Name: contact mode atomic force microscopy as a rapid technique for morphological observation and bacterial cell damage analysis
Uploaded: 2023-06-30T13:40:00
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Ramiro Muniz-Diaz는 장학금에 대해 CONACyT에 감사드립니다.

1. 박테리아 분리 및 식별
<ol><li>마늘 구근 분열 조직으로부터 endophytic 균주의 분리 :<ol><li>이전에 껍질을 벗기고 소독하고 자른 마늘 구근의 분열조직 조각 2mm를 풍부한 성장 배지인 트립티카제 대두 한천(TSA)에 놓고 25°C에서 1일 동안 배양합니다.</li>
		<li>박테리아 군집의 형태학적 차이(모양, 크기, 색상, 가장자리, 투과광, 반사광, 질감, 일관성 및 색소 생성)를 기반으로 관찰된 다?...

<ol>
	<li>Koch, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+form+of+the+bacterial+cell+wall.">Growth and form of the bacterial cell wall.</a> American Scientist. 78 (4), 327-341 (1990).</li><li>Si, F., Li, B., Margolin, W., Sun, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+growth+and+form+under+mechanical+compression.">Bacterial growth and form under mechanical compression.</a> Scientific Report. 5, 11367 (2015).</li><li>Pavlova, M. D., Asaturova, A. M., Kozitsyn, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+cell+shape:+Some+features+of+ultrastructure,+evolution,+and+ecology.">Bacterial cell shape: Some features of ultrastructure, evolution, and ecology.</a> Biology Bulletin Reviews. 12, 254-265 (2022).</li><li>Cabeen, M. T., Jacobs-Wagner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+cell+shape.">Bacterial cell shape.</a> Nature Reviews Microbiology. 3 (8), 601-610 (2005).</li><li>Smith, W. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+morphology+drives+spatial+patterning+in+microbial+communities.">Cell morphology drives spatial patterning in microbial communities.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 114 (3), E280-E286 (2017).</li><li>Volke, D. C., Nikel, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+bacteria+in+shape:+Synthetic+morphology+approaches+for+the+design+of+efficient+microbial+cell+factories.">Getting bacteria in shape: Synthetic morphology approaches for the design of efficient microbial cell factories.</a> Advanced Biosystems. 2 (11), 1800111 (2018).</li><li>Mi, L., Ning, X., Lianqing, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peak+force+tapping+atomic+force+microscopy+for+advancing+cell+and+molecular+biology.">Peak force tapping atomic force microscopy for advancing cell and molecular biology.</a> Nanoscale. 13 (18), 8358-8375 (2021).</li><li>Hoffman, C. S., Winston, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ten-minute+DNA+preparation+from+yeast+efficiently+releases+autonomous+plasmids+for+transformation+of+Escherichia+coli.">A ten-minute DNA preparation from yeast efficiently releases autonomous plasmids for transformation of Escherichia coli.</a> Gene. 57 (2-3), 267-272 (1987).</li><li>Weisburg, W. G., Barns, S. M., Pelletier, D. A., Lane, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=16S+ribosomal+DNA+amplification+for+phylogenetic+study.">16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study.</a> Journal of Bacteriology. 173 (2), 697-703 (1991).</li><li>Behr, S., M&#228;tzig, M., Levin, A., Eickhoff, H., Heller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fully+automated+multicapillary+electrophoresis+device+for+DNA+analysis.">A fully automated multicapillary electrophoresis device for DNA analysis.</a> ELECTROPHORESIS. 20 (7), 1492-1507 (1999).</li><li>Seliger, H., Groger, G., Jirikowksi, G., Ortigao, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+methods+for+the+solid-phase+sequence+analysis+of+nucleic+acid+fragments+using+the+Sanger+dideoxy+procedure.">New methods for the solid-phase sequence analysis of nucleic acid fragments using the Sanger dideoxy procedure.</a> Nucleosides &amp; Nucleotides. 9 (3), 383-388 (1990).</li><li>Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+local+alignment+search+tool.">Basic local alignment search tool.</a> Journal of Molecular Biology. 215 (3), 403-410 (1990).</li><li>Stackebrandt, E., Ebers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taxonomic+parameter+revisited:+Tarnished+gold+standards.">Taxonomic parameter revisited: Tarnished gold standards.</a> Microbiology Today. 33, 152-155 (2006).</li><li>Mu&#241;iz Diaz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+triethylamine-based+synthesis+of+MgO+nanoparticles+and+their+antibacterial+effect+against+pathogenic+bacteria.">Two-step triethylamine-based synthesis of MgO nanoparticles and their antibacterial effect against pathogenic bacteria.</a> Nanomaterials. 11 (2), 410 (2021).</li><li>Andrews, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+minimum+inhibitory+concentrations.">Determination of minimum inhibitory concentrations.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 48, 5-16 (2001).