Name: contact mode atomic force microscopy as a rapid technique for morphological observation and bacterial cell damage analysis
Uploaded: 2023-06-30T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Contact Mode Atomic Force Microscopy as a Rapid Technique for Morphological Observation and Bacterial Cell Damage Analysis at JoVE.com

Ramiro Muniz-Diaz takker CONACyT for stipendet.

1. Bakteriell isolasjon og identifikasjon
<ol><li>Isolering av en endofytisk stamme fra hvitløkspære meristems:<ol><li>Legg 2 mm fragmenter av meristemer fra tidligere skrellet, desinfisert og kuttet hvitløksløk på trypticase soyaagar (TSA) som et rikt vekstmedium, og rug ved 25 °C i 1 dag.</li>
		<li>Basert på de morfologiske forskjellene i bakteriekoloniene - form, størrelse, farge, kant, overført lys, reflektert lys, tekstur, konsistens og pigmentproduksjon - beskriver de forskjellige obser...

<ol>
	<li>Koch, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+form+of+the+bacterial+cell+wall.">Growth and form of the bacterial cell wall.</a> American Scientist. 78 (4), 327-341 (1990).</li><li>Si, F., Li, B., Margolin, W., Sun, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+growth+and+form+under+mechanical+compression.">Bacterial growth and form under mechanical compression.</a> Scientific Report. 5, 11367 (2015).</li><li>Pavlova, M. D., Asaturova, A. M., Kozitsyn, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+cell+shape:+Some+features+of+ultrastructure,+evolution,+and+ecology.">Bacterial cell shape: Some features of ultrastructure, evolution, and ecology.</a> Biology Bulletin Reviews. 12, 254-265 (2022).</li><li>Cabeen, M. T., Jacobs-Wagner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+cell+shape.">Bacterial cell shape.</a> Nature Reviews Microbiology. 3 (8), 601-610 (2005).</li><li>Smith, W. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+morphology+drives+spatial+patterning+in+microbial+communities.">Cell morphology drives spatial patterning in microbial communities.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 114 (3), E280-E286 (2017).</li><li>Volke, D. C., Nikel, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+bacteria+in+shape:+Synthetic+morphology+approaches+for+the+design+of+efficient+microbial+cell+factories.">Getting bacteria in shape: Synthetic morphology approaches for the design of efficient microbial cell factories.</a> Advanced Biosystems. 2 (11), 1800111 (2018).</li><li>Mi, L., Ning, X., Lianqing, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peak+force+tapping+atomic+force+microscopy+for+advancing+cell+and+molecular+biology.">Peak force tapping atomic force microscopy for advancing cell and molecular biology.</a> Nanoscale. 13 (18), 8358-8375 (2021).</li><li>Hoffman, C. S., Winston, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ten-minute+DNA+preparation+from+yeast+efficiently+releases+autonomous+plasmids+for+transformation+of+Escherichia+coli.">A ten-minute DNA preparation from yeast efficiently releases autonomous plasmids for transformation of Escherichia coli.</a> Gene. 57 (2-3), 267-272 (1987).</li><li>Weisburg, W. G., Barns, S. M., Pelletier, D. A., Lane, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=16S+ribosomal+DNA+amplification+for+phylogenetic+study.">16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study.</a> Journal of Bacteriology. 173 (2), 697-703 (1991).</li><li>Behr, S., M&#228;tzig, M., Levin, A., Eickhoff, H., Heller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fully+automated+multicapillary+electrophoresis+device+for+DNA+analysis.">A fully automated multicapillary electrophoresis device for DNA analysis.</a> ELECTROPHORESIS. 20 (7), 1492-1507 (1999).</li><li>Seliger, H., Groger, G., Jirikowksi, G., Ortigao, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+methods+for+the+solid-phase+sequence+analysis+of+nucleic+acid+fragments+using+the+Sanger+dideoxy+procedure.">New methods for the solid-phase sequence analysis of nucleic acid fragments using the Sanger dideoxy procedure.</a> Nucleosides &amp; Nucleotides. 9 (3), 383-388 (1990).</li><li>Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+local+alignment+search+tool.">Basic local alignment search tool.</a> Journal of Molecular Biology. 215 (3), 403-410 (1990).</li><li>Stackebrandt, E., Ebers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taxonomic+parameter+revisited:+Tarnished+gold+standards.">Taxonomic parameter revisited: Tarnished gold standards.</a> Microbiology Today. 33, 152-155 (2006).</li><li>Mu&#241;iz Diaz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+triethylamine-based+synthesis+of+MgO+nanoparticles+and+their+antibacterial+effect+against+pathogenic+bacteria.">Two-step triethylamine-based synthesis of MgO nanoparticles and their antibacterial effect against pathogenic bacteria.</a> Nanomaterials. 11 (2), 410 (2021).