Name: real-time quantification of the effects of is200/is605 family-associated tnpb on transposon activity
Uploaded: 2023-01-20T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Quantification of the Effects of IS200/IS605 Family-Associated TnpB on Transposon Activity at JoVE.com

תמיכה כספית למחקר זה ניתנה על ידי קרנות סטארט-אפ מאוניברסיטת קליפורניה.

1. הכנת תרביות חיידקים
<ol><li>לגדל זן E. coli MG1655 עם מבנים טרנספוזונים פלסמידים (שתוארו בעבר ב- Kim et al.8) בן לילה ב- LB עם האנטיביוטיקה המתאימה (25 מיקרוגרם / מ"ל של קנאמיצין, ראה טבלת חומרים) ב 37 °C. הערה: הרצפים של המבנים המשמשים והרצפים הקשורים זמינים כמספרי ההצטר...

<ol>
	<li>Cowley, M., Oakey, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposable+elements+re-wire+and+fine-tune+the+transcriptome.">Transposable elements re-wire and fine-tune the transcriptome.</a> PLoS Genetics. 9 (1), 1003234 (2013).</li><li>Schneider, D., Lenski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+insertion+sequence+elements+during+experimental+evolution+of+bacteria.">Dynamics of insertion sequence elements during experimental evolution of bacteria.</a> Research in Microbiology. 155 (5), 319-327 (2004).</li><li>Chao, L., Vargas, C., Spear, B. B., Cox, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposable+elements+as+mutator+genes+in+evolution.">Transposable elements as mutator genes in evolution.</a> Nature. 303 (5918), 633-635 (1983).</li><li>Coufal, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L1+retrotransposition+in+human+neural+progenitor+cells.">L1 retrotransposition in human neural progenitor cells.</a> Nature. 460 (7259), 1127-1131 (2009).</li><li>Kano, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L1+retrotransposition+occurs+mainly+in+embryogenesis+and+creates+somatic+mosaicism.">L1 retrotransposition occurs mainly in embryogenesis and creates somatic mosaicism.</a> Genes &amp; Development. 23 (11), 1303-1312 (2009).</li><li>Belancio, V. P., Deininger, P. L., Roy-Engel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LINE+dancing+in+the+human+genome:+transposable+elements+and+disease.">LINE dancing in the human genome: transposable elements and disease.</a> Genome Medicine. 1 (10), 97 (2009).</li><li>Goodier, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrotransposition+in+tumors+and+brains.">Retrotransposition in tumors and brains.</a> Mobile DNA. 5, 11 (2014).</li><li>Kim, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+transposable+element+activity+in+individual+live+cells.">Real-time transposable element activity in individual live cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (26), 7278-7283 (2016).</li><li>Lutz, R., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+and+tight+regulation+of+transcriptional+units+in+Escherichia+coli+via+the+LacR/O,+the+TetR/O+and+AraC/I1-I2+regulatory+elements.">Independent and tight regulation of transcriptional units in Escherichia coli via the LacR/O, the TetR/O and AraC/I1-I2 regulatory elements.</a> Nucleic Acids Research. 25 (6), 1203-1210 (1997).</li><li>Calos, M. P., Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA+sequence+change+resulting+from+the+IQ1+mutation,+which+greatly+increases+promoter+strength.">The DNA sequence change resulting from the IQ1 mutation, which greatly increases promoter strength.</a> Molecular and General Genetics MGG. 183 (3), 559-560 (1981).