Name: contact mode atomic force microscopy as a rapid technique for morphological observation and bacterial cell damage analysis
Uploaded: 2023-06-30T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Contact Mode Atomic Force Microscopy as a Rapid Technique for Morphological Observation and Bacterial Cell Damage Analysis at JoVE.com

Ramiro Muniz-Diaz tackar CONACyT för stipendiet.

1. Bakteriell isolering och identifiering
<ol><li>Isolering av en endofytisk stam från vitlökslamperistemer:<ol><li>Placera 2 mm fragment av meristems från tidigare skalade, desinficerade och skurna vitlökslökar på tryptikassojaagar (TSA) som ett rikt tillväxtmedium och inkubera vid 25 °C i 1 dag.</li>
		<li>Baserat på de morfologiska skillnaderna mellan bakteriekolonierna - form, storlek, färg, kant, överfört ljus, reflekterat ljus, textur, konsistens och pigmentproduktion - beskriva de ol...

<ol>
	<li>Koch, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+form+of+the+bacterial+cell+wall.">Growth and form of the bacterial cell wall.</a> American Scientist. 78 (4), 327-341 (1990).</li><li>Si, F., Li, B., Margolin, W., Sun, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+growth+and+form+under+mechanical+compression.">Bacterial growth and form under mechanical compression.</a> Scientific Report. 5, 11367 (2015).</li><li>Pavlova, M. D., Asaturova, A. M., Kozitsyn, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+cell+shape:+Some+features+of+ultrastructure,+evolution,+and+ecology.">Bacterial cell shape: Some features of ultrastructure, evolution, and ecology.</a> Biology Bulletin Reviews. 12, 254-265 (2022).</li><li>Cabeen, M. T., Jacobs-Wagner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+cell+shape.">Bacterial cell shape.</a> Nature Reviews Microbiology. 3 (8), 601-610 (2005).</li><li>Smith, W. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+morphology+drives+spatial+patterning+in+microbial+communities.">Cell morphology drives spatial patterning in microbial communities.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 114 (3), E280-E286 (2017).</li><li>Volke, D. C., Nikel, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+bacteria+in+shape:+Synthetic+morphology+approaches+for+the+design+of+efficient+microbial+cell+factories.">Getting bacteria in shape: Synthetic morphology approaches for the design of efficient microbial cell factories.</a> Advanced Biosystems. 2 (11), 1800111 (2018).</li><li>Mi, L., Ning, X., Lianqing, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peak+force+tapping+atomic+force+microscopy+for+advancing+cell+and+molecular+biology.">Peak force tapping atomic force microscopy for advancing cell and molecular biology.</a> Nanoscale. 13 (18), 8358-8375 (2021).</li><li>Hoffman, C. S., Winston, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ten-minute+DNA+preparation+from+yeast+efficiently+releases+autonomous+plasmids+for+transformation+of+Escherichia+coli.">A ten-minute DNA preparation from yeast efficiently releases autonomous plasmids for transformation of Escherichia coli.</a> Gene. 57 (2-3), 267-272 (1987).</li><li>Weisburg, W. G., Barns, S. M., Pelletier, D. A., Lane, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=16S+ribosomal+DNA+amplification+for+phylogenetic+study.">16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study.</a> Journal of Bacteriology. 173 (2), 697-703 (1991).</li><li>Behr, S., M&#228;tzig, M., Levin, A., Eickhoff, H., Heller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fully+automated+multicapillary+electrophoresis+device+for+DNA+analysis.">A fully automated multicapillary electrophoresis device for DNA analysis.</a> ELECTROPHORESIS. 20 (7), 1492-1507 (1999).</li><li>Seliger, H., Groger, G., Jirikowksi, G., Ortigao, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+methods+for+the+solid-phase+sequence+analysis+of+nucleic+acid+fragments+using+the+Sanger+dideoxy+procedure.">New methods for the solid-phase sequence analysis of nucleic acid fragments using the Sanger dideoxy procedure.</a> Nucleosides &amp; Nucleotides. 9 (3), 383-388 (1990).</li><li>Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+local+alignment+search+tool.">Basic local alignment search tool.</a> Journal of Molecular Biology. 215 (3), 403-410 (1990).</li><li>Stackebrandt, E., Ebers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taxonomic+parameter+revisited:+Tarnished+gold+standards.">Taxonomic parameter revisited: Tarnished gold standards.</a> Microbiology Today. 33, 152-155 (2006).</li><li>Mu&#241;iz Diaz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+triethylamine-based+synthesis+of+MgO+nanoparticles+and+their+antibacterial+effect+against+pathogenic+bacteria.">Two-step triethylamine-based synthesis of MgO nanoparticles and their antibacterial effect against pathogenic bacteria.</a> Nanomaterials. 11 (2), 410 (2021).