Name: real-time quantification of the effects of is200/is605 family-associated tnpb on transposon activity
Uploaded: 2023-01-20T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Quantification of the Effects of IS200/IS605 Family-Associated TnpB on Transposon Activity at JoVE.com

Bu araştırma için finansal destek, Kaliforniya Üniversitesi'nden başlangıç fonları tarafından sağlandı.

1. Bakteri kültürlerinin hazırlanması
<ol><li>E. coli suşu MG1655'i plazmid transpozon yapıları (daha önce Kim ve ark.8'de tanımlanmıştır) ile LB'de gece boyunca uygun antibiyotiklerle (25 μg / mL kanamisin, bakınız Malzeme Tablosu) 37 ° C'de büyütün. NOT: Kullanılan yapıların dizileri ve ilgili diziler GenBank20 katılım numaraları OP581959, OP581957, OP581958, OP717084 ve OP717085 olarak mevcuttur.</l...

<ol>
	<li>Cowley, M., Oakey, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposable+elements+re-wire+and+fine-tune+the+transcriptome.">Transposable elements re-wire and fine-tune the transcriptome.</a> PLoS Genetics. 9 (1), 1003234 (2013).</li><li>Schneider, D., Lenski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+insertion+sequence+elements+during+experimental+evolution+of+bacteria.">Dynamics of insertion sequence elements during experimental evolution of bacteria.</a> Research in Microbiology. 155 (5), 319-327 (2004).</li><li>Chao, L., Vargas, C., Spear, B. B., Cox, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposable+elements+as+mutator+genes+in+evolution.">Transposable elements as mutator genes in evolution.</a> Nature. 303 (5918), 633-635 (1983).</li><li>Coufal, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L1+retrotransposition+in+human+neural+progenitor+cells.">L1 retrotransposition in human neural progenitor cells.</a> Nature. 460 (7259), 1127-1131 (2009).</li><li>Kano, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L1+retrotransposition+occurs+mainly+in+embryogenesis+and+creates+somatic+mosaicism.">L1 retrotransposition occurs mainly in embryogenesis and creates somatic mosaicism.</a> Genes &amp; Development. 23 (11), 1303-1312 (2009).</li><li>Belancio, V. P., Deininger, P. L., Roy-Engel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LINE+dancing+in+the+human+genome:+transposable+elements+and+disease.">LINE dancing in the human genome: transposable elements and disease.</a> Genome Medicine. 1 (10), 97 (2009).</li><li>Goodier, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrotransposition+in+tumors+and+brains.">Retrotransposition in tumors and brains.</a> Mobile DNA. 5, 11 (2014).</li><li>Kim, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+transposable+element+activity+in+individual+live+cells.">Real-time transposable element activity in individual live cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (26), 7278-7283 (2016).</li><li>Lutz, R., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+and+tight+regulation+of+transcriptional+units+in+Escherichia+coli+via+the+LacR/O,+the+TetR/O+and+AraC/I1-I2+regulatory+elements.">Independent and tight regulation of transcriptional units in Escherichia coli via the LacR/O, the TetR/O and AraC/I1-I2 regulatory elements.</a> Nucleic Acids Research. 25 (6), 1203-1210 (1997).</li><li>Calos, M. P., Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA+sequence+change+resulting+from+the+IQ1+mutation,+which+greatly+increases+promoter+strength.">The DNA sequence change resulting from the IQ1 mutation, which greatly increases promoter strength.