</li><li>Sarker, S. D., Nahar, L., Kumarasamy, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtitre+plate-based+antibacterial+assay+incorporating+resazurin+as+an+indicator+of+cell+growth,+and+its+application+in+the+in+vitro+antibacterial+screening+of+phytochemicals.">Microtitre plate-based antibacterial assay incorporating resazurin as an indicator of cell growth, and its application in the in vitro antibacterial screening of phytochemicals.</a> Methods. 42 (4), 321-324 (2007).</li><li>Giesbrecht, P., Kersten, T., Maidhof, H., Wecke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcal+cell+wall:+Morphogenesis+and+fatal+variations+in+the+presence+of+penicillin.">Staphylococcal cell wall: Morphogenesis and fatal variations in the presence of penicillin.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (4), 1371-1414 (1998).</li><li>Yamada, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=autolysin+ring+associated+with+cell+separation+of+Staphylococcus+aureus.">autolysin ring associated with cell separation of Staphylococcus aureus.</a> Journal of Bacteriology. 178 (6), 1565-1571 (1996).</li><li>Zuttion, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anti-adhesive+effect+of+glycoclusters+on+Pseudomonas+aeruginosa+bacteria+adhesion+to+epithelial+cells+studied+by+AFM+single+cell+force+spectroscopy.">The anti-adhesive effect of glycoclusters on Pseudomonas aeruginosa bacteria adhesion to epithelial cells studied by AFM single cell force spectroscopy.</a> Nanoscale. 10 (26), 12771-12778 (2018).</li><li>Kahli, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+growth+conditions+on+Pseudomonas+fluorescens+morphology+characterized+by+atomic+force+microscopy.">Impact of growth conditions on Pseudomonas fluorescens morphology characterized by atomic force microscopy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 23 (17), 9579 (2022).</li><li>Kambli, P., Valavade, A., Kothari, D. C., Kelkar-Mane, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphostructural+changes+induced+in+E.+coli+exposed+to+copper+ions+in+water+at+increasing+concentrations.">Morphostructural changes induced in E. coli exposed to copper ions in water at increasing concentrations.</a> World Journal of Pharmaceutical Research. 4 (10), 837-852 (2015).</li><li>Kochan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+In+vivo+atomic+force+microscopy-infrared+spectroscopy+of+bacteria.">et al. In vivo atomic force microscopy-infrared spectroscopy of bacteria.</a> Journal of the Royal Society Interface. 15, 140 (2018).</li><li>Stoimenov, P. K., Klinger, R. L., Marchin, G. L., Klabunde, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+oxide+nanoparticles+as+bactericidal+agents.">Metal oxide nanoparticles as bactericidal agents.</a> Langmuir. 18, 6679-6686 (2002).</li><li>Lee, H. -. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NaCl+influences+thermal+resistance+and+cell+morphology+of+Escherichia+coli+strains.">NaCl influences thermal resistance and cell morphology of Escherichia coli strains.</a> Journal of Food Safety. 36 (1), 62-68 (2016).</li><li>Song, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibacterial+effects+of+Schisandra+chinensis+extract+on+and+its+application+in+food.">Antibacterial effects of Schisandra chinensis extract on and its application in food.</a> Journal of Food Safety. 38 (5), e12503 (2018).</li><li>Mohamed, W. M., Khallaf, M. F., Hassan, A. A., Elbayoumi, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermotolerance+of+Staphylococcus+aureus+after+sublethal+heat+shock.">Thermotolerance of Staphylococcus aureus after sublethal heat shock.</a> Arab Universities Journal of Agricultural Sciences. 27 (1), 467-477 (2019).</li><li>Shar, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomineralization+of+platinum+by+Escherichia+coli.">Biomineralization of platinum by Escherichia coli.</a> Metals. 9 (4), 407 (2019).</li><li>Baidamshina, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+microbial+biofilms+using+Ficin,+a+nonspecific+plant+protease.">Targeting microbial biofilms using Ficin, a nonspecific plant protease.</a> Scientific Reports. 7, 46068 (2017).</li><li>Ovchinnikova, E. S., vander Mei, H. C., Krom, B. P., Busscher, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exchange+of+adsorbed+serum+proteins+during+adhesion+of+Staphylococcus+aureus+to+an+abiotic+surface+and+Candida+albicans+hyphae-An+AFM+study.">Exchange of adsorbed serum proteins during adhesion of Staphylococcus aureus to an abiotic surface and Candida albicans hyphae-An AFM study.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 110, 45-50 (2013).</li></ol>

