Name: dna virus detection system based on rpa-crispr/cas12a-spm and deep learning
Uploaded: 2024-05-10T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about DNA Virus Detection System Based on RPA-CRISPR/Cas12a-SPM and Deep Learning at JoVE.com

Diese Arbeit wird unterstützt von der National Natural Science Foundation of China 31970752, Science, Technology, Innovation Commission of Shenzhen Municipality JCYJ20190809180003689, JSGG20200225150707332, JSGG20191129110812708, WDZC20200820173710001; Offene Finanzierung des Shenzhen Bay Laboratory, SZBL2020090501004; Stiftung für Postdoktorandenwissenschaften in China 2020M680023; und Allgemeine Zollverwaltung der Volksrepublik China 2021HK007.

1. Verarbeitung der Proben
<ol><li>Nehmen wir das Froschvirus 3 (FV3, Gattung Ranavirus, Familie Iridoviridae), ein doppelsträngiges DNA-Virus. Wählen Sie das Major Capsid (mcp)-Gen als Ziel für den Nachweis von FV3, da es hochkonserviert ist und normalerweise als Ziel für den Ranavirus-Nachweis angesehen wird. Die ausgewählte Zielsequenz ist in Tabelle 1 dargestellt. HINWEIS: Frog Virus 3 wird in diesem Protokoll als Beispiel genommen.</li>
	<li>Verw...