</li><li>Andrews, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+minimum+inhibitory+concentrations.">Determination of minimum inhibitory concentrations.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 48, 5-16 (2001).</li><li>Sarker, S. D., Nahar, L., Kumarasamy, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtitre+plate-based+antibacterial+assay+incorporating+resazurin+as+an+indicator+of+cell+growth,+and+its+application+in+the+in+vitro+antibacterial+screening+of+phytochemicals.">Microtitre plate-based antibacterial assay incorporating resazurin as an indicator of cell growth, and its application in the in vitro antibacterial screening of phytochemicals.</a> Methods. 42 (4), 321-324 (2007).</li><li>Giesbrecht, P., Kersten, T., Maidhof, H., Wecke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcal+cell+wall:+Morphogenesis+and+fatal+variations+in+the+presence+of+penicillin.">Staphylococcal cell wall: Morphogenesis and fatal variations in the presence of penicillin.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (4), 1371-1414 (1998).</li><li>Yamada, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=autolysin+ring+associated+with+cell+separation+of+Staphylococcus+aureus.">autolysin ring associated with cell separation of Staphylococcus aureus.</a> Journal of Bacteriology. 178 (6), 1565-1571 (1996).</li><li>Zuttion, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anti-adhesive+effect+of+glycoclusters+on+Pseudomonas+aeruginosa+bacteria+adhesion+to+epithelial+cells+studied+by+AFM+single+cell+force+spectroscopy.">The anti-adhesive effect of glycoclusters on Pseudomonas aeruginosa bacteria adhesion to epithelial cells studied by AFM single cell force spectroscopy.</a> Nanoscale. 10 (26), 12771-12778 (2018).</li><li>Kahli, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+growth+conditions+on+Pseudomonas+fluorescens+morphology+characterized+by+atomic+force+microscopy.">Impact of growth conditions on Pseudomonas fluorescens morphology characterized by atomic force microscopy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 23 (17), 9579 (2022).</li><li>Kambli, P., Valavade, A., Kothari, D. C., Kelkar-Mane, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphostructural+changes+induced+in+E.+coli+exposed+to+copper+ions+in+water+at+increasing+concentrations.">Morphostructural changes induced in E. coli exposed to copper ions in water at increasing concentrations.</a> World Journal of Pharmaceutical Research. 4 (10), 837-852 (2015).</li><li>Kochan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+In+vivo+atomic+force+microscopy-infrared+spectroscopy+of+bacteria.">et al. In vivo atomic force microscopy-infrared spectroscopy of bacteria.</a> Journal of the Royal Society Interface. 15, 140 (2018).</li><li>Stoimenov, P. K., Klinger, R. L., Marchin, G. L., Klabunde, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+oxide+nanoparticles+as+bactericidal+agents.">Metal oxide nanoparticles as bactericidal agents.</a> Langmuir. 18, 6679-6686 (2002).</li><li>Lee, H. -. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NaCl+influences+thermal+resistance+and+cell+morphology+of+Escherichia+coli+strains.">NaCl influences thermal resistance and cell morphology of Escherichia coli strains.</a> Journal of Food Safety. 36 (1), 62-68 (2016).</li><li>Song, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibacterial+effects+of+Schisandra+chinensis+extract+on+and+its+application+in+food.">Antibacterial effects of Schisandra chinensis extract on and its application in food.</a> Journal of Food Safety. 38 (5), e12503 (2018).</li><li>Mohamed, W. M., Khallaf, M. F., Hassan, A. A., Elbayoumi, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermotolerance+of+Staphylococcus+aureus+after+sublethal+heat+shock.">Thermotolerance of Staphylococcus aureus after sublethal heat shock.</a> Arab Universities Journal of Agricultural Sciences. 27 (1), 467-477 (2019).</li><li>Shar, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomineralization+of+platinum+by+Escherichia+coli.">Biomineralization of platinum by Escherichia coli.</a> Metals. 9 (4), 407 (2019).</li><li>Baidamshina, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+microbial+biofilms+using+Ficin,+a+nonspecific+plant+protease.">Targeting microbial biofilms using Ficin, a nonspecific plant protease.</a> Scientific Reports. 7, 46068 (2017).</li><li>Ovchinnikova, E. S., vander Mei, H. C., Krom, B. P., Busscher, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exchange+of+adsorbed+serum+proteins+during+adhesion+of+Staphylococcus+aureus+to+an+abiotic+surface+and+Candida+albicans+hyphae-An+AFM+study.">Exchange of adsorbed serum proteins during adhesion of Staphylococcus aureus to an abiotic surface and Candida albicans hyphae-An AFM study.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 110, 45-50 (2013).</li></ol>