현미경은 생물학적 샘플의 구조, 크기, 형태 및 세포 배열을 조사할 수 있는 생물학적 실험실에서 일반적으로 사용되는 기술입니다. 이 기술을 개선하기 위해 기기의 해상도를 결정하는 광학 또는 전자적 특성 측면에서 서로 다른 여러 유형의 현미경을 사용할 수 있습니다.
과학 연구에서 박테리아 세포의 특성화를 위해서는 현미경 사용이 필요합니다. 예를 들어, 현미경 검?...

다른 박테리아 모양은 17 세기 Antony van Leeuwenhoek에 의해 처음 발견되었습니다1. 박테리아는 고대부터 구체에서 분지 세포에 이르기까지 매우 다양한 형태로 존재해 왔다2. 세포 모양은 박테리아 분류학자들이 각 박테리아 종을 기술하고 분류하기 위한 기본 조건으로, 주로 그람 양성 문과 그람 음성 문3의 형태학적 분리를 위한 것입니다. 박테리아 세포 형태를 결정하는 몇 가지 요소가 알려져 있으며, 이들 모두는 세포 골격뿐만 아니라 세포벽과 막의 구성 요소로서 세포 덮개 및 지지체에 관여합니다. 이런 식으로 과학자들은 박테리아 세포 형태를 결정하는 데 관련된 화학적, 생화학적, 물리적 메커니즘과 과정을 여전히 해명하고 있으며, 이 모든 것은 박테리아 모양을 정의하는 유전자 클러스터에 의해 정의됩니다 2,4.
또한 과학자들은 막대 모양이 박테리아 세포의 조상 형태일 가능성이 있음을 보여주었는데, 이는 이 세포 모양이 세포에 중요한 매개변수에서 최적으로 나타나기 때문입니다. 따라서 cocci, 나선형, vibrio, 필라멘트 및 기타 형태는 다양한 환경에 대한 적응으로 간주됩니다. 실제로, 특정 형태학은 여러 번 독립적으로 진화했으며, 이는 박테리아의 모양이 특정 환경에 적응할 수 있음을 시사합니다 3,5. 그러나 박테리아 세포 수명 주기 동안 세포 모양이 변하며, 이는 또한 유해한 환경 조건에 대한 유전적 반응으로 발생합니다3. 박테리아 세포의 모양과 크기는 박테리아의 강성, 견고성 및 표면 대 부피 비율을 강력하게 결정하며, 이러한 특성은 생명공학 공정에 이용될 수 있다6.
전자 현미경은 광학 기반 현미경을 넘어 도달할 수 있는 고배율로 인해 생물학적 샘플을 연구하는 데 사용됩니다. 투과 전자 현미경 (TEM)과 주사 전자 현미경 (SEM)은 이러한 목적으로 가장 일반적으로 사용되는 기술입니다. 그러나 샘플은 적절한 이미지를 얻기 위해 현미경 챔버에 넣기 전에 몇 가지 처리가 필요합니다. 샘플에 금색 덮개가 필요하며 전체 이미지 획득에 사용되는 시간이 너무 길어서는 안 됩니다. 대조적으로, 원자력 현미경 (AFM)은 표면 분석에 널리 사용되는 기술이지만 생물학적 샘플 연구에도 사용됩니다.
표면 분석에 사용되는 AFM 모드에는 접촉 모드, 비접촉 모드 또는 태핑, 자력 현미경(MFM), 전도성 AFM, 압전 현미경(PFM), 피크 힘 태핑(PFT), 접촉 공진 및 힘 볼륨과 같은 여러 유형이 있습니다. 각 모드는 재료 분석에 사용되며 재료 표면과 기계적 및 물리적 특성에 대한 다양한 정보를 제공합니다. 그러나, 일부 AFM 모드는 PFT와 같은 시험관내 생물학적 샘플의 분석에 사용되는데, 이는 PFT가 액체 배지(7)에서 세포에 대한 지형 및 기계적 데이터를 얻을 수 있게 해주기 때문이다.
이 작업에서는 모든 오래되고 단순한 AFM 모델에 포함된 가장 기본적인 모드인 접촉 모드를 사용했습니다. AFM은 날카로운 프로브(직경 약 <50nm)를 사용하여 100μm 미만의 영역을 스캔합니다. 프로브는 샘플과 관련된 힘장과 상호 작용하기 위해 샘플에 정렬됩니다. 표면을 프로브로 스캔하여 힘을 일정하게 유지합니다. 그런 다음 캔틸레버가 표면을 가로질러 이동할 때 캔틸레버의 움직임을 모니터링하여 표면 이미지가 생성됩니다. 수집된 정보는 접착력, 탄성, 점도 및 전단과 같은 표면의 나노 기계적 특성을 제공합니다.
AFM 접촉 모드에서는 캔틸레버가 고정된 편향으로 샘플 전체에서 스캔됩니다. 이를 통해 샘플(Z)의 높이를 결정할 수 있으며 이는 다른 전자 현미경 기술에 비해 이점을 나타냅니다. AFM 소프트웨어를 사용하면 팁과 샘플 표면 간의 상호 작용을 통해 3D 이미지 스캔을 생성할 수 있으며, 팁 편향은 레이저와 검출기를 통해 샘플 높이와 상관관계가 있습니다.
일정한 힘을 가진 정적 모드(접촉 모드)에서 출력은 높이(z 지형)와 편향 또는 오류 신호라는 두 가지 다른 이미지를 제공합니다. 정적 모드는 특히 정적 모드에서 가해지는 높은 하중과 비틀림을 처리할 수 있는 공기 중의 견고한 샘플에 유용하고 간단한 이미징 모드입니다. 처짐 또는 오류 모드는 일정한 힘 모드에서 작동됩니다. 그러나 지형 이미지는 표면 구조에 편향 신호를 추가하여 더욱 향상됩니다. 이 모드에서 편향 신호는 편향이 피드백 매개변수이기 때문에 오류 신호라고도 합니다. 이 채널에 나타나는 모든 기능 또는 형태는 피드백 루프의 "오류" 때문이거나 일정한 편향 설정값을 유지하는 데 필요한 피드백 루프 때문입니다.
AFM의 독특한 디자인은 탁상에 들어갈 만큼 충분히 작으면서도 원자 단계를 해결할 수 있을 만큼 충분히 높은 해상도를 제공합니다. AFM 장비는 다른 전자 현미경 장비보다 비용이 저렴하고 유지 보수 비용이 최소화됩니다. 현미경은 클린룸이나 격리된 공간과 같은 특별한 조건의 실험실이 필요하지 않습니다. 진동이 없는 책상만 있으면 됩니다. AFM의 경우 샘플은 다른 기술(골드 커버, 슬리밍)과 같이 정교한 준비를 거칠 필요가 없습니다. 건조한 샘플만 샘플 홀더에 부착해야 합니다.
우리는 AFM 접촉 모드를 사용하여 박테리아 형태와 NP의 효과를 관찰합니다. 지지체에 고정된 박테리아의 개체군과 세포 형태뿐만 아니라 박테리아 종에 대한 나노입자에 의해 생성된 세포 손상을 관찰할 수 있습니다. AFM 접촉 모드로 얻은 이미지는 강력한 도구이며 시약 및 복잡한 절차에 의해 제한되지 않아 박테리아 특성 분석을 위한 간단하고 빠르며 경제적인 방법임을 확인합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AFM EasyScan 2</td>
			<td>NanoSurf</td>
			<td>discontinued</td>
			<td>Measurement Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bacteriological loop</td>