</li><li>Andrews, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+minimum+inhibitory+concentrations.">Determination of minimum inhibitory concentrations.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 48, 5-16 (2001).</li><li>Sarker, S. D., Nahar, L., Kumarasamy, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtitre+plate-based+antibacterial+assay+incorporating+resazurin+as+an+indicator+of+cell+growth,+and+its+application+in+the+in+vitro+antibacterial+screening+of+phytochemicals.">Microtitre plate-based antibacterial assay incorporating resazurin as an indicator of cell growth, and its application in the in vitro antibacterial screening of phytochemicals.</a> Methods. 42 (4), 321-324 (2007).</li><li>Giesbrecht, P., Kersten, T., Maidhof, H., Wecke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcal+cell+wall:+Morphogenesis+and+fatal+variations+in+the+presence+of+penicillin.">Staphylococcal cell wall: Morphogenesis and fatal variations in the presence of penicillin.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (4), 1371-1414 (1998).</li><li>Yamada, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=autolysin+ring+associated+with+cell+separation+of+Staphylococcus+aureus.">autolysin ring associated with cell separation of Staphylococcus aureus.</a> Journal of Bacteriology. 178 (6), 1565-1571 (1996).</li><li>Zuttion, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anti-adhesive+effect+of+glycoclusters+on+Pseudomonas+aeruginosa+bacteria+adhesion+to+epithelial+cells+studied+by+AFM+single+cell+force+spectroscopy.">The anti-adhesive effect of glycoclusters on Pseudomonas aeruginosa bacteria adhesion to epithelial cells studied by AFM single cell force spectroscopy.</a> Nanoscale. 10 (26), 12771-12778 (2018).</li><li>Kahli, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+growth+conditions+on+Pseudomonas+fluorescens+morphology+characterized+by+atomic+force+microscopy.">Impact of growth conditions on Pseudomonas fluorescens morphology characterized by atomic force microscopy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 23 (17), 9579 (2022).</li><li>Kambli, P., Valavade, A., Kothari, D. C., Kelkar-Mane, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphostructural+changes+induced+in+E.+coli+exposed+to+copper+ions+in+water+at+increasing+concentrations.">Morphostructural changes induced in E. coli exposed to copper ions in water at increasing concentrations.</a> World Journal of Pharmaceutical Research. 4 (10), 837-852 (2015).</li><li>Kochan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+In+vivo+atomic+force+microscopy-infrared+spectroscopy+of+bacteria.">et al. In vivo atomic force microscopy-infrared spectroscopy of bacteria.</a> Journal of the Royal Society Interface. 15, 140 (2018).</li><li>Stoimenov, P. K., Klinger, R. L., Marchin, G. L., Klabunde, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+oxide+nanoparticles+as+bactericidal+agents.">Metal oxide nanoparticles as bactericidal agents.</a> Langmuir. 18, 6679-6686 (2002).</li><li>Lee, H. -. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NaCl+influences+thermal+resistance+and+cell+morphology+of+Escherichia+coli+strains.">NaCl influences thermal resistance and cell morphology of Escherichia coli strains.</a> Journal of Food Safety. 36 (1), 62-68 (2016).</li><li>Song, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibacterial+effects+of+Schisandra+chinensis+extract+on+and+its+application+in+food.">Antibacterial effects of Schisandra chinensis extract on and its application in food.</a> Journal of Food Safety. 38 (5), e12503 (2018).</li><li>Mohamed, W. M., Khallaf, M. F., Hassan, A. A., Elbayoumi, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermotolerance+of+Staphylococcus+aureus+after+sublethal+heat+shock.">Thermotolerance of Staphylococcus aureus after sublethal heat shock.</a> Arab Universities Journal of Agricultural Sciences. 27 (1), 467-477 (2019).</li><li>Shar, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomineralization+of+platinum+by+Escherichia+coli.">Biomineralization of platinum by Escherichia coli.</a> Metals. 9 (4), 407 (2019).</li><li>Baidamshina, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+microbial+biofilms+using+Ficin,+a+nonspecific+plant+protease.">Targeting microbial biofilms using Ficin, a nonspecific plant protease.</a> Scientific Reports. 7, 46068 (2017).</li><li>Ovchinnikova, E. S., vander Mei, H. C., Krom, B. P., Busscher, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exchange+of+adsorbed+serum+proteins+during+adhesion+of+Staphylococcus+aureus+to+an+abiotic+surface+and+Candida+albicans+hyphae-An+AFM+study.">Exchange of adsorbed serum proteins during adhesion of Staphylococcus aureus to an abiotic surface and Candida albicans hyphae-An AFM study.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 110, 45-50 (2013).</li></ol>