</li><li>Markwardt, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+cerulean+fluorescent+protein+with+enhanced+brightness+and+reduced+reversible+photoswitching.">An improved cerulean fluorescent protein with enhanced brightness and reduced reversible photoswitching.</a> PLoS One. 6 (3), 17896 (2011).</li><li>Nagai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+variant+of+yellow+fluorescent+protein+with+fast+and+efficient+maturation+for+cell-biological+applications.">A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications.</a> Nature Biotechnology. 20 (1), 87-90 (2002).</li><li>Kersulyte, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposable+element+ISHp608+of+Helicobacter+pylori:+nonrandom+geographic+distribution,+functional+organization,+and+insertion+specificity.">Transposable element ISHp608 of Helicobacter pylori: nonrandom geographic distribution, functional organization, and insertion specificity.</a> Journal of Bacteriology. 184 (4), 992-1002 (2002).</li><li>Shmakov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+evolution+of+class+2+CRISPR-Cas+systems.">Diversity and evolution of class 2 CRISPR-Cas systems.</a> Nature Reviews Microbiology. 15 (3), 169-182 (2017).</li><li>Bao, W., Jurka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologues+of+bacterial+TnpB_IS605+are+widespread+in+diverse+eukaryotic+transposable+elements.">Homologues of bacterial TnpB_IS605 are widespread in diverse eukaryotic transposable elements.</a> Mobile DNA. 4 (1), 12 (2013).</li><li>Siguier, P., Gourbeyre, E., Chandler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+insertion+sequences:+their+genomic+impact+and+diversity.">Bacterial insertion sequences: their genomic impact and diversity.</a> FEMS Microbiology Reviews. 38 (5), 865-891 (2014).</li><li>Altae-Tran, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+widespread+IS200/IS605+transposon+family+encodes+diverse+programmable+RNA-guided+endonucleases.">The widespread IS200/IS605 transposon family encodes diverse programmable RNA-guided endonucleases.</a> Science. 374 (6563), 57-65 (2021).</li><li>Karvelis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon-associated+TnpB+is+a+programmable+RNA-guided+DNA+endonuclease.">Transposon-associated TnpB is a programmable RNA-guided DNA endonuclease.</a> Nature. 599 (7886), 692-696 (2021).</li><li>Kaur, D., Kuhlman, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IS200/IS605+family-associated+TnpB+increases+transposon+activity+and+retention.">IS200/IS605 family-associated TnpB increases transposon activity and retention.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Benson, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GenBank.">GenBank.</a> Nucleic Acids Research. 41, 36-42 (2013).</li><li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+monomeric+red,+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein.">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Ton-Hoang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Stranded+DNA+transposition+is+coupled+to+host+replication.">Single-Stranded DNA transposition is coupled to host replication.</a> Cell. 142 (3), 398-408 (2010).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+growth+of+Escherichia+coli.">Robust growth of Escherichia coli.</a> Current Biology. 20 (12), 1099-1103 (2010).</li></ol>