<ol>
	<li>Gire, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+surveillance+elucidates+Ebola+virus+origin+and+transmission+during+the+2014+outbreak.">Genomic surveillance elucidates Ebola virus origin and transmission during the 2014 outbreak.</a> Science. 345 (6202), 1369-1372 (2014).</li><li>The Ebola Outbreak Epidemiology Team. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outbreak+of+Ebola+virus+disease+in+the+Democratic+Republic+of+the+Congo,+April-May+2018:+an+epidemiological+study.">Outbreak of Ebola virus disease in the Democratic Republic of the Congo, April-May 2018: an epidemiological study.</a> Lancet. 392 (10143), 213-221 (2018).</li><li>Zumla, A., Hui, D. S., Perlman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Middle+East+respiratory+syndrome.">Middle East respiratory syndrome.</a> Lancet. 386 (9997), 995-1007 (2015).</li><li>Plourde, A. R., Bloch, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+literature+review+of+Zika+virus.">A literature review of Zika virus.</a> Emerg Infect Dis. 22 (7), 1185-1192 (2016).</li><li>Yuan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+and+perspective+diagnostic+techniques+for+COVID-19.">Current and perspective diagnostic techniques for COVID-19.</a> ACS Infect Dis. 6 (8), 1998-2016 (2020).</li><li>Minhaj, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monkeypox+outbreak+-+nine+states,+May+2022.">Monkeypox outbreak - nine states, May 2022.</a> MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 71 (23), 764-769 (2022).</li><li>Bao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+opportunities+for+clustered+regularly+interspaced+short+palindromic+repeats+based+molecular+biosensing.">Challenges and opportunities for clustered regularly interspaced short palindromic repeats based molecular biosensing.</a> ACS Sens. 6 (7), 2497-2522 (2021).</li><li>Broughton, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas12-based+detection+of+SARS-CoV-2.">CRISPR-Cas12-based detection of SARS-CoV-2.</a> Nat Biotechnol. 38 (7), 870-874 (2020).</li><li>Chen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas12a+target+binding+unleashes+indiscriminate+single-stranded+DNase+activity.">CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity.</a> Science. 360 (6387), 436-439 (2018).</li><li>Gootenberg, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+detection+with+CRISPR-Cas13a/C2c2.">Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2.</a> Science. 356 (6336), 438-442 (2017).</li><li>Kellner, M. 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S., Ramanavicius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+DNA+polymerases+and+Cas9+as+representative+of+DNA-modifying+enzymes+group+in+DNA+sensor+design+(review).">The application of DNA polymerases and Cas9 as representative of DNA-modifying enzymes group in DNA sensor design (review).</a> Biosens Bioelectron. 175, 112867 (2021).</li><li>Fozouni, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplification-free+detection+of+SARS-CoV-2+with+CRISPR-Cas13a+and+mobile+phone+microscopy.">Amplification-free detection of SARS-CoV-2 with CRISPR-Cas13a and mobile phone microscopy.</a> Cell. 184 (2), 323-333.e9 (2021).</li><li>Kumar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FnCas9-based+CRISPR+diagnostic+for+rapid+and+accurate+detection+of+major+SARS-CoV-2+variants+on+a+paper+strip.">FnCas9-based CRISPR diagnostic for rapid and accurate detection of major SARS-CoV-2 variants on a paper strip.</a> eLife. 10, e67130 (2021).</li><li>Lee, R. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smartphone-based+fluorescent+diagnostic+system+for+highly+pathogenic+H5N1+viruses.">Smartphone-based fluorescent diagnostic system for highly pathogenic H5N1 viruses.</a> Theranostics. 6 (2), 231-242 (2016).</li><li>von Chamier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Democratising+deep+learning+for+microscopy+with+ZeroCostDL4Mic.">Democratising deep learning for microscopy with ZeroCostDL4Mic.</a> Nat Commun. 12 (1), 2276 (2021).</li><li>Shiaelis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus+detection+and+identification+in+minutes+using+single-particle+imaging+and+deep+learning.">Virus detection and identification in minutes using single-particle imaging and deep learning.</a> ACS Nano. 17 (1), 697-710 (2020).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixed-UNet:+Refined+class+activation+mapping+for+weakly-supervised+semantic+segmentation+with+multi-scale+inference.">Mixed-UNet: Refined class activation mapping for weakly-supervised semantic segmentation with multi-scale inference.</a> Front. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insights+of+CRISPR/Cas+nucleases+for+programmable+targeting+and+early-stage+diagnosis:+A+review.">Mechanistic insights of CRISPR/Cas nucleases for programmable targeting and early-stage diagnosis: A review.</a> Biosens Bioelectron. 203, 114033 (2022).</li><li>Liang, Y., Lin, H., Zou, L., Deng, X., Tang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+and+tracking+of+Omicron+variant+of+SARS-CoV-2+using+CRISPR-Cas12a-based+assay.">Rapid detection and tracking of Omicron variant of SARS-CoV-2 using CRISPR-Cas12a-based assay.</a> Biosens Bioelectron. 205, 114098 (2022).</li><li>Sivaraman, D., Biswas, P., Cella, L. N., Yates, M. V., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+RNA+viruses+in+living+mammalian+cells+by+fluorescence+microscopy.">Detecting RNA viruses in living mammalian cells by fluorescence microscopy.</a> Trends Biotechnol. 29 (7), 307-313 (2011).</li><li>Wang, I. H., Burckhardt, C. J., Yakimovich, A., Greber, U. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging,+tracking+and+computational+analyses+of+virus+entry+and+egress+with+the+cytoskeleton.">Imaging, tracking and computational analyses of virus entry and egress with the cytoskeleton.</a> Viruses. 10 (4), 166 (2018).</li></ol>

Bei dieser Methode entwickeln wir mit KI-Unterstützung ein schnelles, einfach zu implementierendes, hochsensitives, sequenzspezifisches und POC-DNA-Virusnachweissystem. Nach der Entnahme von Proben wird RPA angewendet, um die Zielsequenz zu amplifizieren, und dann kann CRISPR/Cas12a die Ziel-DNA erkennen und Fluoreszenz freisetzen, die das Detektionssignal vergrößert. Die tragbare Smartphone-Mikroskopie ist für die Aufnahme von Fluoreszenzbildern ausgelegt, und Deep-Learning-Modelle mit Transferlernen werden für die...