Mikroskopi er en teknikk som vanligvis brukes i biologiske laboratorier som muliggjør undersøkelse av struktur, størrelse, morfologi og cellulær arrangement av biologiske prøver. For å forbedre denne teknikken kan flere typer mikroskoper brukes som avviger fra hverandre når det gjelder deres optiske eller elektroniske egenskaper, som bestemmer instrumentets oppløsningskraft.
I vitenskapelig forskning er bruk av mikroskopi nødvendig for karakterisering av bakterieceller; for eksempel h...

Ulike bakterieformer ble først notert av Antony van Leeuwenhoek i det 17. århundre1. Bakterier har eksistert i et stort mangfold av former siden antikken, alt fra kuler til forgreningsceller2. Celleform er en grunnleggende betingelse for bakterielle taksonomer for å beskrive og klassifisere hver bakterieart, hovedsakelig for morfologisk separasjon av gram-positiv og gram-negativ phyla3. Flere elementer er kjent for å bestemme bakterielle celleformer, som alle er involvert i celledekslene og støtten som komponenter i celleveggen og membranen, så vel som i cytoskelettet. På denne måten belyser forskere fortsatt de kjemiske, biokjemiske og fysiske mekanismene og prosessene som er involvert i å bestemme bakterielle celleformer, som alle er definert av klynger av gener som definerer bakterieformer 2,4.
I tillegg har forskere vist at stavformen sannsynligvis er den forfedre formen av bakterieceller, siden denne celleformen ser ut til å være optimal i cellesignifikante parametere. Dermed betraktes kokker, spiral, vibrio, trådformede og andre former som tilpasninger til ulike miljøer; Faktisk har spesielle morfologier utviklet seg uavhengig flere ganger, noe som tyder på at bakteriens former kan tilpasses bestemte miljøer 3,5. Men gjennom bakteriecellens livssyklus endres celleformen, og dette skjer også som en genetisk respons på skadelige miljøforhold3. Bakteriecellenes form og størrelse bestemmer sterkt bakterienes stivhet, robusthet og overflate-til-volum-forhold, og denne egenskapen kan utnyttes for bioteknologiske prosesser6.
Elektronisk mikroskopi brukes til å studere biologiske prøver på grunn av den høye forstørrelsen som kan nås utover lysbaserte mikroskoper. Transmisjonselektronmikroskopi (TEM) og scanning elektronmikroskopi (SEM) er de mest brukte teknikkene for dette formålet; Imidlertid krever prøver noen behandlinger før de plasseres i mikroskopets kammer for å oppnå passende bilder. Et gulldeksel på prøvene er nødvendig, og tiden som brukes til total bildeinnsamling bør ikke være for lang. I motsetning til dette er atomkraftmikroskopi (AFM) en teknikk som er mye brukt i analysen av overflater, men er også ansatt i studiet av biologiske prøver.
Det finnes flere typer AFM-moduser som brukes i overflateanalyse, for eksempel kontaktmodus, ikke-kontaktmodus eller tapping, magnetisk kraftmikroskopi (MFM), ledende AFM, piezoelektrisk kraftmikroskopi (PFM), peak force tapping (PFT), kontaktresonans og kraftvolum. Hver modus brukes i analysen av materialer og gir forskjellig informasjon om overflaten av materialene og deres mekaniske og fysiske egenskaper. Imidlertid brukes noen AFM-moduser til analyse av biologiske prøver in vitro, for eksempel PFT, fordi PFT tillater å oppnå topografiske og mekaniske data på celler i et flytende medium7.
I dette arbeidet brukte vi den mest grunnleggende modusen som er inkludert i hver gammel og enkel AFM-modell - kontaktmodusen. AFM bruker en skarp sonde (rundt <50 nm i diameter) for å skanne områder mindre enn 100 μm. Sonden er justert til prøven for å samhandle med kraftfeltene som er knyttet til prøven. Overflaten skannes med sonden for å holde kraften konstant. Deretter genereres et bilde av overflaten ved å overvåke utkragingens bevegelse når den beveger seg over overflaten. Den innsamlede informasjonen gir overflatenes nanomekaniske egenskaper, for eksempel vedheft, elastisitet, viskositet og skjær.
I AFM-kontaktmodus skannes utkrageren over prøven ved en fast avbøyning. Dette gjør at man kan bestemme høyden på prøvene (Z), og dette representerer en fordel i forhold til de andre elektroniske mikroskopteknikkene. AFM-programvaren tillater generering av en 3D-bildeskanning ved samspillet mellom spissen og prøveoverflaten, og spissavbøyningen er korrelert med prøvens høyde gjennom en laser og en detektor.
I statisk modus (kontaktmodus) med konstant kraft presenterer utgangen to forskjellige bilder: høyden (z-topografien) og avbøyningen eller feilsignalet. Statisk modus er en verdifull, enkel avbildningsmodus, spesielt for robuste prøver i luft som kan håndtere de høye belastningene og vridningskreftene som utøves av statisk modus. Avbøynings- eller feilmodus drives i konstant kraftmodus. Imidlertid forbedres topografibildet ytterligere ved å legge til avbøyningssignalet til overflatestrukturen. I denne modusen blir avbøyningssignalet også referert til som feilsignalet ettersom avbøyningen er tilbakemeldingsparameteren; Eventuelle funksjoner eller morfologi som vises i denne kanalen, skyldes "feilen" i tilbakemeldingssløyfen, eller rettere sagt på grunn av tilbakemeldingssløyfen som kreves for å opprettholde et konstant avbøyningssettpunkt.