השיטה הייחודית המוצגת כאן להדמיה בזמן אמת של פעילות אלמנטים הניתנים להעברה בתאים חיים היא בדיקה רגישה שיכולה לזהות ישירות טרנספוזיציה בתאים חיים ובזמן אמת ולתאם פעילות זו עם ביטוי של חלבונים נלווים. בעוד שהתפוקה נמוכה מכפי שניתן להשיג בשיטות בתפזורת, שיטה זו משיגה מדידות מפורטות של פעיל?...

אלמנטים הניתנים להעברה (TEs) הם אלמנטים גנטיים המתגייסים בתוך הגנום המארח שלהם על ידי כריתה או זירוז העתקה ואחריה שילוב מחדש של גנום. TEs קיימים בכל תחומי החיים, והטרנספוזיציה בונה מחדש את הגנום המארח, תוך מוטציה של אזורי קידוד ובקרה1. זה יוצר מוטציות ומגוון שממלאים תפקיד חשוב באבולוציה2,3, התפתחות 4,5, וכמה מחלות אנושיות6, כולל סרטן7.
באמצעות מבנים גנטיים חדשניים שמצמידים היבטים של פעילות טרנספוזיציונית לכתבים פלואורסצנטיים, העבודה הקודמת שלנו תיארה את הפיתוח של מערכת ניסיונית המבוססת על TE IS608 החיידקי, נציג של משפחת ה-TEs הנפוצה IS200/IS605, המאפשרת הדמיה בזמן אמת של טרנספוזיציה בתאים חיים בודדים8 (איור 1). מערכת TE מוצגת באיור 1A. ה- TE כולל את רצף קידוד הטרנספוזאז, tnpA, ולצדו קצה שמאלי (LE) וקצה ימין (RE) חזרות פלינדרומיות לא מושלמות (IP), שהן אתרי הזיהוי והכריתה עבור TnpA. tnpA מבוטא באמצעות מקדם PLTetO1, אשר מודחק על ידי מדכא tet והוא inducible עם anhydrotetracycline (aTc)9. ה- TE מפצל את הרצפים -10 ו- -35 של מקדם PlacIQ1 מכונן10 עבור הכתב הכחול mCerulean311. כפי שניתן לראות באיור 1C, כאשר הייצור של tnpA מושרה, ניתן לכרות את ה-TE, מה שמוביל לשיקום המקדם. התא המיוצר מבטא mCerulean3 ופלואורסצנטי כחול. N-terminus של TnpA מתמזג עם הכתב הצהוב ונוס12, ומאפשר מדידה של רמות TnpA על ידי פלואורסצנציה צהובה.
IS608 וחברים אחרים במשפחת הטרנספוזונים IS200/IS605 מקודדים בדרך כלל גם גן שני של הפונקציה הלא ידועה עד כה, tnpB13. חלבוני TnpB הם משפחה שופעת מאוד אך מאופיינת באופן לא מושלם של נוקלאזות המקודדות על ידי מספר TEs 14,15 חיידקי וארכאי, שלעתים קרובות מורכבים מ-tnpB16 בלבד. יתר על כן, מחקרים אחרונים חידשו את העניין ב-TnpB בכך שמצאו כי TnpB מתפקד כאנדונוקלאז מונחה RNA מונחה קריספר/Cas הניתן לתכנות אשר יניב הפסקות dsDNA או ssDNA בתנאים מגוונים17,18. עם זאת, עדיין לא ברור איזה תפקיד TnpB עשוי למלא בוויסות הטרנספוזיציה. כדי לבצע הדמיה בזמן אמת של ההשפעות של TnpB על טרנספוזיציה של IS608, נוצרה גרסה של הטרנספוזון, כולל אזור הקידוד של TnpB עם היתוך N-מסוף לחלבון הפלואורסצנטי האדום mCherry.
כהשלמה למחקרים מפורטים יותר ברמת תפזורת שבוצעו על ידי מעבדת Kuhlman19, הוא הראה כאן כיצד הדמיה בזמן אמת של פעילות טרנספוזון יכולה לחשוף באופן כמותי את ההשפעה של TnpB או כל חלבון עזר אחר על דינמיקה טרנספוזיציונית. על ידי מיזוג TnpB ל-mCherry, האירועים הטרנספוזיציוניים הבודדים מזוהים על ידי פלואורסצנציה כחולה ומתואמים עם רמות הביטוי של TnpA (פלואורסצנציה צהובה) ו- TnpB (פלואורסצנציה אדומה).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2 Ton Clear Epoxy</td>
			<td>Devcon</td>
			<td>31345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>AX1385-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrotetracycline hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>37919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Argon Laser</td>
			<td>Melles Griot</td>
			<td>35-IMA-840-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue Filter Cube</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>Ex: Z457/10X, Em: ET485/30M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti-E Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Discontinued</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 0.1 to 10 &#181;L, Length: 3.4 cm, 1.33 in., PP (Polypropylene)</td>
			<td>Eppendorf North America Biotools</td>
			<td>22491504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 50 to 1000 &#181;L, Length: 7.1 cm, 2.79 in., PP (Polypropylene)</td>
			<td>Eppendorf North America Biotools</td>
			<td>22491555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrous Sulfate Acs 500 g</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>706834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Fiji (imagej.net)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher BioReagents&#160;LB Broth, Miller (Granulated)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9723-2&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Cover Slide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-542B&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1355006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate Cert Ac</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>XXM63SP3KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Heater</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>96810-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17001H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProScan III Stage</td>
			<td>Prior</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Filter Cube</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>Ex: ET560/40X, Em: ET645/75M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sapphire 561 LP Laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>1170412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide, Microscope</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>125535B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine Hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich (SIAL)</td>
			<td>T1270-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti-LU4 Laser Launch</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yellow Filter Cube</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>Ex: Z514/10X, Em: ET535/30M</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time quantification of the effects of is200/is605 family-associated tnpb on transposon activity