In den letzten Jahren kam es häufig zu Epidemien von Infektionskrankheiten, die durch verschiedene Viren verursacht wurden, darunter die Ebola-Virusvirus-Epidemie (EVD) in den Jahren 20141 und 20182, das Middle East Respiratory Syndrome (MERS) im Jahr 20153, die Zika-Virus-Epidemie im Jahr 20154, die Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19), die durch das schwere akute respiratorische Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2)5 verursacht wurde, und die anhaltenden Affenpocken, die durch das Affenpockenvirus (MKPV) verursacht wurden, im Jahr 20226. Diese plötzlichen Ausbrüche epidemischer Infektionskrankheiten verursachen eine große Zahl von Todesfällen und bringen enorme wirtschaftliche Verluste und soziale Unruhen mit sich. Ein schnelles und genaues Nachweissystem ist dringend erforderlich, um die Infektion schnell zu diagnostizieren und eine weitere Ausbreitung des Virus zu verhindern.
In jüngster Zeit haben geclusterte CRISPR-Proteine (Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) und CRISPR-assoziierte (Cas) Proteine weltweite Aufmerksamkeit erregt und vielversprechende Ergebnisse beim Nachweis von Nukleinsäuren gezeigt 7,8,9,10,11,12,13,14,15 . Das CRISPR/Cas12a-Protein, das von CRISPR-RNA (crRNA) gesteuert wird, bindet an die Ziel-DNA und spaltet sie. Diese Aktivität führt zur Freisetzung von unspezifischer einzelsträngiger DNA (ssDNA), die als Trans-Spaltung bekannt ist, und kann verwendet werden, um das Nachweissignal für den Nukleinsäurenachweis zu verbessern. Einige traditionelle Nachweismethoden wie die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), die quantitative Echtzeit-PCR (qPCR) und der Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) sind kompliziert, zeitaufwändig und kostspielig für den Point-of-Care-Nachweis (POC). In unserer bisherigen Arbeit haben wir erfolgreich ein automatisiertes, integriertes und kostengünstiges Nachweissystem für das Afrikanische Schweinepestvirus (ASFV) entwickelt, das auf der CRISPR/Cas12a-Technologie basiert. In diesem System erreichten wir eine Nachweisgrenze von 1 pM innerhalb eines Zeitrahmens von 2 Stunden, ohne dass eine Amplifikation erforderlich war. Das CRISPR/Cas12a-System und die Rekombinase-Polymerase-Amplifikation (RPA) werden kombiniert, um die Sensitivität und Spezifität für den Nachweis von DNA-Spuren zu verbessern. Im Vergleich zu anderen isothermen Amplifikationstechniken ist RPA einfach aufgebaut und bequem zu bedienen, da es eine kürzere Reaktionszeit ohne ausgeklügelte Temperaturkontrollgeräte hat.
Für den POC-Nachweis von Krankheitserregern werden Instrumente wie Smartphone-Mikroskopie (SPM), Handheld-Fluorimeter oder Lateral-Flow-Strips für die Ergebnisauslesungen 16,17,18 entwickelt. SPM erfasst Bilder über eine Kamera und lädt sie zur schnellen Datenanalyse in einige mobile Anwendungen hoch. Eine solche Mikroskopie stellt ein tragbares, kostengünstiges und miniaturisiertes Signalerfassungssystem mit hoher Empfindlichkeit her und hat Vorteile beim Nachweis von Krankheitserregern wie H5N1, dem Zika-Virus und SARS-CoV-2 gezeigt19,20. Daher bauen wir ein tragbares SPM, um die Fluoreszenzsignale abzufangen, die durch die RPA-CRISPR/Cas12a-Detektion des Ziel-DNA-Virus ausgelöst werden. Die ssDNA-Reportersonde, die einen Fluorophor und einen Quencher verbindet, wird gespalten, wenn CRISPR/Cas12a das Ziel-DNA-Virus erkennt, und die vom Fluorophor emittierte Fluoreszenz kann von SPM erfasst werden.
Im Vergleich zu der professionellen Software, die üblicherweise verwendet wird, um die Ergebnisinformationen aus den Fluoreszenzbildern von SPM21 zu erhalten, verwenden einige Experten maschinelles Lernen und Deep Learning, um die Konzentrationen der Virus-DNA zu quantifizieren, nachdem sie Fluoreszenzbildererhalten haben 22, was zeitaufwändiger ist. Wenn es um die Klassifizierung medizinischer Bilder geht, werden häufig herkömmliche neuronale Netze (CNNs) verwendet, um Merkmale aus den verpixelten Rohbildern auf End-to-End-Weise zu lernen 23,24,25,26. Beliebte CNN-basierte Deep-Learning-Modelle wie AlexNet, DenseNet-121 und EfficientNet-B7 wurden in diesem Bereich erfolgreich eingesetzt27,28. Die Beschaffung großer Datensätze in bestimmten Bereichen kann jedoch eine Herausforderung darstellen und erfordert Transferlernen29,30. Bei diesem Ansatz wird ein Deep-Learning-Modell mit einem großen Datensatz vortrainiert, und das vortrainierte Modell wird als Ausgangspunkt für eine neue Aufgabe mit einem kleinen Datensatz verwendet. Diese Technik kann den Bedarf an großen Datensätzen reduzieren, Überanpassung bekämpfen und die Trainingszeit verkürzen31. Hier verwenden wir Deep-Learning-Modelle mit Transfer-Learning für die binäre Klassifizierung der Fluoreszenzbilder der positiven und negativen Proben.
