Name: contact mode atomic force microscopy as a rapid technique for morphological observation and bacterial cell damage analysis
Uploaded: 2023-06-30T13:40:00
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Ramiro Muñiz-Díaz agradece al CONACyT por la beca.

1. Aislamiento e identificación bacteriana
<ol><li>Aislamiento de una cepa endófita de los meristemos del bulbo de ajo:<ol><li>Coloque fragmentos de 2 mm de meristemos de bulbos de ajo previamente pelados, desinfectados y cortados en agar de soja tripticasa (TSA) como un medio de crecimiento rico, e incubar a 25 ° C durante 1 día.</li>
		<li>Basándose en las diferencias morfológicas de las colonias bacterianas (forma, tamaño, color, borde, luz transmitida, luz reflejada, textura, consistencia y ...

<ol>
	<li>Koch, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+form+of+the+bacterial+cell+wall.">Growth and form of the bacterial cell wall.</a> American Scientist. 78 (4), 327-341 (1990).</li><li>Si, F., Li, B., Margolin, W., Sun, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+growth+and+form+under+mechanical+compression.">Bacterial growth and form under mechanical compression.</a> Scientific Report. 5, 11367 (2015).</li><li>Pavlova, M. D., Asaturova, A. M., Kozitsyn, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+cell+shape:+Some+features+of+ultrastructure,+evolution,+and+ecology.">Bacterial cell shape: Some features of ultrastructure, evolution, and ecology.</a> Biology Bulletin Reviews. 12, 254-265 (2022).</li><li>Cabeen, M. T., Jacobs-Wagner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+cell+shape.">Bacterial cell shape.</a> Nature Reviews Microbiology. 3 (8), 601-610 (2005).</li><li>Smith, W. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+morphology+drives+spatial+patterning+in+microbial+communities.">Cell morphology drives spatial patterning in microbial communities.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 114 (3), E280-E286 (2017).</li><li>Volke, D. C., Nikel, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+bacteria+in+shape:+Synthetic+morphology+approaches+for+the+design+of+efficient+microbial+cell+factories.">Getting bacteria in shape: Synthetic morphology approaches for the design of efficient microbial cell factories.</a> Advanced Biosystems. 2 (11), 1800111 (2018).</li><li>Mi, L., Ning, X., Lianqing, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peak+force+tapping+atomic+force+microscopy+for+advancing+cell+and+molecular+biology.">Peak force tapping atomic force microscopy for advancing cell and molecular biology.</a> Nanoscale. 13 (18), 8358-8375 (2021).</li><li>Hoffman, C. S., Winston, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ten-minute+DNA+preparation+from+yeast+efficiently+releases+autonomous+plasmids+for+transformation+of+Escherichia+coli.">A ten-minute DNA preparation from yeast efficiently releases autonomous plasmids for transformation of Escherichia coli.</a> Gene. 57 (2-3), 267-272 (1987).</li><li>Weisburg, W. G., Barns, S. M., Pelletier, D. A., Lane, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=16S+ribosomal+DNA+amplification+for+phylogenetic+study.">16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study.</a> Journal of Bacteriology. 173 (2), 697-703 (1991).</li><li>Behr, S., M&#228;tzig, M., Levin, A., Eickhoff, H., Heller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fully+automated+multicapillary+electrophoresis+device+for+DNA+analysis.">A fully automated multicapillary electrophoresis device for DNA analysis.</a> ELECTROPHORESIS. 20 (7), 1492-1507 (1999).</li><li>Seliger, H., Groger, G., Jirikowksi, G., Ortigao, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+methods+for+the+solid-phase+sequence+analysis+of+nucleic+acid+fragments+using+the+Sanger+dideoxy+procedure.">New methods for the solid-phase sequence analysis of nucleic acid fragments using the Sanger dideoxy procedure.</a> Nucleosides &amp; Nucleotides. 9 (3), 383-388 (1990).</li><li>Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+local+alignment+search+tool.">Basic local alignment search tool.</a> Journal of Molecular Biology. 215 (3), 403-410 (1990).</li><li>Stackebrandt, E., Ebers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taxonomic+parameter+revisited:+Tarnished+gold+standards.">Taxonomic parameter revisited: Tarnished gold standards.</a> Microbiology Today. 33, 152-155 (2006).</li><li>Mu&#241;iz Diaz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+triethylamine-based+synthesis+of+MgO+nanoparticles+and+their+antibacterial+effect+against+pathogenic+bacteria.">Two-step triethylamine-based synthesis of MgO nanoparticles and their antibacterial effect against pathogenic bacteria.</a> Nanomaterials. 11 (2), 410 (2021).