			<td>No aplica</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>instrument for bacterial inoculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BigDye Terminator v3.1</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4337455</td>
			<td>Matrix installation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioedit</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>version 7.2.5</td>
			<td>Sequence alignment editor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cary 60 spectrometer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ceftriazone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>to remove particles that interfere with AFM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ContAI-G Silicon cantilever</td>
			<td>BudgetSensors</td>
			<td>ContAl-G-10</td>
			<td>Measurement Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eosin and methylene blue agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>bacterial culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC 25922</td>
			<td>bacterial strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq Flexi DNA Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M8295</td>
			<td>PCR of 16S rRNA gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microplate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10558295</td>
			<td>for microdilution analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M&#252;ller-Hinton broth</td>
			<td>Merck</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>bacterial culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nutrient agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>bacterial culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nutritious broth</td>
			<td>Merck</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>bacterial culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>growth of bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas hunanensis 9AP</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>isolated from the garlic bulb by CNRG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sanger sequencing</td>
			<td>Macrogen</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>sequencing service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScienceDesk Anti-Vibration workstation</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>slides</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>glass holder for bacterial sample analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staphylococcus aureus</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC 25923</td>
			<td>bacterial strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermalcycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>Veriti-4375786</td>
			<td>PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticasein soy agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>BA-256665</td>
			<td>growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrasonicator</td>
			<td>Cole-Parmer Ultrasonic Processor, 220 VAC</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>for mixing the nanoparticle dilutions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