Bei dieser Methode kombinieren wir RPA und das CRISPR/Cas12a-System zur Spurendetektion von DNA-Viren. Die Ziel-DNA wird durch RPA und CRISPR/Cas12a separat amplifiziert und erkannt, was die kollaterale Spaltungsaktivität von Cas12a auslöst, die einen mit Fluorophor-Quenchern markierten DNA-Reporter spaltet und die Fluoreszenz verallgemeinert. Wir bauen ein tragbares SPM, um die Fluoreszenzbilder für die POC-Detektion aufzunehmen und entwickeln Deep-Learning-Modelle für die binäre Klassifizierung. Das Schema des gebauten POC-Erkennungssystems ist in Abbildung 1 dargestellt. Ohne geschickte Bediener und sperrige Instrumente zeigt das RPA-CRISPR/Cas12a-SPM mit künstlicher Intelligenz (KI) unterstützter Klassifizierung ein großes Potenzial für den Nachweis von POC-DNA-Viren.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64833/64833fig01.jpg"> Abbildung 1: Das Schema des RPA-CRISPR/Cas12-SPM-Detektionssystems zusammen mit der KI-Klassifizierung für gesammelte Bilder. Die Nukleinsäuren tierischer Proben werden von PINDBK freigesetzt. Die Ziel-DNA des Virus wird durch das RPA-CRISPR/Cas12a-System amplifiziert und spezifisch erkannt. CRISPR/Cas12a bindet an crRNA und der Cas12a-crRNA-Komplex an die Ziel-DNA, was die kollaterale Spaltung von CRISPR/Cas12a auf den ssDNA-Reportersonden auslöst. Das Fluorophor auf dem Reporter wird freigesetzt und die Fluoreszenz wird von einem kommerzialisierten Platten-Reader oder dem von uns entwickelten SPM detektiert. Drei verschiedene Deep-Learning-Modelle, darunter AlexNet, DenseNet-121 und EfficientNet-B7 mit Transfer-Learning, werden zur Klassifizierung der Fluoreszenzbilder verwendet. Diese Zahl wird mit Genehmigung von Lei et al.35 wiederverwendet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64833/64833fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>20x amplification</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>OPLN20X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>532 nm green laser</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PL201</td>
			<td>with 0.9 mW output power</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>535 nm cutoff wavelength</td>
			<td>chrome</td>
			<td>AT535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6x DNA loading buffer</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well black microplate</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3603</td>
			<td>Black with flat clear bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspherical lens</td>
			<td>Lubang</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bandpass filter</td>
			<td>SEMROCK</td>
			<td>FF01-542/27-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bsu DNA Polymerase</td>
			<td>ATG Biotechnology</td>
			<td>M103</td>
			<td>Large Fragment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>crRNA</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA fragments</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic holders</td>
			<td>Ruicage</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>SEMROCK</td>
			<td>FF555-Di03-25x36</td>
			<td>with a cutoff wavelength of 535 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.Z.N.A Gel Extraction Kit</td>
			<td>Omega Biotek</td>
			<td>D2500-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnGen Lba Cas12a (Cpf1)</td>
			<td>New England Biolabs (Beijing) LTD</td>
			<td>M0653T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter holders</td>
			<td>Ruicage</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorophore-ssDNA-Quencher reporter probes</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>N/A</td>
			<td>TAMRA (carboxy tetramethylrhodamine) as the fluorophore at the 5 ends; BHQ2 (Black Hole Quencher-2) as the quencher at the 3 ends</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GP32</td>
			<td>ATG Biotechnology</td>
			<td>M104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Open-source</td>
			<td>Version 1.53t 24</td>
			<td>Downloaded from https://imagej.nih.gov/ij/&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>SPARK, TECAN</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Block thermal Cycler PCR instrument</td>
			<td>LongGene</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer r2.1</td>
			<td>New England Biolabs (Beijing) LTD</td>
			<td>B6002S</td>
			<td>10x CRISPR/Cas12a Reaction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen plasma treatment&#160;</td>
			<td>Electro-Technic&#160; Products</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pathogen Inactivate, Nucleic acid extraction-free, Direct-to-PCR Buffer with Proteinase K (PINDBK)</td>
			<td>Ebio</td>
			<td>PINDBK -25mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR primer pairs</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPA primer pairs</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smartphone</td>
			<td>Huawei</td>
			<td>Mate10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translation stages</td>
			<td>Ruicage</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmitted neutral density filters</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>ND40A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triplet achromatic lenses</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TRH127-020-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UvsX</td>
			<td>ATG Biotechnology</td>
			<td>M105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UvsY</td>
			<td>ATG Biotechnology</td>
			<td>M106</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dna virus detection system based on rpa-crispr/cas12a-spm and deep learning