</li><li>Andrews, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+minimum+inhibitory+concentrations.">Determination of minimum inhibitory concentrations.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 48, 5-16 (2001).</li><li>Sarker, S. D., Nahar, L., Kumarasamy, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtitre+plate-based+antibacterial+assay+incorporating+resazurin+as+an+indicator+of+cell+growth,+and+its+application+in+the+in+vitro+antibacterial+screening+of+phytochemicals.">Microtitre plate-based antibacterial assay incorporating resazurin as an indicator of cell growth, and its application in the in vitro antibacterial screening of phytochemicals.</a> Methods. 42 (4), 321-324 (2007).</li><li>Giesbrecht, P., Kersten, T., Maidhof, H., Wecke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcal+cell+wall:+Morphogenesis+and+fatal+variations+in+the+presence+of+penicillin.">Staphylococcal cell wall: Morphogenesis and fatal variations in the presence of penicillin.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (4), 1371-1414 (1998).</li><li>Yamada, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=autolysin+ring+associated+with+cell+separation+of+Staphylococcus+aureus.">autolysin ring associated with cell separation of Staphylococcus aureus.</a> Journal of Bacteriology. 178 (6), 1565-1571 (1996).</li><li>Zuttion, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anti-adhesive+effect+of+glycoclusters+on+Pseudomonas+aeruginosa+bacteria+adhesion+to+epithelial+cells+studied+by+AFM+single+cell+force+spectroscopy.">The anti-adhesive effect of glycoclusters on Pseudomonas aeruginosa bacteria adhesion to epithelial cells studied by AFM single cell force spectroscopy.</a> Nanoscale. 10 (26), 12771-12778 (2018).</li><li>Kahli, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+growth+conditions+on+Pseudomonas+fluorescens+morphology+characterized+by+atomic+force+microscopy.">Impact of growth conditions on Pseudomonas fluorescens morphology characterized by atomic force microscopy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 23 (17), 9579 (2022).</li><li>Kambli, P., Valavade, A., Kothari, D. C., Kelkar-Mane, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphostructural+changes+induced+in+E.+coli+exposed+to+copper+ions+in+water+at+increasing+concentrations.">Morphostructural changes induced in E. coli exposed to copper ions in water at increasing concentrations.</a> World Journal of Pharmaceutical Research. 4 (10), 837-852 (2015).</li><li>Kochan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+In+vivo+atomic+force+microscopy-infrared+spectroscopy+of+bacteria.">et al. In vivo atomic force microscopy-infrared spectroscopy of bacteria.</a> Journal of the Royal Society Interface. 15, 140 (2018).</li><li>Stoimenov, P. K., Klinger, R. L., Marchin, G. L., Klabunde, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+oxide+nanoparticles+as+bactericidal+agents.">Metal oxide nanoparticles as bactericidal agents.</a> Langmuir. 18, 6679-6686 (2002).</li><li>Lee, H. -. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NaCl+influences+thermal+resistance+and+cell+morphology+of+Escherichia+coli+strains.">NaCl influences thermal resistance and cell morphology of Escherichia coli strains.</a> Journal of Food Safety. 36 (1), 62-68 (2016).</li><li>Song, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibacterial+effects+of+Schisandra+chinensis+extract+on+and+its+application+in+food.">Antibacterial effects of Schisandra chinensis extract on and its application in food.</a> Journal of Food Safety. 38 (5), e12503 (2018).</li><li>Mohamed, W. M., Khallaf, M. F., Hassan, A. A., Elbayoumi, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermotolerance+of+Staphylococcus+aureus+after+sublethal+heat+shock.">Thermotolerance of Staphylococcus aureus after sublethal heat shock.</a> Arab Universities Journal of Agricultural Sciences. 27 (1), 467-477 (2019).</li><li>Shar, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomineralization+of+platinum+by+Escherichia+coli.">Biomineralization of platinum by Escherichia coli.</a> Metals. 9 (4), 407 (2019).</li><li>Baidamshina, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+microbial+biofilms+using+Ficin,+a+nonspecific+plant+protease.">Targeting microbial biofilms using Ficin, a nonspecific plant protease.</a> Scientific Reports. 7, 46068 (2017).</li><li>Ovchinnikova, E. S., vander Mei, H. C., Krom, B. P., Busscher, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exchange+of+adsorbed+serum+proteins+during+adhesion+of+Staphylococcus+aureus+to+an+abiotic+surface+and+Candida+albicans+hyphae-An+AFM+study.">Exchange of adsorbed serum proteins during adhesion of Staphylococcus aureus to an abiotic surface and Candida albicans hyphae-An AFM study.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 110, 45-50 (2013).</li></ol>

