Name: real-time quantification of the effects of is200/is605 family-associated tnpb on transposon activity
Uploaded: 2023-01-20T13:40:00
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この研究への財政的支援は、カリフォルニア大学のスタートアップ資金によって提供されました。

1.細菌培養物の調製
<ol><li>プラスミドトランスポゾン構築物(Kimら8で前述)を含む大腸菌株MG1655を、適切な抗生物質(25 μg/mLのカナマイシン、材料の表を参照)を含むLB中で37°Cで一晩増殖させます。 注:使用されるコンストラクトの配列および関連する配列は、GenBank20 アクセッション番号OP581959、OP581957、OP581958、OP717084、およ...

<ol>
	<li>Cowley, M., Oakey, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposable+elements+re-wire+and+fine-tune+the+transcriptome.">Transposable elements re-wire and fine-tune the transcriptome.</a> PLoS Genetics. 9 (1), 1003234 (2013).</li><li>Schneider, D., Lenski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+insertion+sequence+elements+during+experimental+evolution+of+bacteria.">Dynamics of insertion sequence elements during experimental evolution of bacteria.</a> Research in Microbiology. 155 (5), 319-327 (2004).</li><li>Chao, L., Vargas, C., Spear, B. B., Cox, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposable+elements+as+mutator+genes+in+evolution.">Transposable elements as mutator genes in evolution.</a> Nature. 303 (5918), 633-635 (1983).</li><li>Coufal, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L1+retrotransposition+in+human+neural+progenitor+cells.">L1 retrotransposition in human neural progenitor cells.</a> Nature. 460 (7259), 1127-1131 (2009).</li><li>Kano, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L1+retrotransposition+occurs+mainly+in+embryogenesis+and+creates+somatic+mosaicism.">L1 retrotransposition occurs mainly in embryogenesis and creates somatic mosaicism.</a> Genes &amp; Development. 23 (11), 1303-1312 (2009).</li><li>Belancio, V. P., Deininger, P. L., Roy-Engel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LINE+dancing+in+the+human+genome:+transposable+elements+and+disease.">LINE dancing in the human genome: transposable elements and disease.</a> Genome Medicine. 1 (10), 97 (2009).</li><li>Goodier, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrotransposition+in+tumors+and+brains.">Retrotransposition in tumors and brains.</a> Mobile DNA. 5, 11 (2014).</li><li>Kim, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+transposable+element+activity+in+individual+live+cells.">Real-time transposable element activity in individual live cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (26), 7278-7283 (2016).</li><li>Lutz, R., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+and+tight+regulation+of+transcriptional+units+in+Escherichia+coli+via+the+LacR/O,+the+TetR/O+and+AraC/I1-I2+regulatory+elements.">Independent and tight regulation of transcriptional units in Escherichia coli via the LacR/O, the TetR/O and AraC/I1-I2 regulatory elements.</a> Nucleic Acids Research. 25 (6), 1203-1210 (1997).</li><li>Calos, M. P., Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA+sequence+change+resulting+from+the+IQ1+mutation,+which+greatly+increases+promoter+strength.">The DNA sequence change resulting from the IQ1 mutation, which greatly increases promoter strength.</a> Molecular and General Genetics MGG. 183 (3), 559-560 (1981).</li><li>Markwardt, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+cerulean+fluorescent+protein+with+enhanced+brightness+and+reduced+reversible+photoswitching.">An improved cerulean fluorescent protein with enhanced brightness and reduced reversible photoswitching.</a> PLoS One. 6 (3), 17896 (2011).</li><li>Nagai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+variant+of+yellow+fluorescent+protein+with+fast+and+efficient+maturation+for+cell-biological+applications.">A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications.</a> Nature Biotechnology. 20 (1), 87-90 (2002).</li><li>Kersulyte, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposable+element+ISHp608+of+Helicobacter+pylori:+nonrandom+geographic+distribution,+functional+organization,+and+insertion+specificity.">Transposable element ISHp608 of Helicobacter pylori: nonrandom geographic distribution, functional organization, and insertion specificity.</a> Journal of Bacteriology. 184 (4), 992-1002 (2002).</li><li>Shmakov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+evolution+of+class+2+CRISPR-Cas+systems.">Diversity and evolution of class 2 CRISPR-Cas systems.</a> Nature Reviews Microbiology. 15 (3), 169-182 (2017).</li><li>Bao, W., Jurka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologues+of+bacterial+TnpB_IS605+are+widespread+in+diverse+eukaryotic+transposable+elements.">Homologues of bacterial TnpB_IS605 are widespread in diverse eukaryotic transposable elements.</a> Mobile DNA. 4 (1), 12 (2013).</li><li>Siguier, P., Gourbeyre, E., Chandler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+insertion+sequences:+their+genomic+impact+and+diversity.">Bacterial insertion sequences: their genomic impact and diversity.</a> FEMS Microbiology Reviews. 38 (5), 865-891 (2014).</li><li>Altae-Tran, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+widespread+IS200/IS605+transposon+family+encodes+diverse+programmable+RNA-guided+endonucleases.">The widespread IS200/IS605 transposon family encodes diverse programmable RNA-guided endonucleases.</a> Science. 374 (6563), 57-65 (2021).</li><li>Karvelis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon-associated+TnpB+is+a+programmable+RNA-guided+DNA+endonuclease.">Transposon-associated TnpB is a programmable RNA-guided DNA endonuclease.</a> Nature. 599 (7886), 692-696 (2021).</li><li>Kaur, D., Kuhlman, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IS200/IS605+family-associated+TnpB+increases+transposon+activity+and+retention.">IS200/IS605 family-associated TnpB increases transposon activity and retention.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Benson, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GenBank.">GenBank.</a> Nucleic Acids Research. 41, 36-42 (2013).</li><li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+monomeric+red,+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein.">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Ton-Hoang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Stranded+DNA+transposition+is+coupled+to+host+replication.">Single-Stranded DNA transposition is coupled to host replication.</a> Cell. 142 (3), 398-408 (2010).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+growth+of+Escherichia+coli.">Robust growth of Escherichia coli.</a> Current Biology. 20 (12), 1099-1103 (2010).</li></ol>