contact mode atomic force microscopy as a rapid technique for morphological observation and bacterial cell damage analysis

전자 현미경은 세포 구조를 특성화하는 데 필요한 도구 중 하나입니다. 그러나 관찰을 위한 샘플 준비로 인해 절차가 복잡하고 비용이 많이 듭니다. 원자력 현미경(AFM)은 3차원의 고분해능과 진공 및 시료 전도도에 대한 요구 사항이 없기 때문에 매우 유용한 특성화 기술입니다. AFM은 다양한 지형과 다양한 유형의 재료를 가진 다양한 샘플을 이미지화할 수 있습니다. 
AFM은 옹스트롬 수준에서 미크론 수준까지 고해상도 3D 지형 정보를 제공합니다. 기존의 현미경과 달리 AFM은 프로브를 사용하여 샘플의 표면 지형 이미지를 생성합니다. 이 프로토콜에서는 지지체에 고정된 박테리아의 형태학적 및 세포 손상 특성 분석을 위해 이러한 유형의 현미경 사용을 제안합니다. 황색포도상구균(Staphylococcus aureus , ATCC 25923), 대장균( Escherichia coli , ATCC 25922) 및 슈도모나스 후나넨시스(Pseudomonas hunanensis )(마늘 구근 샘플에서 분리)의 균주를 사용하였다. 이 연구에서 박테리아 세포는 특정 배양 배지에서 성장했습니다. 세포 손상을 관찰하기 위해 황색포도상구 균과 대장균 을 서로 다른 농도의 나노입자(NP)와 함께 배양했습니다. 
박테리아 현탁액 한 방울을 유리 지지대에 고정하고 AFM으로 이미지를 다른 스케일로 촬영했습니다. 얻어진 이미지는 박테리아의 형태 학적 특성을 보여 주었다. 또한, AFM을 채용하여, NPs의 효과에 의해 야기된 세포 구조의 손상을 관찰할 수 있었다. 얻어진 이미지를 기초로, 접촉 AFM은 지지체에 고정된 박테리아 세포의 형태를 특성화하는 데 사용될 수 있다. AFM은 또한 NP가 박테리아에 미치는 영향을 조사하는 데 적합한 도구입니다. 전자 현미경에 비해 AFM은 저렴하고 사용하기 쉬운 기술입니다.