Wir berichten über ein schnelles, einfach zu implementierendes, hochsensitives, sequenzspezifisches und Point-of-Care (POC) DNA-Virus-Nachweissystem, das die Rekombinase-Polymerase-Amplifikation (RPA) und das CRISPR/Cas12a-System für den Spurennachweis von DNA-Viren kombiniert. Die Ziel-DNA wird durch RPA und CRISPR/Cas12a separat amplifiziert und erkannt, was die kollaterale Spaltungsaktivität von Cas12a auslöst, die einen mit Fluorophor-Quenchern markierten DNA-Reporter spaltet und die Fluoreszenz verallgemeinert. Für die POC-Erkennung ist die tragbare Smartphone-Mikroskopie für die Aufnahme von Fluoreszenzbildern ausgelegt. Darüber hinaus werden Deep-Learning-Modelle für die binäre Klassifizierung positiver oder negativer Proben eingesetzt, die eine hohe Genauigkeit erreichen. Das Froschvirus 3 (FV3, Gattung Ranavirus, Familie Iridoviridae) wurde als Beispiel für dieses DNA-Virus-POC-Nachweissystem getestet, und die Nachweisgrenzen (LoD) können innerhalb von 40 Minuten 10 aM erreichen. Ohne geschulte Bediener und sperrige Instrumente zeigt das tragbare und miniaturisierte RPA-CRISPR/Cas12a-SPM mit künstlicher Intelligenz (KI) unterstützte Klassifizierung ein großes Potenzial für den Nachweis von POC-DNA-Viren und kann dazu beitragen, die Ausbreitung solcher Viren zu verhindern.