כאן, מתווה פרוטוקול לביצוע הדמיה חיה בזמן אמת של פעילות אלמנטים הניתנים להעברה בתאי חיידקים חיים באמצעות חבילה של כתבים פלואורסצנטיים המצומדים לטרנספוזיציה. בפרט, הוא מדגים כיצד ניתן להשתמש בהדמיה בזמן אמת כדי להעריך את ההשפעות של חלבון האביזר TnpB על הפעילות של האלמנט הניתן להעברה IS608, חבר במשפחת IS200/IS605 של אלמנטים הניתנים להעברה. משפחת IS200/IS605 של יסודות הניתנים להעברה הם שפע של יסודות ניידים המחוברים לאחד הגנים הרבים ביותר שנמצאו בטבע, tnpB. הומולוגיות של רצף מציעות כי חלבון TnpB עשוי להיות קודמן אבולוציוני למערכות CRISPR/Cas9. בנוסף, TnpB זכה להתעניינות מחודשת, לאחר שהוכח כי הוא פועל כאנדונוקלאז דנ"א מונחה RNA דמוי Cas. ההשפעות של TnpB על שיעורי הטרנספוזיציה של IS608 ניתנות לכימות, והוכח כי הביטוי של TnpB של IS608 גורם לפעילות טרנספוזון מוגברת של ~5x בהשוואה לתאים ללא ביטוי TnpB.

שיטה זו של הדמיה של פעילות טרנספוזון בתאים חיים על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, תוך תפוקה נמוכה יותר מאשר מדידות פלואורסצנטיות בתפזורת, מאפשרת הדמיה ישירה של פעילות טרנספוזון בתאים חיים בודדים. אירועי כריתה של טרנספוזון גורמים לבנייה מחדש של מקדם ה-mCerulean3 (איור 1), מה שמאפשר זיהוי של תאים ?...

Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Quantification of the Effects of IS200/IS605 Family-Associated TnpB on Transposon Activity at JoVE.com

Real-Time Quantification of the Effects of IS200/IS605 Family-Associated TnpB on Transposon Activity

פרוטוקול מתואר לביצוע הדמיה חיה בזמן אמת כדי לכמת כיצד חלבון האביזר TnpB משפיע על הדינמיקה של טרנספוזיציה בתאי Escherichia coli חיים בודדים.

כימות בזמן אמת של ההשפעות של TnpB הקשור למשפחת IS200/IS605 על פעילות טרנספוזון

Here, a protocol is outlined to perform live, real-time imaging of transposable element activity in live bacterial cells using a suite of fluorescent ...

