservare i cambiamenti nella morfologia cellulare dovuti a una specifica malattia o trattamento. Si consiglia vivamente di utilizzare contenitori sigillati per questa procedura per evitare la contaminazione e analizzare il campione fisso il prima possibile per evitare l'invecchiamento. Iniziare fissando i campioni sul vetrino passando delicatamente il vetrino su una fiamma più volte fino a quando il campione è asciutto.Posizionare i campioni fissi in una capsula di Petri e trasportarli all'apparecchiatura del microscopio a forza atomica per l'osservazione. Quindi, accendere il computer e il microscopio a forza atomica. Quindi selezionare la modalità di contatto, le sonde ContAI-G e le opzioni di pendenza automatica nel software.Impostare i valori predefiniti per il controller Z impostando il set point a 20 nanometri, il guadagno P a 10.000, il guadagno I a 1.000, il guadagno D a zero e la tensione di punta a zero millivolt. Utilizzando la testa del range di scansione da 70 micrometri, posizionare i campioni in modalità di contatto AFM. Ottenere una rapida visualizzazione della superficie dell'area sotto la sonda utilizzando una telecamera montata su due obiettivi integrati nella testina di scansione.Ora, scegli l'area desiderata spostandola manualmente nel piano XY. Lasciare che la sonda si avvicini elettronicamente alla superficie del campione fino al raggiungimento del contatto. Regolare elettronicamente il piano di misura XY dello scanner e la superficie del campione riducendo la direzione della pendenza XY.Impostare i parametri standard del software su una riga al secondo e 256 punti per linea. Quindi eseguire un intervallo di scansione completo di un'area di 70 per 70 micrometri. Selezionare l'area più piccola utilizzando lo strumento zoom.Selezionare una nuova area dal campione ritraendo elettronicamente il cantilever e spostando il campione lungo il piano XY. Quindi eseguire una nuova scansione come dimostrato in precedenza. Quindi, utilizzare il livellamento riga per riga nel menu degli strumenti dell'immagine nella selezione del filtro per eseguire l'elaborazione dei dati.Ottimizza l'altezza massima e minima nella barra dei colori per ottenere la migliore risoluzione dell'immagine. Infine, eseguire l'analisi dell'immagine utilizzando il menu di analisi. Selezionare i punti iniziali e finali con lo strumento desiderato per determinare la lunghezza e la distanza.L'analisi microscopica a forza atomica delle colture batteriche ha mostrato che le colture di Staphylococcus aureus erano distribuite da zone con aggregati di cocchi. L'aumento delle scale ha mostrato che c'era un maggiore apprezzamento della distribuzione della popolazione e della morfologia dei cocchi. Le immagini della modalità di contatto AFM hanno permesso la determinazione della dimensione dei cocchi che hanno mostrato una larghezza media di 1,25 micrometri.Pseudomonas hunanensis ha mostrato una distribuzione omogenea su tutta la superficie di supporto del vetro formando un monostrato aderente. Le colture erano a forma di bastoncino con una lunghezza di 1,9 micrometri e una larghezza di 0,9 micrometri. L'esposizione alla microdiluizione delle nanoparticelle di ossido di magnesio di Staphylococcus aureus ha comportato la perdita di una superficie liscia e di contorni omogenei a causa del grave deterioramento della struttura cellulare.La formazione di vescicole e il rilascio di materiale citosolico sono stati osservati in colture a concentrazioni più elevate rispetto al MIC. Risultati simili sono stati ottenuti nelle colture di E.coli con i controlli che mostrano superfici lisce che evidenziano la sua forma omogenea a bastoncello. La struttura è completamente scomparsa a 1.000 PPM di esposizione di nanoparticelle con solo sagome distinguibili.È importante eseguire correttamente il fissaggio del campione in quanto è essenziale per ulteriori analisi. Il filtro immagine aiuta a fornire una buona risoluzione dell'immagine e dettagli del campione. Utilizzando il metodo di fissaggio, potrebbero essere applicate modalità senza contatto AFM che possono essere utili nello studio delle proprietà meccaniche.Questa metodologia potrebbe essere uno strumento economico e utile per la ricerca medica e microbiologica incentrata sull'analisi del danno cellulare batterico.

Research

JoVE Journal

Biology

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Ricerca

Biologia

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