Mikroskopi är en teknik som vanligtvis används i biologiska laboratorier som möjliggör undersökning av struktur, storlek, morfologi och cellulärt arrangemang av biologiska prover. För att förbättra denna teknik kan flera typer av mikroskop användas som skiljer sig från varandra när det gäller deras optiska eller elektroniska egenskaper, som bestämmer instrumentets upplösningseffekt.
I vetenskaplig forskning krävs användning av mikroskopi för karakterisering av bakterieceller;...

Olika bakterieformer noterades först av Antony van Leeuwenhoek på 17-talet1. Bakterier har funnits i en stor mångfald av former sedan antiken, allt från sfärer till förgreningsceller2. Cellform är ett grundläggande villkor för bakteriella taxonomer att beskriva och klassificera varje bakterieart, främst för morfologisk separation av gram-positiv och gramnegativ phyla3. Flera element är kända för att bestämma bakteriella cellformer, som alla är involverade i cellöverdrag och stöd som komponenter i cellväggen och membranet, liksom i cytoskelettet. På detta sätt belyser forskare fortfarande de kemiska, biokemiska och fysiska mekanismer och processer som är inblandade i att bestämma bakteriella cellformer, som alla definieras av kluster av gener som definierar bakterieformer 2,4.
Dessutom har forskare visat att stavformen sannolikt är den förfäderliga formen av bakterieceller, eftersom denna cellform verkar optimal i cellsignifikanta parametrar. Således betraktas kocker, spiral, vibrio, filamentösa och andra former som anpassningar till olika miljöer; Faktum är att vissa morfologier har utvecklats oberoende flera gånger, vilket tyder på att bakteriernas former kan anpassas till särskilda miljöer 3,5. Men under hela bakteriecellens livscykel förändras cellformen, och detta sker också som ett genetiskt svar på skadliga miljöförhållanden3. Bakteriecellens form och storlek bestämmer starkt bakteriens styvhet, robusthet och förhållande mellan yta och volym, och denna egenskap kan utnyttjas för biotekniska processer6.
Elektronisk mikroskopi används för att studera biologiska prover på grund av den höga förstoringen som kan nås bortom ljusbaserade mikroskop. Transmissionselektronmikroskopi (TEM) och svepelektronmikroskopi (SEM) är de vanligaste teknikerna för detta ändamål; Prover kräver dock vissa behandlingar innan de placeras i mikroskopets kammare för att få lämpliga bilder. Ett guldskydd på proverna krävs, och den tid som används för total bildförvärv bör inte vara för lång. Däremot är atomkraftmikroskopi (AFM) en teknik som ofta används vid analys av ytor men används också vid studier av biologiska prover.
Det finns flera typer av AFM-lägen som används vid ytanalys, såsom kontaktläge, beröringsfritt läge eller tappning, magnetisk kraftmikroskopi (MFM), ledande AFM, piezoelektrisk kraftmikroskopi (PFM), toppkrafttappning (PFT), kontaktresonans och kraftvolym. Varje läge används vid analys av material och ger olika information om materialens yta och deras mekaniska och fysikaliska egenskaper. Vissa AFM-lägen används emellertid för analys av biologiska prover in vitro, såsom PFT, eftersom PFT möjliggör erhållande av topografiska och mekaniska data om celler i ett flytande medium7.
I det här arbetet använde vi det mest grundläggande läget som ingår i varje gammal och enkel AFM-modell - kontaktläget. AFM använder en skarp sond (cirka <50 nm i diameter) för att skanna områden mindre än 100 μm. Sonden justeras mot provet för att interagera med kraftfälten som är associerade med provet. Ytan skannas med sonden för att hålla kraften konstant. Därefter genereras en bild av ytan genom att övervaka utskjutarens rörelse när den rör sig över ytan. Den insamlade informationen ger ytans nanomekaniska egenskaper, såsom vidhäftning, elasticitet, viskositet och skjuvning.
I AFM-kontaktläget skannas utskjutaren över provet med en fast avböjning. Detta gör att man kan bestämma höjden på proverna (Z), och detta utgör en fördel jämfört med de andra elektroniska mikroskopteknikerna. AFM-programvaran möjliggör generering av en 3D-bildskanning genom interaktionen mellan spetsen och provytan, och spetsböjningen är korrelerad med provets höjd genom en laser och en detektor.
I statiskt läge (kontaktläge) med konstant kraft presenterar utgången två olika bilder: höjden (z-topografi) och avböjnings- eller felsignalen. Statiskt läge är ett värdefullt, enkelt bildläge, särskilt för robusta prover i luft som kan hantera de höga belastningar och vridkrafter som utövas av statiskt läge. Avböjnings- eller felläget drivs i konstant kraftläge. Topografibilden förbättras dock ytterligare genom att avböjningssignalen läggs till ytstrukturen. I detta läge kallas avböjningssignalen också felsignalen eftersom avböjningen är återkopplingsparametern; Alla funktioner eller morfologi som visas i den här kanalen beror på "felet" i återkopplingsslingan eller snarare på grund av återkopplingsslingan som krävs för att upprätthålla ett konstant avböjningsbörvärde.