生細胞における転移因子活性のリアルタイムイメージングのためにここで紹介するユニークな方法は、生細胞における転位をリアルタイムで直接検出し、この活性をアクセサリータンパク質の発現と相関させることができる高感度アッセイです。スループットはバルク法で達成できるよりも低くなりますが、この方法では個々の生細胞におけるTE活性とタンパク質発現の詳細な測定が可能に?...

転移要素(TE)は、切除または触媒コピーとそれに続くゲノム再統合によって宿主ゲノム内で動員される遺伝的要素です。TEは生命のすべてのドメインに存在し、転位は宿主ゲノムを再構築し、コード領域と制御領域を変異させます1。これにより、進化2,3、発生4,5、および癌7を含むいくつかのヒト疾患6において重要な役割を果たす突然変異と多様性が生成されます。
転位活性の側面を蛍光レポーターに結合する新しい遺伝子構築物を使用して、私たちの以前の研究では、広く普及しているIS200/IS605ファミリーのTEファミリーの代表である細菌TE IS608に基づく実験システムの開発について説明しました。 TE システムを図 1A に示します。TEは、トランスポザーゼコード配列tnpAで構成され、TnpAの認識部位と切除部位である左端(LE)と右端(RE)の不完全な回文反復(IP)が挟まれています。tnpAは、テットリプレッサーによって抑制され、アンヒドロテトラサイクリン(aTc)9で誘導されるプロモーターPLTetO1を用いて発現されます。TEは、構成的PlacIQ1プロモーター10の-10および-35配列を青色レポーターmCerulean311のために分割する。図1Cに示すように、tnpAの産生が誘導されると、TEを切除することができ、プロモーター再構成につながる。産生された細胞はmCerulean3を発現し、青色を発する。TnpAのN末端は黄色レポーターVenus12に融合しており、黄色蛍光によるTnpAレベルの測定が可能です。
IS608およびIS200/IS605ファミリーのトランスポゾンの他のメンバーも、これまで知られていなかった機能の2番目の遺伝子であるtnpB13を典型的にコードする。TnpBタンパク質は、非常に豊富ではあるが不完全に特徴付けられたヌクレアーゼファミリーであり、いくつかの細菌および古細菌のTE14,15によってコードされており、多くの場合tnpB16のみで構成されています。さらに、最近の研究では、TnpBがCRISPR/Cas様プログラマブルRNAガイドエンドヌクレアーゼとして機能し、さまざまな条件下でdsDNAまたはssDNA切断のいずれかを生成することを発見することにより、TnpBへの関心が新たになっています17,18。しかし、転位の調節においてTnpBがどのような役割を果たすかは不明である。IS608転位に対するTnpBの影響をリアルタイムで可視化するために、赤色蛍光タンパク質mCherryへのN末端融合を有するTnpBのコード領域を含むトランスポゾンのバージョンが作成された。
Kuhlman lab19によって実施されたより詳細なバルクレベルの研究を補完するために、トランスポゾン活性のリアルタイムイメージングが転位ダイナミクスに対するTnpBまたは他のアクセサリータンパク質の影響を定量的に明らかにする方法がここで示されています。TnpBをmCherryに融合させることにより、個々の転位事象を青色蛍光によって同定し、TnpA(黄色蛍光)およびTnpB(赤色蛍光)の発現レベルと相関させる。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2 Ton Clear Epoxy</td>
			<td>Devcon</td>
			<td>31345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>AX1385-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrotetracycline hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>37919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Argon Laser</td>
			<td>Melles Griot</td>
			<td>35-IMA-840-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue Filter Cube</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>Ex: Z457/10X, Em: ET485/30M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti-E Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Discontinued</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 0.1 to 10 &#181;L, Length: 3.4 cm, 1.33 in., PP (Polypropylene)</td>
			<td>Eppendorf North America Biotools</td>
			<td>22491504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 50 to 1000 &#181;L, Length: 7.1 cm, 2.79 in., PP (Polypropylene)</td>
			<td>Eppendorf North America Biotools</td>