AFMs unike design gjør den kompakt - liten nok til å passe på en bordplate - samtidig som den har høy nok oppløsning til å løse atomtrinn. AFM-utstyret har en lavere kostnad enn utstyret til andre elektroniske mikroskoper, og vedlikeholdskostnadene er minimale. Mikroskopet krever ikke et laboratorium med spesielle forhold som et rent rom eller et isolert rom; Den trenger bare et vibrasjonsfritt skrivebord. For AFM trenger prøvene ikke å gjennomgå forseggjort forberedelse som for andre teknikker (gulldeksel, slanking); Bare en tørr prøve må festes til prøveholderen.
Vi bruker AFM-kontaktmodus for å observere bakterielle morfologier og effekten av NP. Populasjonen og cellulær morfologi av bakterier festet på en støtte kan observeres, samt den cellulære skaden som produseres av nanopartikler på bakterieartene. Bildene oppnådd av AFM-kontaktmodus bekrefter at det er et kraftig verktøy og ikke er begrenset av reagenser og kompliserte prosedyrer, noe som gjør det til en enkel, rask og økonomisk metode for bakteriell karakterisering.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AFM EasyScan 2</td>
			<td>NanoSurf</td>
			<td>discontinued</td>
			<td>Measurement Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bacteriological loop</td>
			<td>No aplica</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>instrument for bacterial inoculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BigDye Terminator v3.1</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4337455</td>
			<td>Matrix installation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioedit</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>version 7.2.5</td>
			<td>Sequence alignment editor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cary 60 spectrometer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ceftriazone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>to remove particles that interfere with AFM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ContAI-G Silicon cantilever</td>
			<td>BudgetSensors</td>
			<td>ContAl-G-10</td>
			<td>Measurement Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eosin and methylene blue agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>bacterial culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC 25922</td>
			<td>bacterial strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq Flexi DNA Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M8295</td>
			<td>PCR of 16S rRNA gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microplate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10558295</td>
			<td>for microdilution analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M&#252;ller-Hinton broth</td>
			<td>Merck</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>bacterial culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nutrient agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>bacterial culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nutritious broth</td>
			<td>Merck</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>bacterial culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>growth of bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas hunanensis 9AP</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>isolated from the garlic bulb by CNRG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sanger sequencing</td>
			<td>Macrogen</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>sequencing service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScienceDesk Anti-Vibration workstation</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>slides</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>glass holder for bacterial sample analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staphylococcus aureus</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC 25923</td>
			<td>bacterial strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermalcycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>Veriti-4375786</td>
			<td>PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticasein soy agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>BA-256665</td>
			<td>growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrasonicator</td>
			<td>Cole-Parmer Ultrasonic Processor, 220 VAC</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>for mixing the nanoparticle dilutions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

contact mode atomic force microscopy as a rapid technique for morphological observation and bacterial cell damage analysis