AFM: s unika design gör den kompakt - tillräckligt liten för att passa på en bordsskiva - samtidigt som den har tillräckligt hög upplösning för att lösa atomsteg. AFM-utrustningen har en lägre kostnad än utrustningen för andra elektroniska mikroskop, och underhållskostnaderna är minimala. Mikroskopet kräver inte ett laboratorium med speciella förhållanden som ett renrum eller ett isolerat utrymme; Det behöver bara ett vibrationsfritt skrivbord. För AFM behöver proverna inte genomgå en detaljerad beredning som för andra tekniker (guldöverdrag, bantning); Endast ett torrt prov behöver fästas på provhållaren.
Vi använder AFM-kontaktläge för att observera bakteriella morfologier och effekterna av NP. Populationen och cellulär morfologi hos bakterier fixerade på ett stöd kan observeras, liksom den cellulära skada som produceras av nanopartiklar på bakteriearten. Bilderna som erhållits med AFM-kontaktläge bekräftar att det är ett kraftfullt verktyg och inte begränsas av reagens och komplicerade procedurer, vilket gör det till en enkel, snabb och ekonomisk metod för bakteriell karakterisering.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AFM EasyScan 2</td>
			<td>NanoSurf</td>
			<td>discontinued</td>
			<td>Measurement Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bacteriological loop</td>
			<td>No aplica</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>instrument for bacterial inoculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BigDye Terminator v3.1</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4337455</td>
			<td>Matrix installation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioedit</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>version 7.2.5</td>
			<td>Sequence alignment editor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cary 60 spectrometer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ceftriazone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>to remove particles that interfere with AFM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ContAI-G Silicon cantilever</td>
			<td>BudgetSensors</td>
			<td>ContAl-G-10</td>
			<td>Measurement Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eosin and methylene blue agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>bacterial culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC 25922</td>
			<td>bacterial strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq Flexi DNA Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M8295</td>
			<td>PCR of 16S rRNA gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microplate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10558295</td>
			<td>for microdilution analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M&#252;ller-Hinton broth</td>
			<td>Merck</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>bacterial culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nutrient agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>bacterial culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nutritious broth</td>
			<td>Merck</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>bacterial culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>growth of bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas hunanensis 9AP</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>isolated from the garlic bulb by CNRG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sanger sequencing</td>
			<td>Macrogen</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>sequencing service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScienceDesk Anti-Vibration workstation</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>slides</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>glass holder for bacterial sample analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staphylococcus aureus</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC 25923</td>
			<td>bacterial strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermalcycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>Veriti-4375786</td>
			<td>PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticasein soy agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>BA-256665</td>
			<td>growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrasonicator</td>
			<td>Cole-Parmer Ultrasonic Processor, 220 VAC</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>for mixing the nanoparticle dilutions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

contact mode atomic force microscopy as a rapid technique for morphological observation and bacterial cell damage analysis