</a> Molecular and General Genetics MGG. 183 (3), 559-560 (1981).</li><li>Markwardt, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+cerulean+fluorescent+protein+with+enhanced+brightness+and+reduced+reversible+photoswitching.">An improved cerulean fluorescent protein with enhanced brightness and reduced reversible photoswitching.</a> PLoS One. 6 (3), 17896 (2011).</li><li>Nagai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+variant+of+yellow+fluorescent+protein+with+fast+and+efficient+maturation+for+cell-biological+applications.">A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications.</a> Nature Biotechnology. 20 (1), 87-90 (2002).</li><li>Kersulyte, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposable+element+ISHp608+of+Helicobacter+pylori:+nonrandom+geographic+distribution,+functional+organization,+and+insertion+specificity.">Transposable element ISHp608 of Helicobacter pylori: nonrandom geographic distribution, functional organization, and insertion specificity.</a> Journal of Bacteriology. 184 (4), 992-1002 (2002).</li><li>Shmakov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+evolution+of+class+2+CRISPR-Cas+systems.">Diversity and evolution of class 2 CRISPR-Cas systems.</a> Nature Reviews Microbiology. 15 (3), 169-182 (2017).</li><li>Bao, W., Jurka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologues+of+bacterial+TnpB_IS605+are+widespread+in+diverse+eukaryotic+transposable+elements.">Homologues of bacterial TnpB_IS605 are widespread in diverse eukaryotic transposable elements.</a> Mobile DNA. 4 (1), 12 (2013).</li><li>Siguier, P., Gourbeyre, E., Chandler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+insertion+sequences:+their+genomic+impact+and+diversity.">Bacterial insertion sequences: their genomic impact and diversity.</a> FEMS Microbiology Reviews. 38 (5), 865-891 (2014).</li><li>Altae-Tran, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+widespread+IS200/IS605+transposon+family+encodes+diverse+programmable+RNA-guided+endonucleases.">The widespread IS200/IS605 transposon family encodes diverse programmable RNA-guided endonucleases.</a> Science. 374 (6563), 57-65 (2021).</li><li>Karvelis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon-associated+TnpB+is+a+programmable+RNA-guided+DNA+endonuclease.">Transposon-associated TnpB is a programmable RNA-guided DNA endonuclease.</a> Nature. 599 (7886), 692-696 (2021).</li><li>Kaur, D., Kuhlman, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IS200/IS605+family-associated+TnpB+increases+transposon+activity+and+retention.">IS200/IS605 family-associated TnpB increases transposon activity and retention.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Benson, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GenBank.">GenBank.</a> Nucleic Acids Research. 41, 36-42 (2013).</li><li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+monomeric+red,+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein.">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Ton-Hoang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Stranded+DNA+transposition+is+coupled+to+host+replication.">Single-Stranded DNA transposition is coupled to host replication.</a> Cell. 142 (3), 398-408 (2010).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+growth+of+Escherichia+coli.">Robust growth of Escherichia coli.</a> Current Biology. 20 (12), 1099-1103 (2010).</li></ol>

