Name: real-time quantification of the effects of is200/is605 family-associated tnpb on transposon activity
Uploaded: 2023-01-20T13:40:00
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이 연구에 대한 재정 지원은 캘리포니아 대학의 창업 자금으로 제공되었습니다.

1. 세균 배양의 제조
<ol><li>플라스미드 트랜스포존 구축물(Kim et al.8에 이전에 기술됨)로 대장균 균주 MG1655를 LB에서 적절한 항생제(카나마이신 25μg/mL, 재료 표 참조)와 함께 37°C에서 밤새 성장시킵니다. 참고: 사용된 구축물의 서열 및 관련 서열은 GenBank20 수탁 번호 OP581959, OP581957, OP581958, OP717084 및 OP717085로서 입수가능하다.</li...

<ol>
	<li>Cowley, M., Oakey, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposable+elements+re-wire+and+fine-tune+the+transcriptome.">Transposable elements re-wire and fine-tune the transcriptome.</a> PLoS Genetics. 9 (1), 1003234 (2013).</li><li>Schneider, D., Lenski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+insertion+sequence+elements+during+experimental+evolution+of+bacteria.">Dynamics of insertion sequence elements during experimental evolution of bacteria.</a> Research in Microbiology. 155 (5), 319-327 (2004).</li><li>Chao, L., Vargas, C., Spear, B. B., Cox, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposable+elements+as+mutator+genes+in+evolution.">Transposable elements as mutator genes in evolution.</a> Nature. 303 (5918), 633-635 (1983).</li><li>Coufal, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L1+retrotransposition+in+human+neural+progenitor+cells.">L1 retrotransposition in human neural progenitor cells.</a> Nature. 460 (7259), 1127-1131 (2009).</li><li>Kano, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L1+retrotransposition+occurs+mainly+in+embryogenesis+and+creates+somatic+mosaicism.">L1 retrotransposition occurs mainly in embryogenesis and creates somatic mosaicism.</a> Genes &amp; Development. 23 (11), 1303-1312 (2009).</li><li>Belancio, V. P., Deininger, P. L., Roy-Engel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LINE+dancing+in+the+human+genome:+transposable+elements+and+disease.">LINE dancing in the human genome: transposable elements and disease.</a> Genome Medicine. 1 (10), 97 (2009).</li><li>Goodier, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrotransposition+in+tumors+and+brains.">Retrotransposition in tumors and brains.</a> Mobile DNA. 5, 11 (2014).</li><li>Kim, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+transposable+element+activity+in+individual+live+cells.">Real-time transposable element activity in individual live cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (26), 7278-7283 (2016).</li><li>Lutz, R., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+and+tight+regulation+of+transcriptional+units+in+Escherichia+coli+via+the+LacR/O,+the+TetR/O+and+AraC/I1-I2+regulatory+elements.">Independent and tight regulation of transcriptional units in Escherichia coli via the LacR/O, the TetR/O and AraC/I1-I2 regulatory elements.</a> Nucleic Acids Research. 25 (6), 1203-1210 (1997).</li><li>Calos, M. P., Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA+sequence+change+resulting+from+the+IQ1+mutation,+which+greatly+increases+promoter+strength.">The DNA sequence change resulting from the IQ1 mutation, which greatly increases promoter strength.</a> Molecular and General Genetics MGG. 183 (3), 559-560 (1981).</li><li>Markwardt, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+cerulean+fluorescent+protein+with+enhanced+brightness+and+reduced+reversible+photoswitching.">An improved cerulean fluorescent protein with enhanced brightness and reduced reversible photoswitching.</a> PLoS One. 6 (3), 17896 (2011).</li><li>Nagai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+variant+of+yellow+fluorescent+protein+with+fast+and+efficient+maturation+for+cell-biological+applications.">A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications.</a> Nature Biotechnology. 20 (1), 87-90 (2002).</li><li>Kersulyte, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposable+element+ISHp608+of+Helicobacter+pylori:+nonrandom+geographic+distribution,+functional+organization,+and+insertion+specificity.">Transposable element ISHp608 of Helicobacter pylori: nonrandom geographic distribution, functional organization, and insertion specificity.</a> Journal of Bacteriology. 184 (4), 992-1002 (2002).</li><li>Shmakov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+evolution+of+class+2+CRISPR-Cas+systems.">Diversity and evolution of class 2 CRISPR-Cas systems.</a> Nature Reviews Microbiology. 15 (3), 169-182 (2017).</li><li>Bao, W., Jurka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologues+of+bacterial+TnpB_IS605+are+widespread+in+diverse+eukaryotic+transposable+elements.">Homologues of bacterial TnpB_IS605 are widespread in diverse eukaryotic transposable elements.</a> Mobile DNA. 4 (1), 12 (2013).</li><li>Siguier, P., Gourbeyre, E., Chandler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+insertion+sequences:+their+genomic+impact+and+diversity.">Bacterial insertion sequences: their genomic impact and diversity.</a> FEMS Microbiology Reviews. 38 (5), 865-891 (2014).</li><li>Altae-Tran, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+widespread+IS200/IS605+transposon+family+encodes+diverse+programmable+RNA-guided+endonucleases.">The widespread IS200/IS605 transposon family encodes diverse programmable RNA-guided endonucleases.</a> Science. 374 (6563), 57-65 (2021).</li><li>Karvelis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon-associated+TnpB+is+a+programmable+RNA-guided+DNA+endonuclease.">Transposon-associated TnpB is a programmable RNA-guided DNA endonuclease.</a> Nature. 599 (7886), 692-696 (2021).</li><li>Kaur, D., Kuhlman, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IS200/IS605+family-associated+TnpB+increases+transposon+activity+and+retention.">IS200/IS605 family-associated TnpB increases transposon activity and retention.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Benson, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GenBank.">GenBank.</a> Nucleic Acids Research. 41, 36-42 (2013).</li><li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+monomeric+red,+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein.">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Ton-Hoang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Stranded+DNA+transposition+is+coupled+to+host+replication.">Single-Stranded DNA transposition is coupled to host replication.</a> Cell. 142 (3), 398-408 (2010).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+growth+of+Escherichia+coli.">Robust growth of Escherichia coli.</a> Current Biology. 20 (12), 1099-1103 (2010).</li></ol>