Elektronmikroskopi er et av verktøyene som kreves for å karakterisere cellulære strukturer. Prosedyren er imidlertid komplisert og kostbar på grunn av prøveforberedelsen for observasjon. Atomkraftmikroskopi (AFM) er en svært nyttig karakteriseringsteknikk på grunn av sin høye oppløsning i tre dimensjoner og på grunn av fraværet av krav til vakuum og prøveledningsevne. AFM kan avbilde et bredt utvalg av prøver med forskjellige topografier og forskjellige typer materialer. 
AFM gir høyoppløselig 3D-topografiinformasjon fra angstromnivå til mikronskala. I motsetning til tradisjonell mikroskopi bruker AFM en sonde for å generere et bilde av overflatetopografien til en prøve. I denne protokollen foreslås bruk av denne typen mikroskopi for morfologisk og celleskadekarakterisering av bakterier festet på en støtte. Stammer av Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922) og Pseudomonas hunanensis (isolert fra hvitløkspæreprøver) ble brukt. I dette arbeidet ble bakterieceller dyrket i bestemte kulturmedier. For å observere celleskader ble Staphylococcus aureus og Escherichia coli inkubert med forskjellige konsentrasjoner av nanopartikler (NP). 
En dråpe bakteriell suspensjon ble festet på en glassstøtte, og bilder ble tatt med AFM i forskjellige skalaer. De oppnådde bildene viste bakteriens morfologiske egenskaper. Videre, ved bruk av AFM, var det mulig å observere skaden på den cellulære strukturen forårsaket av effekten av NP. Basert på bildene som er oppnådd, kan kontakt AFM brukes til å karakterisere morfologien til bakterielle celler festet på en støtte. AFM er også et egnet verktøy for undersøkelse av effekten av NP på bakterier. Sammenlignet med elektronmikroskopi er AFM en billig og brukervennlig teknikk.

Bilder av morfologien og størrelsen på S. aureus og P. hunanensis-stammer , samt populasjonsorganisasjonen av begge stammer, ble tatt ved atomkraftmikroskopi i kontaktmodus.  S. aureus-bildene viste at populasjonen var fordelt etter soner med aggregater av kokker (figur 1A). Med en økning i skala var det en større forståelse av populasjonsfordelingen og morfologien til kokkene (figur 1B). Mikroskopirapportene viste at en pseudo-h...

Watch this Scientific Journal Video about Contact Mode Atomic Force Microscopy as a Rapid Technique for Morphological Observation and Bacterial Cell Damage Analysis at JoVE.com

Contact Mode Atomic Force Microscopy as a Rapid Technique for Morphological Observation and Bacterial Cell Damage Analysis

Her presenterer vi anvendelsen av atomkraftmikroskopi (AFM) som en enkel og rask metode for bakteriell karakterisering og analyserer detaljer som bakteriestørrelse og form, bakteriekulturbiofilm og aktiviteten til nanopartikler som bakteriedrepende midler.

Kontaktmodus Atomkraftmikroskopi som en rask teknikk for morfologisk observasjon og bakteriell celleskadeanalyse

Electron microscopy is one of the tools required to characterize cellular structures. However, the procedure is complicated and expensive due to the ...