La microscopía es una técnica comúnmente utilizada en laboratorios biológicos que permite la investigación de la estructura, tamaño, morfología y disposición celular de muestras biológicas. Para mejorar esta técnica, se pueden utilizar varios tipos de microscopios que difieren entre sí en cuanto a sus características ópticas o electrónicas, que determinan la potencia de resolución del instrumento.
En la investigación científica, se requiere el uso de microscopía para la carac...

Diferentes formas bacterianas fueron observadas por primera vez por Antony van Leeuwenhoek en el siglo 171. Las bacterias han existido en una gran diversidad de formas desde la antigüedad, que van desde esferas hasta células ramificadas2. La forma celular es una condición fundamental para que los taxónomos bacterianos describan y clasifiquen cada especie bacteriana, principalmente para la separación morfológica de filos grampositivos y gramnegativos3. Se sabe que varios elementos determinan las formas celulares bacterianas, todos los cuales están involucrados en las cubiertas y el soporte celular como componentes de la pared celular y la membrana, así como en el citoesqueleto. De esta manera, los científicos todavía están dilucidando los mecanismos y procesos químicos, bioquímicos y físicos implicados en la determinación de las formas celulares bacterianas, todos los cuales están definidos por grupos de genes que definen las formas bacterianas 2,4.
Además, los científicos han demostrado que la forma de bastón es probablemente la forma ancestral de las células bacterianas, ya que esta forma de célula parece óptima en parámetros significativos para las células. Por lo tanto, los cocos, la espiral, el vibrio, las formas filamentosas y otras se consideran adaptaciones a diversos entornos; De hecho, morfologías particulares han evolucionado independientemente varias veces, lo que sugiere que las formas de las bacterias podrían ser adaptaciones a ambientes particulares 3,5. Sin embargo, a lo largo del ciclo de vida de la célula bacteriana, la forma de la célula cambia, y esto también ocurre como una respuesta genética a condiciones ambientales dañinas3. La forma y el tamaño de la célula bacteriana determinan fuertemente la rigidez, robustez y relación superficie-volumen de las bacterias, y esta característica puede ser explotada para procesos biotecnológicos6.
La microscopía electrónica se utiliza para estudiar muestras biológicas debido al alto aumento que se puede alcanzar más allá de los microscopios basados en la luz. La microscopía electrónica de transmisión (TEM) y la microscopía electrónica de barrido (SEM) son las técnicas más utilizadas para este propósito; Sin embargo, las muestras requieren algunos tratamientos antes de ser colocadas en la cámara del microscopio con el fin de obtener imágenes apropiadas. Se requiere una cubierta de oro en las muestras, y el tiempo utilizado para la adquisición total de imágenes no debe ser demasiado largo. Por el contrario, la microscopía de fuerza atómica (AFM) es una técnica ampliamente utilizada en el análisis de superficies, pero también se emplea en el estudio de muestras biológicas.
Existen varios tipos de modos AFM utilizados en el análisis de superficies, como el modo de contacto, el modo sin contacto o roscado, la microscopía de fuerza magnética (MFM), la AFM conductiva, la microscopía de fuerza piezoeléctrica (PFM), el roscado de fuerza máxima (PFT), la resonancia de contacto y el volumen de fuerza. Cada modo se utiliza en el análisis de materiales y proporciona información diferente sobre la superficie de los materiales y sus propiedades mecánicas y físicas. Sin embargo, algunos modos AFM se utilizan para el análisis de muestras biológicas in vitro, como PFT, porque PFT permite obtener datos topográficos y mecánicos sobre células en un medio líquido7.
En este trabajo, utilizamos el modo más básico incluido en cada modelo AFM antiguo y simple: el modo de contacto. AFM utiliza una sonda nítida (alrededor de <50 nm de diámetro) para escanear áreas de menos de 100 μm. La sonda se alinea con la muestra para interactuar con los campos de fuerza asociados con la muestra. La superficie se escanea con la sonda para mantener la fuerza constante. Luego, se genera una imagen de la superficie monitoreando el movimiento del voladizo a medida que se mueve a través de la superficie. La información recopilada proporciona las propiedades nanomecánicas de la superficie, como la adhesión, la elasticidad, la viscosidad y el cizallamiento.
En el modo de contacto AFM, el voladizo se escanea a través de la muestra con una desviación fija. Esto permite determinar la altura de las muestras (Z), y esto representa una ventaja sobre las otras técnicas de microscopio electrónico. El software AFM permite la generación de un escaneo de imagen 3D por la interacción entre la punta y la superficie de la muestra, y la desviación de la punta se correlaciona con la altura de la muestra a través de un láser y un detector.