살아있는 세포에서 전치 가능한 요소 활성의 실시간 이미징을 위해 여기에 제시된 고유한 방법은 살아있는 세포에서 실시간으로 전이를 직접 감지하고 이 활성을 보조 단백질의 발현과 연관시킬 수 있는 민감한 분석입니다. 처리량은 벌크 방법으로 달성할 수 있는 것보다 낮지만 이 방법은 개별 살아있는 세포에서 TE 활성 및 단백질 발현을 자세히 측정합니다.
실시간 이미징...

전치 가능한 요소(TE)는 절제 또는 촉매 복제에 이어 게놈 재통합에 의해 숙주 게놈 내에서 동원되는 유전 요소입니다. TE는 생명의 모든 영역에 존재하며, 전위는 숙주 게놈을 재구성하여 코딩 및 제어 영역을 돌연변이시킵니다1. 이것은 진화 2,3, 발달 4,5 및 암7을 포함한 여러 인간 질병6에서 중요한 역할을 하는 돌연변이와 다양성을 생성합니다.
전위 활성의 측면을 형광 리포터와 결합하는 새로운 유전자 구조를 사용하여 이전 연구에서는 광범위한 IS200/IS605 TE제품군을 대표하는 박테리아 TE IS608을 기반으로 개별살아있는 세포8에서 전이를 실시간으로 시각화할 수 있는 실험 시스템의 개발에 대해 설명했습니다(그림 1). TE 시스템은 그림 1A에 표시되어 있습니다. TE는 TnpA에 대한 인식 및 절제 부위인 좌측 말단(LE) 및 우단(RE) 불완전 회문 반복(IP)에 의해 측면에 있는 트랜스포아제 코딩 서열 tnpA를 포함한다. tnpA는 프로모터 PLTetO1을 사용하여 발현되며, 이는 tet 억제 자에 의해 억제되고 안하이드로 테트라 사이클린 (aTc)9로 유도 될 수 있습니다. TE는 청색 리포터 mCerulean3 11에 대해 구성적PlacIQ1 프로모터 10의 -10 및 -35 서열을 분할한다. 도 1C에 나타낸 바와 같이, tnpA의 생산이 유도될 때, TE는 절제될 수 있고, 프로모터 재구성을 유도할 수 있다. 생성 된 세포는 mCerulean을 발현합니다.3 그리고 청색 형광. TnpA의 N- 말단은 황색 리포터 Venus12에 융합되어 황색 형광으로 TnpA 수준을 측정 할 수 있습니다.
IS608 및 트랜스포존의 IS200/IS605 패밀리의 다른 구성원은 또한 전형적으로 지금까지 알려지지 않은 기능의 제2 유전자인 tnpB13을 암호화한다. TnpB 단백질은 엄청나게 풍부하지만 불완전하게 특성화된 뉴클레아제 계열이며, 이는 종종 tnpB16으로만 구성되는 여러 박테리아 및 고고학 TEs14,15에 의해 암호화됩니다. 또한, 최근 연구는 TnpB가 다양한 조건에서 dsDNA 또는 ssDNA 절단을 생성하는 CRISPR / Cas와 같은 프로그래밍 가능한 RNA 유도 엔도 뉴 클레아 제로서 기능한다는 것을 발견함으로써 TnpB에 대한 관심을 새롭게했습니다17,18. 그러나 TnpB가 전치를 조절하는 데 어떤 역할을 할 수 있는지는 불분명합니다. IS608 전치에 대한 TnpB의 효과에 대한 실시간 시각화를 수행하기 위해 적색 형광 단백질 mCherry에 대한 N- 말단 융합을 갖는 TnpB의 코딩 영역을 포함하는 트랜스포존 버전이 생성되었습니다.
Kuhlman 실험실19에 의해 수행된보다 상세한 벌크 레벨 연구를 보완하여, 트랜스포존 활성의 실시간 이미징이 TnpB 또는 다른 보조 단백질이 전위 역학에 미치는 영향을 정량적으로 밝힐 수있는 방법을 보여줍니다. TnpB를 mCherry에 융합시킴으로써, 개별 전위 사건은 청색 형광에 의해 식별되고 TnpA (황색 형광) 및 TnpB (적색 형광)의 발현 수준과 상관 관계가 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2 Ton Clear Epoxy</td>
			<td>Devcon</td>
			<td>31345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>AX1385-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrotetracycline hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>37919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Argon Laser</td>
			<td>Melles Griot</td>
			<td>35-IMA-840-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue Filter Cube</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>Ex: Z457/10X, Em: ET485/30M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti-E Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Discontinued</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 0.1 to 10 &#181;L, Length: 3.4 cm, 1.33 in., PP (Polypropylene)</td>
			<td>Eppendorf North America Biotools</td>
			<td>22491504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 50 to 1000 &#181;L, Length: 7.1 cm, 2.79 in., PP (Polypropylene)</td>
			<td>Eppendorf North America Biotools</td>