Elektronmikroskopi är ett av de verktyg som krävs för att karakterisera cellulära strukturer. Förfarandet är emellertid komplicerat och dyrt på grund av provberedningen för observation. Atomkraftmikroskopi (AFM) är en mycket användbar karakteriseringsteknik på grund av dess höga upplösning i tre dimensioner och på grund av avsaknaden av krav på vakuum och provledningsförmåga. AFM kan avbilda en mängd olika prover med olika topografier och olika typer av material. 
AFM ger högupplöst 3D-topografiinformation från ångströmnivå till mikronskala. Till skillnad från traditionell mikroskopi använder AFM en sond för att generera en bild av yttopografin i ett prov. I detta protokoll föreslås användningen av denna typ av mikroskopi för morfologisk och cellskada karakterisering av bakterier fixerade på ett stöd. Stammar av Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922) och Pseudomonas hunanensis (isolerade från vitlökslökprover) användes. I detta arbete odlades bakterieceller i specifika odlingsmedier. För att observera cellskador inkuberades Staphylococcus aureus och Escherichia coli med olika koncentrationer av nanopartiklar (NP). 
En droppe bakteriesuspension fixerades på ett glasstöd, och bilder togs med AFM i olika skalor. De erhållna bilderna visade bakteriens morfologiska egenskaper. Vidare, med hjälp av AFM, var det möjligt att observera skadorna på den cellulära strukturen orsakad av effekten av NP. Baserat på de erhållna bilderna kan kontakt-AFM användas för att karakterisera morfologin hos bakterieceller fixerade på ett stöd. AFM är också ett lämpligt verktyg för undersökning av effekterna av NP på bakterier. Jämfört med elektronmikroskopi är AFM en billig och lättanvänd teknik.

Bilder av morfologin och storleken på stammarna S. aureus och P. hunanensis , liksom befolkningsorganisationen för båda stammarna, togs med atomkraftmikroskopi i kontaktläge.  S. aureus-bilderna visade att dess befolkning fördelades av zoner med aggregat av kocker (figur 1A). Med en ökning i skala var det en större uppskattning av kockernas befolkningsfördelning och morfologi (figur 1B). Mikroskopirapporterna visade att en pse...

Watch this Scientific Journal Video about Contact Mode Atomic Force Microscopy as a Rapid Technique for Morphological Observation and Bacterial Cell Damage Analysis at JoVE.com

Contact Mode Atomic Force Microscopy as a Rapid Technique for Morphological Observation and Bacterial Cell Damage Analysis

Här presenterar vi tillämpningen av atomkraftmikroskopi (AFM) som en enkel och snabb metod för bakteriell karakterisering och analyserar detaljer som bakteriestorlek och form, bakteriekulturbiofilmer och nanopartiklars aktivitet som bakteriedödande medel.

Kontaktläge Atomkraftsmikroskopi som en snabb teknik för morfologisk observation och bakteriell cellskadeanalys

Electron microscopy is one of the tools required to characterize cellular structures. However, the procedure is complicated and expensive due to the ...