En modo estático (modo de contacto) con fuerza constante, la salida presenta dos imágenes diferentes: la altura (topografía z) y la señal de deflexión o error. El modo estático es un modo de imagen valioso y simple, especialmente para muestras robustas en el aire que pueden manejar las altas cargas y las fuerzas de torsión ejercidas por el modo estático. El modo de deflexión o error se opera en modo de fuerza constante. Sin embargo, la imagen de la topografía se mejora aún más al agregar la señal de desviación a la estructura de la superficie. En este modo, la señal de deflexión también se conoce como señal de error, ya que la desviación es el parámetro de retroalimentación; Cualquier característica o morfología que aparezca en este canal se debe al "error" en el bucle de retroalimentación o, más bien, debido al bucle de retroalimentación requerido para mantener un punto de ajuste de deflexión constante.
El diseño único de AFM lo hace compacto, lo suficientemente pequeño como para caber en una mesa, al tiempo que tiene una resolución lo suficientemente alta como para resolver los pasos atómicos. El equipo AFM tiene un costo menor que el equipo para otros microscopios electrónicos, y los costos de mantenimiento son mínimos. El microscopio no requiere un laboratorio con condiciones especiales como una sala limpia o un espacio aislado; Solo necesita un escritorio libre de vibraciones. Para AFM, las muestras no necesitan someterse a una preparación elaborada como para otras técnicas (cubierta de oro, adelgazamiento); Solo se debe adjuntar una muestra seca al portamuestras.
Utilizamos el modo de contacto AFM para observar las morfologías bacterianas y los efectos de las NP. Se puede observar la población y la morfología celular de las bacterias fijadas en un soporte, así como el daño celular producido por las nanopartículas sobre las especies bacterianas. Las imágenes obtenidas por el modo de contacto AFM confirman que es una herramienta poderosa y no está limitada por reactivos y procedimientos complicados, por lo que es un método simple, rápido y económico para la caracterización bacteriana.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AFM EasyScan 2</td>
			<td>NanoSurf</td>
			<td>discontinued</td>
			<td>Measurement Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bacteriological loop</td>
			<td>No aplica</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>instrument for bacterial inoculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BigDye Terminator v3.1</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4337455</td>
			<td>Matrix installation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioedit</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>version 7.2.5</td>
			<td>Sequence alignment editor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cary 60 spectrometer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ceftriazone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>to remove particles that interfere with AFM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ContAI-G Silicon cantilever</td>
			<td>BudgetSensors</td>
			<td>ContAl-G-10</td>
			<td>Measurement Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eosin and methylene blue agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>bacterial culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC 25922</td>
			<td>bacterial strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq Flexi DNA Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M8295</td>
			<td>PCR of 16S rRNA gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microplate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10558295</td>
			<td>for microdilution analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M&#252;ller-Hinton broth</td>
			<td>Merck</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>bacterial culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nutrient agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>bacterial culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nutritious broth</td>
			<td>Merck</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>bacterial culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>growth of bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas hunanensis 9AP</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>isolated from the garlic bulb by CNRG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sanger sequencing</td>
			<td>Macrogen</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>sequencing service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScienceDesk Anti-Vibration workstation</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>slides</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>glass holder for bacterial sample analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staphylococcus aureus</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC 25923</td>
			<td>bacterial strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermalcycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>Veriti-4375786</td>
			<td>PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticasein soy agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>BA-256665</td>
			<td>growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrasonicator</td>
			<td>Cole-Parmer Ultrasonic Processor, 220 VAC</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>for mixing the nanoparticle dilutions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