			<td>22491555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrous Sulfate Acs 500 g</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>706834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Fiji (imagej.net)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher BioReagents&#160;LB Broth, Miller (Granulated)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9723-2&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Cover Slide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-542B&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1355006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate Cert Ac</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>XXM63SP3KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Heater</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>96810-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17001H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProScan III Stage</td>
			<td>Prior</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Filter Cube</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>Ex: ET560/40X, Em: ET645/75M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sapphire 561 LP Laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>1170412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide, Microscope</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>125535B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine Hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich (SIAL)</td>
			<td>T1270-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti-LU4 Laser Launch</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yellow Filter Cube</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>Ex: Z514/10X, Em: ET535/30M</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time quantification of the effects of is200/is605 family-associated tnpb on transposon activity

여기서, 프로토콜은 전치에 결합된 형광 리포터 제품군을 사용하여 살아있는 박테리아 세포에서 전치 가능한 요소 활성의 실시간 이미징을 수행하는 것으로 요약됩니다. 특히, 실시간 이미징을 사용하여 보조 단백질 TnpB가 전치 가능한 요소의 IS200/IS605 제품군에 속하는 전치 가능한 요소 IS608의 활성에 미치는 영향을 평가하는 방법을 보여줍니다. IS200/IS605 전치 가능한 요소 계열은 자연에서 발견되는 가장 무수한 유전자 중 하나인 tnpB와 연결된 풍부한 이동 요소입니다. 서열 상동성은 TnpB 단백질이 CRISPR/Cas9 시스템의 진화적 전구체일 수 있음을 시사한다. 또한, TnpB는 Cas-유사 RNA 유도 DNA 엔도뉴클레아제로서 작용하는 것으로 밝혀져 새로운 관심을 받았다. IS608의 전이 속도에 대한 TnpB의 효과가 정량화되고, IS608의 TnpB의 발현이 TnpB 발현이 부족한 세포에 비해 ~ 5 배 증가 된 트랜스포존 활성을 초래한다는 것이 입증되었다.

형광 현미경으로 살아있는 세포에서 트랜스포존 활성을 시각화하는 이 방법은 벌크 형광 측정보다 처리량이 낮기 때문에 개별 살아있는 세포에서 트랜스포존 활성을 직접 시각화할 수 있습니다. 트랜스포존 절제 이벤트는 mCerulean3에 대한 프로모터의 재구성을 초래하여(그림 1), 밝은 파란색 형광에 의해 트랜스포존 활성을 받는 세포를 식별할 수 있습니다(그림 2, TnpB+: 보충...

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Real-Time Quantification of the Effects of IS200/IS605 Family-Associated TnpB on Transposon Activity

보조 단백질 TnpB가 개별 살아있는 대장균 세포의 전이 역학에 어떻게 영향을 미치는지 정량화하기 위해 실시간 이미징을 수행하는 프로토콜이 요약되어 있습니다.