Canlı hücrelerde transpoze edilebilir element aktivitesinin gerçek zamanlı görüntülenmesi için burada sunulan benzersiz yöntem, canlı hücrelerde ve gerçek zamanlı olarak transpozisyonu doğrudan tespit edebilen ve bu aktiviteyi aksesuar proteinlerin ekspresyonu ile ilişkilendirebilen hassas bir testtir. Verim, toplu yöntemlerle elde edilebilenden daha düşük olsa da, bu yöntem bireysel canlı hücrelerde TE aktivitesinin ve protein ekspresyonunun ayrıntılı ölçümlerini sağlar.
<p class="jove_c...

Transpoze edilebilir elementler (TE'ler), konakçı genomlarında eksizyon veya katalizör kopyalama ve ardından genomik yeniden entegrasyon ile harekete geçen genetik elementlerdir. TE'ler yaşamın tüm alanlarında bulunur ve transpozisyon, konakçı genomunu yeniden yapılandırır, kodlamayı mutasyona uğratır ve bölgelerikontrol eder 1. Bu, evrim2,3, gelişim 4,5 ve kanser7 dahil olmak üzere çeşitli insan hastalıklarındaönemli bir rol oynayan mutasyonlar ve çeşitlilik üretir.
Transpozisyonel aktivitenin yönlerini floresan muhabirlere bağlayan yeni genetik yapıları kullanarak, önceki çalışmamız, yaygın IS200 / IS605 TE'ler ailesinin bir temsilcisi olan bakteriyel TE IS608'e dayanan deneysel bir sistemin geliştirilmesini tanımladı ve bu da bireysel canlı hücrelerde transpozisyonun gerçek zamanlı olarak görselleştirilmesine izin verdi8 (Şekil 1). TE sistemi Şekil 1A'da gösterilmiştir. TE, TnpA'nın tanıma ve eksizyon bölgeleri olan Sol Uç (LE) ve Sağ Uç (RE) kusurlu palindromik tekrarlar (IP'ler) ile çevrili transpozaz kodlama dizisi tnpA'yı içerir. tnpA, tet baskılayıcı tarafından bastırılan ve anhidrotetrasiklin (aTc)9 ile indüklenebilen promotör PLTetO1 kullanılarak ifade edilir. TE, mavi muhabir mCerulean3 11 için kurucu bir PlacIQ1 promotörü 10'un -10 ve -35 dizilerini böler. Şekil 1C'de gösterildiği gibi, tnpA üretimi indüklendiğinde, TE, promotör resulanmasına yol açacak şekilde eksize edilebilir. Üretilen hücre mCerulean3 eksprese eder ve mavi floresan yapar. TnpA'nın N-terminüsü, sarı muhabir Venüs12 ile kaynaştırılır ve TnpA seviyelerinin sarı floresan ile ölçülmesine izin verir.
IS608 ve IS200/IS605 transpozon ailesinin diğer üyeleri de tipik olarak şimdiye kadar bilinmeyen fonksiyonun ikinci bir geni olan tnpB13'ü kodlar. TnpB proteinleri, genellikle sadece tnpB16'dan oluşan birkaç bakteri ve arkeal TE'ler14,15 tarafından kodlanan muazzam derecede bol fakat kusurlu bir şekilde karakterize edilmiş bir nükleaz ailesidir. Ayrıca, son zamanlarda yapılan çalışmalar, TnpB'nin çeşitli koşullar altında dsDNA veya ssDNA kırılmaları verecek CRISPR / Cas benzeri programlanabilir RNA rehberliğinde endonükleaz olarak işlev gördüğünü bularak TnpB'ye olan ilgiyi yenilemiştir17,18. Bununla birlikte, TnpB'nin transpozisyonun düzenlenmesinde hangi rolü oynayabileceği belirsizliğini korumaktadır. TnpB'nin IS608 transpozisyonu üzerindeki etkilerinin gerçek zamanlı görselleştirmesini gerçekleştirmek için, kırmızı floresan protein mCherry'ye N-terminal füzyonu ile TnpB'nin kodlama bölgesi de dahil olmak üzere transpozonun bir versiyonu oluşturuldu.
Kuhlman laboratuvarı19 tarafından gerçekleştirilen daha ayrıntılı toplu düzey çalışmaları tamamlayarak, transpozon aktivitesinin gerçek zamanlı görüntülenmesinin TnpB'nin veya diğer aksesuar proteinlerin transpozisyonel dinamikler üzerindeki etkisini nicel olarak nasıl ortaya çıkarabileceği burada gösterilmiştir. TnpB'yi mCherry ile kaynaştırarak, bireysel transpozisyonel olaylar mavi floresan ile tanımlanır ve TnpA (sarı floresan) ve TnpB (kırmızı floresan) ekspresyon seviyeleri ile ilişkilendirilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2 Ton Clear Epoxy</td>
			<td>Devcon</td>
			<td>31345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>AX1385-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrotetracycline hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>37919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Argon Laser</td>
			<td>Melles Griot</td>
			<td>35-IMA-840-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue Filter Cube</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>Ex: Z457/10X, Em: ET485/30M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti-E Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Discontinued</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 0.1 to 10 &#181;L, Length: 3.4 cm, 1.33 in., PP (Polypropylene)</td>
			<td>Eppendorf North America Biotools</td>
			<td>22491504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 50 to 1000 &#181;L, Length: 7.1 cm, 2.79 in., PP (Polypropylene)</td>
			<td>Eppendorf North America Biotools</td>
			<td>22491555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrous Sulfate Acs 500 g</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>706834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Fiji (imagej.net)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher BioReagents&#160;LB Broth, Miller (Granulated)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9723-2&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Cover Slide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-542B&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1355006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate Cert Ac</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>XXM63SP3KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Heater</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>96810-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17001H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProScan III Stage</td>
			<td>Prior</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Filter Cube</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>Ex: ET560/40X, Em: ET645/75M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sapphire 561 LP Laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>1170412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide, Microscope</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>125535B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine Hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich (SIAL)</td>
			<td>T1270-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti-LU4 Laser Launch</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yellow Filter Cube</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>Ex: Z514/10X, Em: ET535/30M</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time quantification of the effects of is200/is605 family-associated tnpb on transposon activity