Diese Methode konzentriert sich auf ein schnelles, einfach zu implementierendes, hochsensitives und Point-of-Care (POC) Nachweissystem für DNA-Viren. Das Design der Primerpaare für die RPA-Reaktion und das crRNA-Design für die CRISPR/Cas12a-Reaktion sind zwei der wesentlichen Teile, da sie die Effizienz der RPA-CRISPR/Cas12a-Reaktion beeinflussen und den anschließenden Nachweis und die Klassifizierung beeinflussen.
Bei dieser Methode gilt FV3 als Beispiel für den Nac...

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DNA Virus Detection System Based on RPA-CRISPR/Cas12a-SPM and Deep Learning

Wir stellen ein Protokoll vor, das die Rekombinase-Polymerase-Amplifikation mit einem CRISPR/Cas12a-System für den Spurennachweis von DNA-Viren kombiniert und eine tragbare Smartphone-Mikroskopie mit einer durch künstliche Intelligenz unterstützten Klassifizierung für den Point-of-Care-Nachweis von DNA-Viren entwickelt.

DNA-Virusnachweissystem basierend auf RPA-CRISPR/Cas12a-SPM und Deep Learning

We report a fast, easy-to-implement, highly sensitive, sequence-specific, and point-of-care (POC) DNA virus detection system, which combines recombinase ...

Unser Protokoll führt ein schnelles und hochempfindliches Nachweissystem für das Froschvirus 3 ein. Bezeichnenderweise ermöglicht diese Methode den Point-of-Care-Nachweis von DNA-Viren und spielt eine entscheidende Rolle bei der Verhinderung des Auftretens pandemischer Krankheiten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt in der Integration von RPA mit dem CRISPR/Cas12a-System, ergänzt durch ein tragbares, Smartphone-basiertes Mikroskop und KI-Klassifizierung.Diese Integration verbessert die Erkennungseffizienz und -genauigkeit erheblich und reduziert gleichzeitig Fehler, die auf menschliche Faktoren zurückzuführen sind. Fügen Sie zunächst die vier wichtigsten RPA-Enzyme in den Reaktionspuffer hinzu. Geben Sie dann die vorgefertigten Grundierungen zur Mischung.Die Mischung gründlich einreiben. Geben Sie einen Mikroliter der Ziel-DNA, die aus dem Froschvirus 3 gewonnen wurde, zu jeder RPA-Reaktion und vermischen Sie sich gut. Pipettieren Sie anschließend sieben Mikroliter 100 millimolares Magnesiumchlorid, um die Reaktion zu starten.Inkubieren Sie die Mischung 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, um den Assay abzuschließen. Bereiten Sie das Bakterium CAS12a-Protein Lachnospiraceae mit CRISPR-RNA vor, um funktionelle Komplexe zu bilden. Mischen Sie das bakterielle Protein und 10 X CRISPR/Cas12a-Reaktionspuffer.Fügen Sie nun eine 500 nanomolare einzelsträngige DNA-Reportersonde hinzu. Geben Sie einen Mikroliter RPA-Reaktionsprodukt in das CRISPR/Cas12a CRISPR-RNA-Reaktionsgemisch. Inkubieren Sie die Mischung bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten.Messen Sie die Fluoreszenzsignale mit einem Mikroplatten-Reader. Für die Detektion mit einem Smartphone-Mikroskop pipettieren Sie zunächst das vorbereitete Reaktionsgemisch auf einen retreated glass slide. Decken Sie es dann vor der Inkubation mit einem Deckglas ab.Legen Sie den Objektträger auf den Tisch des Smartphone-Mikroskops und stellen Sie die Brennweite und Klarheit ein. Nehmen Sie ein Bild auf, um die Fluoreszenzsignale zu messen. Verwenden Sie ImageJ, um den mittleren Grauwert jedes Bildes und die Standardabweichung des mittleren Grauwerts in einer Konzentrationsgruppe zu messen.Übernehmen Sie das Deep-Learning-Modell AlexNet 33 für die Klassifizierung. Verwenden Sie nun Python, um die Eingabebilder auf 224 x 224 x drei Kanäle umzuformen. Verwenden Sie abschließend ein vortrainiertes Backbone-Netzwerk mit ImageNet-Dataset, um Bild-Features zu extrahieren.Das sechste Paar Primer bot die maximale Amplifikationseffizienz und wurde ausgewählt. CRISPR-RNA-3 erwies sich als am effizientesten für die kollaterale Spaltung. Die Verwendung eines entwickelten Detektionssystems mit ausgewählten RPA-Primern und CRISPR-RNA führte zu signifikanten Unterschieden zwischen 10 aM FV3 und der Kontrolle.Der wichtigste Punkt, den Sie sich merken sollten, ist der spezifische CAS 12a-Erkennungsschritt. Die CRISPR-RNA der Reaktion kann modifiziert oder umgestaltet werden, um auf andere DNA-Viren abzuzielen, die auf dem CAS 12a-Nachweis basieren. Die vorgeschlagene Methode kann bei der vorläufigen Bewertung der Menge des Zielvirus helfen.Auf dieser Grundlage können andere Methoden wie die qPCR eingesetzt werden, um eine genauere Viruslast zu erhalten. Diese Technik stellt einen ersten Versuch zum tragbaren Nachweis von DNA-Viren dar. Was das in diesem Protokoll verwendete Froschvirus 3 betrifft, so kann eine rechtzeitige Erkennung wirksame Schutzmaßnahmen nach sich ziehen, um Verluste in der Zuchtindustrie zu reduzieren.