Detta protokoll visar användningen av kontaktläge atomkraftmikroskopi för att observera förändringar i cellmorfologi på grund av en specifik sjukdom eller behandling. Det rekommenderas starkt att använda förseglade behållare för denna procedur för att undvika kontaminering och analysera det fasta provet så snart som möjligt för att undvika åldrande. Börja med att fixera proverna på objektglaset genom att försiktigt föra glaset över en låga flera gånger tills provet är torrt.Placera de fasta proverna i en petriskål och transportera dem till atomkraftens mikroskoputrustning för observation. Slå sedan på datorn och atomkraftmikroskopet. Välj sedan kontaktläge, ContAI-G-prober och alternativ för automatisk lutning i programvaran.Ställ in standardvärdena för Z-styrenheten genom att ställa in börvärdet vid 20 nanometer, P-förstärkning vid 10 000, jag får vid 1 000, D-förstärkning vid noll och spetsspänning till noll millivolt. Använd 70 mikrometer skanningsområdeshuvudet och placera proverna i AFM-kontaktläge. Få en snabb bild av ytan på området under sonden genom att använda en kamera monterad på två linser integrerade i skanningshuvudet.Välj nu önskat område genom att manuellt förskjuta det i XY-planet. Låt sonden närma sig provytan elektroniskt tills kontakt har nåtts. Justera skannerns XY-mätplan och provytan elektroniskt genom att minska XY-lutningsriktningen.Ställ in programvarans standardparametrar till en rad per sekund och 256 poäng per rad. Utför sedan ett fullständigt skanningsområde på ett område på 70 x 70 mikrometer. Markera det mindre området med zoomverktyget.Välj ett nytt område från provet genom att dra in fribärande elektroniskt och flytta provet längs XY-planet. Utför sedan en ny skanning som visats tidigare. Använd sedan rad-för-rad-nivelleringen i verktygsmenyn i bilden i filtervalet för att utföra databehandling.Optimera maximal och minsta höjd i färgfältet för att få bästa bildupplösning. Slutligen utför du bildanalysen med hjälp av analysmenyn. Välj de första och sista punkterna med önskat verktyg för att bestämma längd och avstånd.Atomkraftmikroskopisk analys av bakteriekulturerna visade att Staphylococcus aureus-kulturerna fördelades av zoner med kockaggregat. Ökade skalor visade att det fanns en större uppskattning av populationsfördelning och kockmorfologi. AFM-kontaktlägesbilderna möjliggjorde bestämning av kockernas storlek, som visade en genomsnittlig bredd på 1,25 mikrometer.Pseudomonas hunanensis visade en homogen fördelning på hela glasstödytan och bildade ett vidhäftande monolager. Kulturerna var stavformade med en längd av 1,9 mikrometer och en bredd av 0,9 mikrometer. Mikroutspädningsexponering av magnesiumoxidnanopartiklar av Staphylococcus aureus resulterade i förlust av en slät yta och homogena konturer på grund av allvarlig cellstrukturförsämring.Vesikelbildning och frisättning av cytosoliskt material observerades i kulturer vid högre koncentrationer än MIC. Liknande resultat erhölls i E. coli-kulturer med kontrollerna som visar släta ytor som framhäver dess homogena stavliknande form. Strukturen försvann helt vid 1 000 PPM nanopartikelexponering med endast urskiljbara silhuetter.Det är viktigt att utföra provfixering korrekt eftersom det är viktigt för vidare analys. Bildfiltret hjälper till att ge bra bildupplösning och exempeldetaljer. Med hjälp av fixeringsmetoden kan AFM beröringsfria lägen tillämpas, vilket kan vara till hjälp vid studier av mekaniska egenskaper.Denna metod kan vara ett billigt och användbart verktyg för medicinsk och mikrobiologisk forskning inriktad på bakteriell cellskadeanalys.

Research

JoVE Journal

Biology

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Analys av utveckling av en morfologisk Fenotyp som en funktion av proteinkoncentration i Budding Jäst

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Live Cell Response to Mechanical Stimulation Studied by Integrated Optical and Atomic Force Microscopy

Levande cell Svar på mekanisk stimulering studerats av integrerad optisk och atomkraftsmikroskopi

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to ...

Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

Mikromekaniska Karakterisering av lungvävnad Använda atomkraftsmikroskopi

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3.  On the macro scale the stiffness of tissues and organs ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Snabb analys och utforskningen av fluorescensmikroskopi bilder

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Provberedning för single virion atomic force mikroskopi och superupplösning fluorescensavbildning

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Design and Development of Aptamer&#8211;Gold Nanoparticle Based Colorimetric Assays for In-the-field Applications

Design och utveckling av aptamer-guld nanopartiklar baserade kolorimetriska analyser för in-the-fältet Program

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Mätning av styvheten hos<em&gt; Ex vivo</em&gt; Mus Aorta Använda atomkraftsmikroskopi

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM)

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy SEM

Beredning av prokaryota och eukaryota organismer använder kemisk torkning för Morfologisk analys i svepelektronmikroskopi (SEM)

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to ...

Rapid, Affordable, and Uncomplicated Production of Bacterial Cell-free Lysate

Snabb, prisvärd och okomplicerad produktion av bakteriell cellfri lysate

Cell-free gene expression offers the power of biology without the complications of a living organism. Although many such gene expression systems exist, ...

Characterizing Mechanical Properties of Primary Cell Wall in Living Plant Organs Using Atomic Force Microscopy

Karakterisera mekaniska egenskaper hos primär cellvägg i levande växtorgan med hjälp av atomkraftsmikroskopi

The mechanical properties of the primary cell walls determine the direction and rate of plant cell growth and, therefore, the future size and shape of the ...