S. 아우레우스(S. aureus)와 P. 후나넨시스(P. hunanensis) 균주의 형태와 크기, 그리고 두 균주의 개체군 조직의 이미지는 접촉 모드에서 원자력 현미경으로 촬영되었습니다. S. aureus 이미지는 개체군이 구균 응집체가있는 구역별로 분포되어 있음을 보여주었습니다 (그림 1A). 규모가 커짐에 따라 cocci의 개체군 분포와 형태에 대한 인식이 높아졌습니다(<strong clas...

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Contact Mode Atomic Force Microscopy as a Rapid Technique for Morphological Observation and Bacterial Cell Damage Analysis

여기에서는 박테리아 특성 분석을 위한 간단하고 빠른 방법으로 원자력 현미경(AFM)의 적용을 제시하고 박테리아 크기 및 모양, 박테리아 배양 생물막, 살균제로서의 나노 입자의 활성과 같은 세부 사항을 분석합니다.

접촉 모드 형태학적 관찰 및 박테리아 세포 손상 분석을 위한 신속한 기술로서의 원자력 현미경

Electron microscopy is one of the tools required to characterize cellular structures. However, the procedure is complicated and expensive due to the ...

이 프로토콜은 특정 질병이나 치료로 인한 세포 형태의 변화를 관찰하기 위해 접촉 모드 원자력 현미경을 사용하는 것을 보여줍니다. 이 절차에는 오염을 방지하고 노화를 방지하기 위해 가능한 한 빨리 고정된 샘플을 분석하기 위해 밀봉된 용기를 사용하는 것이 좋습니다. 샘플이 마를 때까지 슬라이드를 화염 위에 여러 번 부드럽게 통과시켜 샘플을 슬라이드에 고정하는 것으로 시작합니다.고정된 샘플을 페트리 접시에 넣고 관찰을 위해 원자력 현미경 장비로 운반합니다. 그런 다음 컴퓨터와 원자력 현미경을 켭니다. 그런 다음 소프트웨어에서 접촉 모드, ContAI-G 프로브 및 자동 슬로프 옵션을 선택합니다.설정점을 20나노미터, P 게인을 10, 000, I 게인, D 게인을 0, 팁 전압을 0밀리볼트로 설정하여 Z 컨트롤러의 기본값을 설정합니다. 70마이크로미터 스캔 범위 헤드를 사용하여 샘플을 AFM 접촉 모드로 배치합니다. 스캔 헤드에 통합된 두 개의 렌즈에 장착된 카메라를 사용하여 프로브 아래 영역의 표면을 빠르게 볼 수 있습니다.이제 XY 평면에서 수동으로 이동하여 원하는 영역을 선택합니다. 프로브가 전자적으로 접근하도록 허용amp접촉에 도달할 때까지 표면을 표면. XY 기울기 방향을 줄여 스캐너와 샘플 표면의 XY 측정 평면을 전자적으로 조정합니다.소프트웨어의 표준 매개변수를 초당 한 줄, 한 줄에 256포인트로 설정합니다. 그런 다음 70 x 70 마이크로미터 영역의 전체 스캔 범위를 수행합니다. 확대/축소 도구를 사용하여 더 작은 영역을 선택합니다.캔틸레버를 전자적으로 집어넣고 XY 평면을 따라 샘플을 이동하여 샘플에서 새 영역을 선택합니다. 그런 다음 앞에서 설명한 대로 새 스캔을 수행합니다. 그런 다음 필터 선택에서 이미지의 도구 메뉴에 있는 줄별 평준화를 사용하여 데이터 처리를 수행합니다.색상 막대의 최대 및 최소 높이를 최적화하여 최상의 이미지 해상도를 얻습니다. 마지막으로 분석 메뉴를 사용하여 이미지 분석을 수행합니다. 원하는 도구로 초기점과 끝점을 선택하여 길이와 거리를 결정합니다.박테리아 배양에 대한 원자력 현미경 분석은 황색포도상구균 배양물이 구균 응집체가 있는 구역별로 분포되어 있음을 보여주었습니다. 증가된 척도는 인구 분포와 구균 형태에 대한 더 큰 인식이 있음을 보여주었습니다. AFM 접촉 모드 이미지를 통해 평균 너비가 1.25 마이크로 미터인 구균의 크기를 결정할 수있었습니다.슈도모나스 후나넨시스(Pseudomonas hunanensis)는 접착성 단층을 형성하는 전체 유리 지지체 표면 상에 균질한 분포를 나타내었다. 배양물은 길이 1.9 마이크로미터 및 너비 0.9 마이크로미터를 갖는 막대 형상이었다. 황색포도상구균의 산화마그네슘 나노입자의 미세 희석 노출은 심각한 세포 구조 열화로 인해 매끄러운 표면과 균질한 윤곽의 손실을 초래했습니다.소포 형성 및 세포질 물질 방출은 MIC보다 더 높은 농도의 배양물에서 관찰되었다. E.coli 배양에서도 유사한 결과가 얻어졌으며 대조군은 매끄러운 표면을 보여 균질한 막대 모양 모양을 강조했습니다. 구조는 1, 000 PPM 나노 입자 노출에서 완전히 사라졌으며 구별 가능한 실루엣 만 남았습니다.추가 분석에 필수적이므로 샘플 고정을 올바르게 수행하는 것이 중요합니다. 이미지 필터는 좋은 이미지 해상도와 샘플 세부 정보를 제공하는 데 도움이 됩니다. 고정 방법을 사용하면 AFM 비접촉 모드를 적용할 수 있어 기계적 특성 연구에 도움이 될 수 있습니다.이 방법론은 박테리아 세포 손상 분석에 중점을 둔 의료 및 미생물학 연구에 저렴하고 유용한 도구가 될 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