			<td>22491555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrous Sulfate Acs 500 g</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>706834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Fiji (imagej.net)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher BioReagents&#160;LB Broth, Miller (Granulated)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9723-2&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Cover Slide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-542B&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1355006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate Cert Ac</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>XXM63SP3KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Heater</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>96810-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17001H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProScan III Stage</td>
			<td>Prior</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Filter Cube</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>Ex: ET560/40X, Em: ET645/75M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sapphire 561 LP Laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>1170412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide, Microscope</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>125535B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine Hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich (SIAL)</td>
			<td>T1270-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti-LU4 Laser Launch</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yellow Filter Cube</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>Ex: Z514/10X, Em: ET535/30M</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time quantification of the effects of is200/is605 family-associated tnpb on transposon activity

ここでは、転位に結合された一連の蛍光レポーターを使用して、生細菌細胞における転移因子活性のライブリアルタイムイメージングを実行するためのプロトコルの概要を説明します。特に、トランスポーズ可能なエレメントのIS200/IS605ファミリーのメンバーであるトランスポザブルエレメントIS608の活性に対するアクセサリータンパク質TnpBの影響を評価するために、リアルタイムイメージングをどのように使用できるかを示しています。IS200/IS605ファミリーの転移性エレメントは、自然界に見られる最も無数の遺伝子の1つであるtnpBと結合した豊富な可動エレメントです。配列相同性は、TnpBタンパク質がCRISPR/Cas9システムの進化的前駆体である可能性があることを示唆しています。さらに、TnpBは、Cas様RNA誘導DNAエンドヌクレアーゼとして作用することが示され、新たな関心を集めています。IS608の転位率に対するTnpBの効果は定量化され、IS608のTnpBの発現は、TnpB発現を欠く細胞と比較してトランスポゾン活性を~5倍増加させることが実証されています。

生細胞中のトランスポゾン活性を蛍光顕微鏡で可視化するこの方法は、バルク蛍光測定よりもスループットは低いものの、個々の生細胞におけるトランスポゾン活性を直接可視化することができます。トランスポゾン切除イベントはmCerulean3のプロモーターの再構成をもたらし(図1)、明るい青色蛍光によってトランスポゾン活性を受けている細胞を同定することができます(図</...