Burada, transpozisyona bağlı bir dizi floresan muhabir kullanarak canlı bakteri hücrelerinde transpoze edilebilir element aktivitesinin canlı, gerçek zamanlı görüntülenmesini gerçekleştirmek için bir protokol özetlenmiştir. Özellikle, TnpB aksesuar proteininin, IS200/IS605 transpoze edilebilir element ailesinin bir üyesi olan transpoze edilebilir element IS608'in aktivitesi üzerindeki etkilerini değerlendirmek için gerçek zamanlı görüntülemenin nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. IS200 / IS605 transpoze edilebilir element ailesi, doğada bulunan en sayısız genden biri olan tnpB ile bağlantılı bol miktarda mobil elementtir. Sekans homolojileri, TnpB proteininin CRISPR / Cas9 sistemlerinin evrimsel bir öncüsü olabileceğini öne sürmektedir. Ek olarak, TnpB, Cas benzeri RNA rehberliğinde DNA endonükleazı olarak hareket ettiği gösterilerek yenilenmiş bir ilgi görmüştür. TnpB'nin IS608'in transpozisyon oranları üzerindeki etkileri ölçülmüştür ve IS608'in TnpB ekspresyonunun, TnpB ekspresyonundan yoksun hücrelere kıyasla ~ 5x artmış transpozon aktivitesi ile sonuçlandığı gösterilmiştir.

Canlı hücrelerdeki transpozon aktivitesini floresan mikroskobu ile görselleştirmenin bu yöntemi, toplu floresan ölçümlerinden daha düşük verime sahipken, bireysel canlı hücrelerde transpozon aktivitesinin doğrudan görselleştirilmesini sağlar. Transpozon eksizyon olayları, mCerulean3 için promotörün yeniden sulandırılmasıyla sonuçlanır (Şekil 1), transpozon aktivitesi geçiren hücrelerin parlak mavi floresan ile tanımlanmasına izin verir (Şekil 2, TnpB +: Ek Fil...

Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Quantification of the Effects of IS200/IS605 Family-Associated TnpB on Transposon Activity at JoVE.com

Real-Time Quantification of the Effects of IS200/IS605 Family-Associated TnpB on Transposon Activity

Aksesuar protein TnpB'nin bireysel canlı Escherichia coli hücrelerinde transpozisyon dinamiklerini nasıl etkilediğini ölçmek için canlı gerçek zamanlı görüntüleme yapmak için bir protokol özetlenmiştir.

IS200/IS605 Ailesi ile İlişkili TnpB'nin Transpozon Aktivitesi Üzerindeki Etkilerinin Gerçek Zamanlı Ölçümü

Here, a protocol is outlined to perform live, real-time imaging of transposable element activity in live bacterial cells using a suite of fluorescent ...