Denne protokollen viser bruk av kontaktmodus atomkraftmikroskopi for å observere endringer i cellemorfologi på grunn av en bestemt sykdom eller behandling. Det anbefales sterkt å bruke forseglede beholdere for denne prosedyren for å unngå forurensning og analysere den faste prøven så snart som mulig for å unngå aldring. Begynn med å feste prøvene på lysbildet ved å forsiktig føre lysbildet over en flamme flere ganger til prøven er tørr.Plasser de faste prøvene i en petriskål og transporter dem til atomkraftmikroskoputstyret for observasjon. Deretter slår du på datamaskinen og atomkraftmikroskopet. Velg deretter kontaktmodus, ContAI-G-sonder og automatisk hellingsalternativer i programvaren.Sett standardverdiene for Z-kontrolleren ved å sette settpunktet til 20 nanometer, P-gevinst ved 10.000, jeg får ved 1.000, D-gevinst ved null og spissspenning til null millivolt. Bruk hodet til 70 mikrometer skanneområde til å plassere prøvene i AFM-kontaktmodus. Få en rask oversikt over overflaten av området under sonden ved å bruke et kamera montert på to linser integrert i skannehodet.Velg nå ønsket område ved å forskyve det manuelt i XY-planet. La sonden nærme seg prøveoverflaten elektronisk til kontakt er nådd. Juster XY-måleplanet til skanneren og prøveoverflaten elektronisk ved å redusere XY-hellingsretningen.Sett standardparametrene til programvaren til en linje per sekund og 256 poeng per linje. Utfør deretter et fullstendig skanneområde på et område på 70 x 70 mikrometer. Velg det mindre området ved hjelp av zoomverktøyet.Velg et nytt område fra prøven ved å trekke utkragingen elektronisk og flytte prøven langs XY-planet. Utfør deretter en ny skanning som vist før. Deretter bruker du linjeutjevning i verktøymenyen til bildet i filtervalget for å utføre databehandling.Optimaliser maksimums- og minimumshøyden i fargelinjen for å oppnå best mulig bildeoppløsning. Til slutt utfører du bildeanalysen ved hjelp av analysemenyen. Velg start- og sluttpunktene med ønsket verktøy for å bestemme lengden og avstanden.Atomkraftmikroskopisk analyse av bakteriekulturene viste at Staphylococcus aureus-kulturene var fordelt på soner med kokosaggregater. Økte skalaer viste at det var større forståelse for befolkningsfordeling og kokkemorfologi. AFM-kontaktmodusbildene tillot bestemmelse av størrelsen på kokkene, som viste en gjennomsnittlig bredde på 1, 25 mikrometer.Pseudomonas hunanensis viste en homogen fordeling på hele glassbæreflaten og dannet et adherent monosjikt. Kulturene var stavformede med en lengde på 1,9 mikrometer og en bredde på 0,9 mikrometer. Mikrofortynningseksponering av magnesiumoksid nanopartikler av Staphylococcus aureus resulterte i tap av en glatt overflate og homogene konturer på grunn av alvorlig cellulær strukturforringelse.Vesikkeldannelse og frigjøring av cytosolisk materiale ble observert i kulturer ved høyere konsentrasjoner enn MIC. Lignende resultater ble oppnådd i E.coli-kulturer med kontrollene som viste glatte overflater som fremhevet dens homogene stavlignende form. Strukturen forsvant helt ved 1.000 ppm nanopartikkeleksponering med bare gjenkjennelige silhuetter.Det er viktig å utføre prøvefiksering riktig, da det er viktig for videre analyse. Bildefilteret bidrar til å gi god bildeoppløsning og eksempeldetaljer. Ved hjelp av fikseringsmetoden kan AFM ikke-kontaktmodus brukes, noe som kan være nyttig i studiet av mekaniske egenskaper.Denne metodikken kan være et billig og nyttig verktøy for medisinsk og mikrobiologisk forskning fokusert på bakteriell celleskadeanalyse.

Research

JoVE Journal

Biology

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Live Cell Response to Mechanical Stimulation Studied by Integrated Optical and Atomic Force Microscopy

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to ...

Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3.  On the macro scale the stiffness of tissues and organs ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Rapid Analyse og Utforskning av fluorescens mikros Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Prøvepreparering for mikroskopi av enkeltvirionakroskopi og superoppløselig fluorescensavbildning

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Design and Development of Aptamer&#8211;Gold Nanoparticle Based Colorimetric Assays for In-the-field Applications

Design og utvikling av Aptamer-gull nanopartikkel-basert kolo Analyser for In-the-feltet Applications

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Måle Stivhet<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mus Aorta Bruke Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM)

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy SEM

Utarbeidelse av Prokaryotic og Eukaryotic organismer med kjemiske tørking for morfologisk analyse skanning elektronmikroskop (SEM)

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to ...

Rapid, Affordable, and Uncomplicated Production of Bacterial Cell-free Lysate

Rask, rimelig og ukomplisert produksjon av bakteriell cellefri lysat

Cell-free gene expression offers the power of biology without the complications of a living organism. Although many such gene expression systems exist, ...

Characterizing Mechanical Properties of Primary Cell Wall in Living Plant Organs Using Atomic Force Microscopy

Karakterisering av mekaniske egenskaper til primærcellevegg i levende planteorganer ved bruk av atomkraftmikroskopi

The mechanical properties of the primary cell walls determine the direction and rate of plant cell growth and, therefore, the future size and shape of the ...