Research

JoVE Journal

Biology

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Intranukleäre Mikroinjektion von DNA in Dissoziierte Adult Mammalian Neurons

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

Forschung

Biologie

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Genetic Studies of Human DNA-Reparatur-Proteinen unter Verwendung von Hefe als Modellsystem

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Associated Chromosome Trap for Identifying Long-range DNA Interactions

Assoziierte Chromosome-Trap zur Identifizierung weiträumige DNA-Wechselwirkungen

Genetic information encoded by DNA is organized in a complex and highly regulated chromatin structure.  Each chromosome occupies a specific territory, ...

Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma

Optimierte PCR-basierten Nachweis von Mycoplasma

The maintenance of contamination-free cell lines is essential to cell-based research. Among the biggest contaminant concerns are mycoplasma contamination. ...

Visualization of DNA Replication in the Vertebrate Model System DT40 using the DNA Fiber Technique

Visualisierung der DNA-Replikation in den Wirbeltier-Modellsystem DT40 mit der DNA Fiber-Technik

Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not ...

SA-&#946;-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

SA--Galactosidase-basierter Screening-Test zur Identifizierung von Senotherapeutischen Arzneimitteln

Cell senescence is one of the hallmarks of aging known to negatively influence a healthy lifespan. Drugs able to kill senescent cells specifically in cell ...

Visualizing and Quantifying Endonuclease-Based Site-Specific DNA Damage

Visualisierung und Quantifizierung endonukleasebasierter ortsspezifischer DNA-Schäden

Cells are continuously exposed to various DNA damaging agents, inducing different cellular responses. Applying biochemical and genetic approaches is ...

Deep Learning-Based Segmentation of Cryo-Electron Tomograms

Deep-Learning-basierte Segmentierung von Kryo-Elektronen-Tomogrammen

Cryo-electron tomography (cryo-ET) allows researchers to image cells in their native, hydrated state at the highest resolution currently possible. The ...

Generation of Brown Fat-Specific Knockout Mice Using a Combined Cre-LoxP, CRISPR-Cas9, and Adeno-Associated Virus Single-Guide RNA System

Generierung von braunfettspezifischen Knockout-Mäusen unter Verwendung eines kombinierten Cre-LoxP-, CRISPR-Cas9- und Adeno-assoziierten Virus-Single-Guide-RNA-Systems

Brown adipose tissue (BAT) is an adipose depot specialized in energy dissipation that can also serve as an endocrine organ via the secretion of bioactive ...

Image Analysis of Immunohistochemically Stained Endometrial Tissue

Platform for Quantitative Detection of Endometrial Immune Cells Based on Immunohistochemistry and Digital Image Analysis

Author Spotlight: Advancing Reproductive Immunology with a Protocol for the Quantitative Evaluation of Endometrial Immune Cells 

Plattform zum quantitativen Nachweis von Immunzellen des Endometriums auf Basis von Immunhistochemie und digitaler Bildanalyse

To evaluate the endometrial immune microenvironment of patients with recurrent miscarriage (RM), a digital immunohistochemistry image analysis platform ...