Bu protokol, toplu davranışa bakmak yerine, eksizyon istatistiklerini tek hücreli bir temelde ölçmemizi sağlar. Bu seviyede, bireysel hücrelerin zaman içindeki davranışlarını izleyebiliriz, TnpA ve TnpB seviyeleri de dahil olmak üzere, tüketim vergisi olmayan hücreler için TnpA ve TnpB seviyeleri, örneğin, tanımlanmış mutasyonel olayların büyüme hızı üzerindeki etkilerini ölçmemize izin verebilir. Bu yöntem, canlı hücre mutasyon dinamiklerini ölçmenin basit, düşük maliyetli bir yoludur.Genel yaklaşım, canlı hücre floresan görüntüleme gerektiren herhangi bir sistem için geçerlidir. Agarozu eritmek için mikrodalgada% 0.5 glikoz ve% 1.5 agaroz ile M63'ü kaynatarak bir slayt hazırlayın. Ortamın tamamen erimiş ve iyi karıştırılmış olduğundan emin olun.Antibiyotik ve indükleyiciler eklemeden önce karışımın 55 santigrat dereceye kadar soğumasını bekleyin. Çalışma tezgahına bir mikroskop slaytı yerleştirin. Bir slaytı birincisine dik olarak istifleyin.Alt ve üst kızak arasında bir slayt kalınlığına eşit bir boşluk olduğundan emin olun. Pipetle bir mililitrelik M63 agaroz karışımı arasındaki boşluğa yavaşça kaydırarak küçük bir jel kare oluşturur. Jel katılaştıktan sonra, çıkarmak için üst kaydırağı kaydırın.Agarose pedini bir tıraş bıçağı veya bıçakla kesin. Daha sonra pipet 2,5 mikrolitre bakteri kültürü ve kapağın üstüne kayar. Sürgü ile kapak kayması arasındaki boşluğu epoksi ile kapatın.Epoksinin kurumasına ve hücrelerin 37 santigrat derecede bir saat boyunca agaroz pedine yerleşmesine izin verin. Hazırlanan numuneyi floresan mikroskop üzerine ısıtılmış ve 37 santigrat derecede tutulan bir ortama yerleştirin. Her dalga boyu için, minimum floresan içeren görüş alanını bulun.Farklı dalga boylarında ve düzenli zaman aralıklarında bir ızgaradaki görüntüleri almak için bir protokol ayarlayın. Transpozon eksizyon olayları, mCerulean3 için promotörün yeniden yapılandırılmasıyla sonuçlanır ve transpozon aktivitesi geçiren hücrelerin parlak mavi floresan ile tanımlanmasına izin verir. TnpB transpozon eksizyon oranını arttırır.Aksesuar protein TnpB'yi eksprese eden hücreler, TnpB-negatif hücrelere kıyasla dört ila beş kat daha yüksek transpozon aktivitesi seviyeleri yaşarlar. TnpB-pozitif hücrelerde, transpozon eksizyon olayları geçiren hücreler, genel popülasyondan daha yüksek mCherry TnpB ekspresyon seviyelerine sahiptir. Dahası, eksizyon olayları geçiren hücreler için, TnpB-pozitif hücreler, genel popülasyonun sarı floresansından daha yüksek olan TnpB-negatif hücrelerden sadece marjinal olarak daha yüksek venöz TnpA-transpozaz seviyelerini eksprese eder.Mücadele edilecek en muhtemel yer, deney için hücre kültürünün hazırlanmasıdır. Hücrelerin üstel faza büyütüldüğünden ve slaytın uygun sayıda hücreyle aşılandığından emin olmalısınız. Slaytı kapatırken kabarcıklara dikkat etmeyi unutmayın, böylece agaroz jeli kurumaz.

Research

JoVE Journal

Biology

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Thermo Scientific Solaris qPCR Testi kullanarak Kantitatif Real-Time PCR

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Biyoloji

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Emerald Kül Freze Gen İfade Analizi ( Agrilus planipennis) Kullanarak Kantitatif Real Time PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

Unimoleküler Biyosensörler kullanma Canlı Hücreler Olaylar Sinyal gerçek zamanlı izlenmesi için Mikroskopi FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons

Lezyon özgü Moleküler Beacon kullanılması Hücre lizatları ve Base Eksizyon Onarımı Faaliyet kantitatif, gerçek zamanlı Analizi

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base ...

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

Plazma Retinol Bağlayıcı Protein Membran Reseptör tarafından Retinol Ulaştırma Gerçek zamanlı Analizleri

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

Sitotoksisite Sürekli ve gerçek zamanlı izlenmesi için özerk Bioluminescent Memeli Hücre

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Membran Protein Gerçek zamanlı ölçümler: Reseptör Etkileşimleri Yüzey Plazmon Rezonans Kullanma (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-tabanlı Real-time PCR microRNA Kantitatif Ölçüm Yaklaşımları

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

Değişken açılı Epifloresans Mikroskopi ile Bitki Hücre Yüzey Dynamics Gerçek zamanlı Görüntüleme

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

A Method to Assess Bacteriocin Effects on the Gut Microbiota of Mice

Bakteriyosin Etkilerini Farenin Bağırsak Mikrobiyolojisi Üzerine Etkileyen Bir Yöntem

Very intriguing questions arise with our advancing knowledge on gut microbiota composition and the relationship with health, particularly relating to the ...