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Real-Time Quantification of the Effects of IS200/IS605 Family-Associated TnpB on Transposon Activity

アクセサリータンパク質TnpBが個々の生きた 大腸菌 細胞の転位のダイナミクスにどのように影響するかを定量化するために、ライブリアルタイムイメージングを実行するためのプロトコルが概説されています。

トランスポゾン活性に対するIS200/IS605ファミリー関連TnpBの影響のリアルタイム定量

Here, a protocol is outlined to perform live, real-time imaging of transposable element activity in live bacterial cells using a suite of fluorescent ...

このプロトコルにより、バルク挙動を調べるのではなく、単一細胞ベースで切除統計を定量化することができます。このレベルでは、切除する細胞と切除しない細胞のTnpAおよびTnpBレベルなど、個々の細胞の挙動を経時的に追跡できるため、たとえば、特定された突然変異イベントが成長率に及ぼす影響を測定できます。この方法は、生細胞の突然変異動態を測定するための簡単で低コストな方法です。一般的なアプローチは、生細胞蛍光イメージングを必要とするあらゆるシステムに適用できます。M63を電子レンジで0.5%グルコースと1.5%アガロースで沸騰させてアガロースを溶かしてスライドを準備します。培地が完全に溶け、よく混合されていることを確認してください。抗生物質と誘導剤を加える前に、混合物を摂氏55度に冷ましてください。顕微鏡スライドを作業台に置きます。1 つのスライドを最初のスライドと垂直に積み重ねます。下部スライドと上部スライドの間にスライドの厚さが 1 つ等しい隙間があることを確認します。1ミリリットルのM63アガロース混合物をスライド間の隙間にゆっくりとピペットで入れ、小さなゲルの正方形を作り出した。ゲルが固まったら、上部のスライドをスライドさせて取り除きます。かみそりの刃またはナイフでアガロースパッドを切り取ります。次に、2.5マイクロリットルの細菌培養物をピペットで入れ、カバースリップを上に置きます。スライドとカバースリップの間のスペースをエポキシでシールします。エポキシを乾燥させ、細胞を摂氏37度で1時間アガロースパッドに沈降させます。調製したサンプルを、摂氏37度に加熱・維持した環境下で蛍光顕微鏡上に置きます。各波長について、最小蛍光を含む視野を見つけます。グリッド内の画像を異なる波長で一定の時間間隔で取得するためのプロトコルを設定します。トランスポゾン切除イベントは、mCerulean3のプロモーターの再構成をもたらし、明るい青色蛍光によってトランスポゾン活性を受けている細胞の同定を可能にします。TnpBはトランスポゾン切除率を高めます。アクセサリータンパク質TnpBを発現する細胞は、TnpB陰性細胞と比較して4〜5倍高いレベルのトランスポゾン活性を経験します。TnpB陽性細胞において、トランスポゾン切除事象を受けている細胞は、一般集団よりもmCherry TnpBの発現レベルが高い。さらに、切除イベントを受けている細胞の場合、TnpB陽性細胞はTnpB陰性細胞よりもわずかに高いレベルの静脈TnpAトランスポザーゼしか発現せず、これは一般集団の黄色蛍光よりも高い。苦労する可能性が最も高いのは、実験のための細胞培養の準備です。細胞が指数関数的に成長していること、およびスライドに適切な数の細胞が接種されていることを確認する必要があります。スライドを密封するときは、アガロースゲルが乾かないように気泡に注意してください。

Research

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Biology

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