버딩 효모에서 단백질 농도의 함수로 형태학의 표현형의 발전 분석

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

연구

생물학

Live Cell Response to Mechanical Stimulation Studied by Integrated Optical and Atomic Force Microscopy

기계 자극에 라이브 세포 응답 통합 광학과 원자 힘 현미경에 의해 연구

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to ...

Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

원자 힘 현미경을 사용하여 폐 조직의 미세 기계적 특성

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3.  On the macro scale the stiffness of tissues and organs ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

신속한 분석 및 형광 현미경 이미지의 탐사

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

단일 비리온 원자력 현미경 검사및 초분해성 형광 이미징을 위한 샘플 준비

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Design and Development of Aptamer&#8211;Gold Nanoparticle Based Colorimetric Assays for In-the-field Applications

인 - 더 - 필드 응용 프로그램에 대한 설계 및 앱 타머 - 금 나노 입자 기반 비색 분석법 개발

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

의 강성 측정<em&gt; 전의 VIVO</em원자 힘 현미경을 사용하여&gt; 마우스 대동맥

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM)

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy SEM

스캐닝 전자 현미경 (SEM)에서 형태소 분석에 대 한 화학 건조를 사용 하 여 간결한 진 핵 유기 체의 준비

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to ...

Rapid, Affordable, and Uncomplicated Production of Bacterial Cell-free Lysate

세균 세포 없는 Lysate의 신속하고 저렴하며 단순한 생산

Cell-free gene expression offers the power of biology without the complications of a living organism. Although many such gene expression systems exist, ...

Characterizing Mechanical Properties of Primary Cell Wall in Living Plant Organs Using Atomic Force Microscopy

원자력 현미경을 사용한 살아있는 식물 장기의 일차 세포벽의 기계적 특성 특성 분석

The mechanical properties of the primary cell walls determine the direction and rate of plant cell growth and, therefore, the future size and shape of the ...