פרוטוקול זה מאפשר לנו לכמת סטטיסטיקות כריתה על בסיס תא בודד, בניגוד להסתכלות על התנהגות בתפזורת. ברמה זו, אנו יכולים לעקוב אחר ההתנהגות של תאים בודדים לאורך זמן, כולל רמות ה-TnpA וה-TnpB שלהם עבור תאים שנכנסים לעומת תאים שלא, מה שיכול לאפשר לנו, למשל, למדוד את ההשפעות של אירועים מוטציוניים מזוהים על קצב הגדילה. שיטה זו היא דרך פשוטה וזולה למדוד דינמיקה של מוטציות בתאים חיים.הגישה הכללית ישימה לכל מערכת הדורשת הדמיה פלואורסצנטית של תאים חיים. הכינו שקופית על ידי הרתחת M63 עם 0.5% גלוקוז ו-1.5% אגרוז במיקרוגל כדי להמיס את האגרוז. ודא כי המדיום הוא נמס לחלוטין מעורבב היטב.תנו לתערובת להתקרר ל-55 מעלות צלזיוס לפני הוספת אנטיביוטיקה ומשרה. הנח שקופית מיקרוסקופ על שולחן העבודה. ערימת שקופית אחת בניצב לשקופית הראשונה.ודא שיש רווח השווה לעובי שקופית אחת בין השקופית התחתונה לשקופית העליונה. פיפטה מיליליטר אחד של תערובת האגרוז M63 לתוך המרווח בין המגלשה באיטיות ליצירת ריבוע ג'ל קטן. לאחר שהג'ל התמצק, החלק את השקופית העליונה כדי להסיר אותו.גזרו את כרית האגרוז בעזרת סכין גילוח או סכין. לאחר מכן, פיפטה 2.5 microliters של תרבית חיידקים ולשים את הכיסוי להחליק על גבי. אטמו את הרווח בין המגלשה למכסה באמצעות אפוקסי.תנו לאפוקסי להתייבש ולתאים להתיישב על כרית האגרוז למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. מניחים את הדגימה המוכנה על מיקרוסקופ פלואורסצנטי בסביבה מחוממת ומתוחזקת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. עבור כל אורך גל, מצא את שדה הראייה המכיל פלואורסצנציה מינימלית.הגדר פרוטוקול להשגת תמונות ברשת באורכי גל שונים ובמרווחי זמן קבועים. אירועי כריתה של טרנספוזון גורמים לבנייה מחדש של המקדם עבור mCerulean3, ומאפשרים זיהוי של תאים העוברים פעילות טרנספוזון על ידי פלואורסצנציה כחולה בהירה. TnpB משפר את קצב כריתת הטרנספוזון.תאים המבטאים חלבון אביזר TnpB חווים רמות גבוהות פי ארבעה עד חמישה של פעילות טרנספוזון בהשוואה לתאים שליליים ל-TnpB. בתאים חיוביים ל-TnpB, לתאים שעוברים אירועי כריתת טרנספוזון יש רמות ביטוי גבוהות יותר של mCherry TnpB מאשר באוכלוסייה הכללית. יתר על כן, עבור תאים העוברים אירועי כריתה, תאים חיוביים ל-TnpB מבטאים רק רמות גבוהות יותר באופן שולי של TnpA-טרנספוזאז מאשר תאים שליליים ל-TnpB, שהם גבוהים יותר מהפלואורסצנטיות הצהובה של האוכלוסייה הכללית.המקום הסביר ביותר להיאבק בו הוא בהכנת תרבית התאים לניסוי. עליך לוודא שהתאים גדלים לפאזה מעריכית ושהשקופית מחוסנת במספר מתאים של תאים. זכרו להיזהר מבועות בעת איטום המגלשה כדי שג'ל האגרוז לא יתייבש.

Research

JoVE Journal

Biology

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

כמותי Real-Time PCR באמצעות המדעית Thermo Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

ניתוח של ביטוי גנים בורר אש אמרלד ( Agrilus planipennis) באמצעות Real Time-PCR כמותי

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

סריג מיקרוסקופי לניטור בזמן אמת של אירועי איתות בתאים חיים באמצעות Biosensors Unimolecular

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons

כמותי, בזמן אמת, ניתוח של פעילות כריתת מאגר תיקון lysates סלולריים ניצול הנגע ספציפיים משואות מולקולרית

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base ...

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

ניתוח בזמן אמת של תעבורת רטינול ידי הקולטן ממברנה של חלבון מחייב פלזמת רטינול

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

תאי יונקים האוטונומיים bioluminescent לניטור רציף וזמן אמת של Cytotoxicity

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

מדידות בזמן אמת של חלבון ממברנה: קולט אינטראקציות שימוש תהודה Plasmon Surface (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

בזמן אמת המבוסס על הבדיקה PCR גישות למדידת כמותית של מיקרו-רנ&quot;א

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

הדמיה של Dynamics שטח תא הצמח עם זווית משתנה epifluorescence מיקרוסקופית בזמן אמת

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

A Method to Assess Bacteriocin Effects on the Gut Microbiota of Mice

שיטה להעריך אפקטים Bacteriocin על מיקרוביוטה המעיים של עכברים

Very intriguing questions arise with our advancing knowledge on gut microbiota composition and the relationship with health, particularly relating to the ...