contact mode atomic force microscopy as a rapid technique for morphological observation and bacterial cell damage analysis

La microscopía electrónica es una de las herramientas necesarias para caracterizar las estructuras celulares. Sin embargo, el procedimiento es complicado y costoso debido a la preparación de la muestra para la observación. La microscopía de fuerza atómica (AFM) es una técnica de caracterización muy útil debido a su alta resolución en tres dimensiones y debido a la ausencia de cualquier requisito de vacío y conductividad de la muestra. AFM puede obtener imágenes de una amplia variedad de muestras con diferentes topografías y diferentes tipos de materiales. 
AFM proporciona información topográfica 3D de alta resolución desde el nivel angstrom hasta la escala de micras. A diferencia de la microscopía tradicional, AFM utiliza una sonda para generar una imagen de la topografía de la superficie de una muestra. En este protocolo, se sugiere el uso de este tipo de microscopía para la caracterización morfológica y de daños celulares de bacterias fijadas en un soporte. Se utilizaron cepas de Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922) y Pseudomonas hunanensis (aislada de muestras de bulbo de ajo). En este trabajo, las células bacterianas se cultivaron en medios de cultivo específicos. Para observar el daño celular, Staphylococcus aureus y Escherichia coli se incubaron con diferentes concentraciones de nanopartículas (NP). 
Se fijó una gota de suspensión bacteriana en un soporte de vidrio, y se tomaron imágenes con AFM a diferentes escalas. Las imágenes obtenidas mostraron las características morfológicas de las bacterias. Además, empleando AFM, fue posible observar el daño a la estructura celular causado por el efecto de las NPs. A partir de las imágenes obtenidas, la AFM de contacto se puede utilizar para caracterizar la morfología de las células bacterianas fijadas en un soporte. AFM también es una herramienta adecuada para la investigación de los efectos de las NP en las bacterias. En comparación con la microscopía electrónica, AFM es una técnica económica y fácil de usar.

Las imágenes de la morfología y el tamaño de las cepas de S. aureus y P. hunanensis , así como la organización poblacional de ambas cepas, se tomaron mediante microscopía de fuerza atómica en modo de contacto. Las imágenes de S. aureus mostraron que su población estaba distribuida por zonas con agregados de cocos (Figura 1A). Con un aumento en la escala, hubo una mayor apreciación de la distribución poblacional y la morfología de los cocos (<strong cla...

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Contact Mode Atomic Force Microscopy as a Rapid Technique for Morphological Observation and Bacterial Cell Damage Analysis

Aquí, presentamos la aplicación de la microscopía de fuerza atómica (AFM) como un método simple y rápido para la caracterización bacteriana y analizamos detalles como el tamaño y la forma bacteriana, las biopelículas de cultivo bacteriano y la actividad de las nanopartículas como bactericidas.

Microscopía de fuerza atómica en modo de contacto como técnica rápida para la observación morfológica y el análisis del daño celular bacteriano

Electron microscopy is one of the tools required to characterize cellular structures. However, the procedure is complicated and expensive due to the ...