트랜스포존 활성에 대한 IS200/IS605 계열 관련 TnpB의 영향에 대한 실시간 정량화

Here, a protocol is outlined to perform live, real-time imaging of transposable element activity in live bacterial cells using a suite of fluorescent ...

이 프로토콜을 사용하면 대량 거동을 보는 대신 단일 세포 기준으로 절제 통계를 정량화할 수 있습니다. 이 수준에서 우리는 소비하는 세포와 그렇지 않은 세포에 대한 TnpA 및 TnpB 수준을 포함하여 시간 경과에 따른 개별 세포의 행동을 추적할 수 있으며, 이를 통해 예를 들어 확인된 돌연변이 사건이 성장률에 미치는 영향을 측정할 수 있습니다. 이 방법은 살아있는 세포 돌연변이 역학을 측정하는 간단하고 저렴한 방법입니다.일반적인 접근 방식은 라이브 셀 형광 이미징이 필요한 모든 시스템에 적용할 수 있습니다. M63을 전자레인지에 0.5% 포도당과 1.5% 아가로스로 끓여 슬라이드를 준비하여 아가로스를 녹입니다. 배지가 완전히 녹고 잘 혼합되었는지 확인하십시오.항생제와 유도제를 추가하기 전에 혼합물을 섭씨 55도까지 식히십시오. 작업대에 현미경 슬라이드를 놓습니다. 하나의 슬라이드를 첫 번째 슬라이드에 수직으로 쌓습니다.아래쪽 슬라이드와 위쪽 슬라이드 사이에 한 슬라이드 두께와 같은 간격이 있는지 확인합니다. M63 아가로스 혼합물 1 밀리리터를 슬라이드 사이의 틈새에 천천히 피펫팅하여 작은 젤 사각형을 만듭니다. 젤이 굳어지면 상단 슬라이드를 밀어 제거합니다.면도날이나 칼로 아가 로스 패드를 다듬습니다. 이어서, 2.5 마이크로리터의 박테리아 배양물을 피펫팅하고 그 위에 커버 슬립을 놓는다. 슬라이드와 커버 슬립 사이의 공간을 에폭시로 밀봉하십시오.에폭시를 건조시키고 세포를 섭씨 37도에서 1시간 동안 아가로스 패드에 정착시킵니다. 준비된 샘플을 섭씨 37도로 가열되고 유지되는 환경에서 형광 현미경에 놓습니다. 각 파장에 대해 최소 형광을 포함하는 시야를 찾으십시오.서로 다른 파장과 일정한 시간 간격으로 그리드에서 이미지를 수집하도록 프로토콜을 설정합니다. 트랜스포존 절제 이벤트는 mCerulean3에 대한 프로모터의 재구성을 초래하여 밝은 파란색 형광에 의해 트랜스포존 활성을 겪는 세포를 식별할 수 있습니다. TnpB는 트랜스포존 절제 속도를 향상시킵니다.보조 단백질 TnpB를 발현하는 세포는 TnpB 음성 세포에 비해 4-5배 더 높은 수준의 트랜스포존 활성을 경험합니다. TnpB 양성 세포에서 트랜스포존 절제 이벤트를 겪는 세포는 일반 집단보다 mCherry TnpB의 발현 수준이 더 높습니다. 또한, 절제 사건을 겪는 세포의 경우, TnpB 양성 세포는 TnpB 음성 세포보다 약간 더 높은 수준의 정맥 TnpA- 트랜스 포제 만 발현하며, 이는 일반 집단의 황색 형광보다 높습니다.어려움을 겪을 가능성이 가장 높은 곳은 실험을위한 세포 배양 준비입니다. 세포가 기하 급수적으로 성장하고 슬라이드에 적절한 수의 세포가 접종되었는지 확인해야합니다. 슬라이드를 밀봉할 때 기포가 생기지 않도록 주의하여 아가로스 젤이 마르지 않도록 하십시오.

Research

JoVE Journal

Biology

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막 단백질의 실시간 측정 : 수용체 상호 작용은 표면 플라즈몬 공명 (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

프로브 기반의 실시간 PCR은 마이크로 RNA의 정량 측정을위한 접근 방법

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

가변 각도 표면 형광 현미경으로 식물 세포 표면 역학의 실시간 영상

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

A Method to Assess Bacteriocin Effects on the Gut Microbiota of Mice

마우스의 장내 미생물에 대한 박테리오신 효과 평가 방법

Very intriguing questions arise with our advancing knowledge on gut microbiota composition and the relationship with health, particularly relating to the ...