Este protocolo muestra el uso de la microscopía de fuerza atómica en modo de contacto para observar cambios en la morfología celular debido a una enfermedad o tratamiento específico. Es muy recomendable utilizar recipientes sellados para este procedimiento para evitar la contaminación y analizar la muestra fija lo antes posible para evitar el envejecimiento. Comience fijando las muestras en el portaobjetos pasando suavemente el portaobjetos sobre una llama varias veces hasta que la muestra esté seca.Coloque las muestras fijas en una placa de Petri y transpórtelas al equipo de microscopio de fuerza atómica para su observación. A continuación, encienda la computadora y el microscopio de fuerza atómica. A continuación, seleccione el modo de contacto, las sondas ContAI-G y las opciones de pendiente automática en el software.Establezca los valores predeterminados para el controlador Z estableciendo el punto de ajuste en 20 nanómetros, la ganancia P en 10, 000, la ganancia I en 1, 000, la ganancia D en cero y el voltaje de punta en cero milivoltios. Utilizando el cabezal de rango de escaneo de 70 micrómetros, coloque las muestras en el modo de contacto AFM. Obtenga una vista rápida de la superficie del área debajo de la sonda utilizando una cámara montada en dos lentes integradas en el cabezal de escaneo.Ahora, elija el área deseada desplazándola manualmente en el plano XY. Permita que la sonda se acerque electrónicamente a la superficie de la muestra hasta que se alcance el contacto. Ajuste electrónicamente el plano de medición XY del escáner y la superficie de la muestra reduciendo la dirección de la pendiente XY.Establezca los parámetros estándar del software en una línea por segundo y 256 puntos por línea. Luego realice un rango de escaneo completo de un área de 70 por 70 micrómetros. Seleccione el área más pequeña con la herramienta de zoom.Seleccione una nueva área de la muestra retrayendo el voladizo electrónicamente y moviendo la muestra a lo largo del plano XY. A continuación, realice un nuevo análisis como se demostró anteriormente. A continuación, utilice la nivelación línea por línea en el menú de herramientas de la imagen en la selección de filtros para realizar el procesamiento de datos.Optimice la altura máxima y mínima en la barra de color para obtener la mejor resolución de imagen. Finalmente, realice el análisis de la imagen utilizando el menú de análisis. Seleccione los puntos inicial y final con la herramienta deseada para determinar la longitud y la distancia.El análisis microscópico de fuerza atómica de los cultivos bacterianos mostró que los cultivos de Staphylococcus aureus estaban distribuidos por zonas con agregados de cocos. El aumento de las escalas mostró que había una mayor apreciación de la distribución de la población y la morfología de los cocos. Las imágenes del modo de contacto AFM permitieron determinar el tamaño de los cocos que mostraron un ancho promedio de 1,25 micrómetros.Pseudomonas hunanensis mostró una distribución homogénea en toda la superficie de soporte del vidrio formando una monocapa adherente. Los cultivos tenían forma de varilla con una longitud de 1,9 micrómetros y una anchura de 0,9 micrómetros. La exposición a microdilución de nanopartículas de óxido de magnesio de Staphylococcus aureus resultó en la pérdida de una superficie lisa y contornos homogéneos debido al deterioro severo de la estructura celular.La formación de vesículas y la liberación de material citosólico se observaron en cultivos a concentraciones más altas que la CMI. Se obtuvieron resultados similares en cultivos de E. coli con los controles mostrando superficies lisas destacando su forma homogénea en forma de varilla. La estructura desapareció por completo a 1.000 PPM de exposición de nanopartículas con solo siluetas distinguibles.Es importante realizar la fijación de la muestra correctamente, ya que es esencial para un análisis posterior. El filtro de imagen ayuda a proporcionar una buena resolución de imagen y detalles de muestra. Utilizando el método de fijación, se pueden aplicar modos AFM sin contacto, lo que puede ser útil en el estudio de las propiedades mecánicas.Esta metodología podría ser una herramienta económica y útil para la investigación médica y microbiológica centrada en el análisis del daño celular bacteriano.

Research

JoVE Journal

Biology

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Análisis de la elaboración de un fenotipo morfológico en función de la concentración de proteínas en la levadura en ciernes

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Investigación

Biología

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Respuesta de células vivas a la estimulación mecánica estudiados por microscopía óptica integrada la Fuerza Atómica y

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to ...

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The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field ...

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