Name: dna virus detection system based on rpa-crispr/cas12a-spm and deep learning
Uploaded: 2024-05-10T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about DNA Virus Detection System Based on RPA-CRISPR/Cas12a-SPM and Deep Learning at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין 31970752, מדע, טכנולוגיה, חדשנות הוועדה של עיריית שנזן JCYJ20190809180003689, JSGG20200225150707332, JSGG20191129110812708, WDZC20200820173710001; מימון פתוח של מעבדת מפרץ שנזן, SZBL2020090501004; הקרן למדע פוסט-דוקטורט בסין 2020M680023; והמנהל הכללי של המכס של הרפובליקה העממית של סין 2021HK007.

1. עיבוד דגימות
<ol><li>קח וירוס צפרדע 3 (FV3, סוג Ranavirus, משפחה Iridoviridae), וירוס DNA דו גדילי. בחר את הגן הראשי capsid (mcp) כיעד לזיהוי FV3 מכיוון שהוא שמור מאוד ונחשב בדרך כלל כיעד לזיהוי ranavirus. רצף היעד שנבחר מוצג בטבלה 1. הערה: וירוס צפרדע 3 נלקח כדוגמה בפרוטוקול זה.</li>
	<li>לה...

<ol>
	<li>Gire, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+surveillance+elucidates+Ebola+virus+origin+and+transmission+during+the+2014+outbreak.">Genomic surveillance elucidates Ebola virus origin and transmission during the 2014 outbreak.</a> Science. 345 (6202), 1369-1372 (2014).</li><li>The Ebola Outbreak Epidemiology Team. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outbreak+of+Ebola+virus+disease+in+the+Democratic+Republic+of+the+Congo,+April-May+2018:+an+epidemiological+study.">Outbreak of Ebola virus disease in the Democratic Republic of the Congo, April-May 2018: an epidemiological study.</a> Lancet. 392 (10143), 213-221 (2018).</li><li>Zumla, A., Hui, D. S., Perlman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Middle+East+respiratory+syndrome.">Middle East respiratory syndrome.</a> Lancet. 386 (9997), 995-1007 (2015).</li><li>Plourde, A. R., Bloch, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+literature+review+of+Zika+virus.">A literature review of Zika virus.</a> Emerg Infect Dis. 22 (7), 1185-1192 (2016).</li><li>Yuan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+and+perspective+diagnostic+techniques+for+COVID-19.">Current and perspective diagnostic techniques for COVID-19.</a> ACS Infect Dis. 6 (8), 1998-2016 (2020).</li><li>Minhaj, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monkeypox+outbreak+-+nine+states,+May+2022.">Monkeypox outbreak - nine states, May 2022.</a> MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 71 (23), 764-769 (2022).</li><li>Bao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+opportunities+for+clustered+regularly+interspaced+short+palindromic+repeats+based+molecular+biosensing.">Challenges and opportunities for clustered regularly interspaced short palindromic repeats based molecular biosensing.</a> ACS Sens. 6 (7), 2497-2522 (2021).</li><li>Broughton, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas12-based+detection+of+SARS-CoV-2.">CRISPR-Cas12-based detection of SARS-CoV-2.</a> Nat Biotechnol. 38 (7), 870-874 (2020).</li><li>Chen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas12a+target+binding+unleashes+indiscriminate+single-stranded+DNase+activity.">CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity.</a> Science. 360 (6387), 436-439 (2018).</li><li>Gootenberg, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+detection+with+CRISPR-Cas13a/C2c2.">Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2.</a> Science. 356 (6336), 438-442 (2017).</li><li>Kellner, M. J., Koob, J. G., Gootenberg, J. S., Abudayyeh, O. O., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHERLOCK:+nucleic+acid+detection+with+CRISPR+nucleases.">SHERLOCK: nucleic acid detection with CRISPR nucleases.</a> Nat Protoc. 14 (10), 2986-3012 (2019).</li><li>Mukama, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultrasensitive+and+specific+point-of-care+CRISPR/Cas12+based+lateral+flow+biosensor+for+the+rapid+detection+of+nucleic+acids.">An ultrasensitive and specific point-of-care CRISPR/Cas12 based lateral flow biosensor for the rapid detection of nucleic acids.</a> Biosens Bioelectron. 159, 112143 (2020).</li><li>Schwank, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+repair+of+CFTR+by+CRISPR/Cas9+in+intestinal+stem+cell+organoids+of+cystic+fibrosis+patients.">Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).</li><li>Yin, L., Man, S., Ye, S., Liu, G., Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+based+virus+detection:+Recent+advances+and+perspectives.">CRISPR-Cas based virus detection: Recent advances and perspectives.</a> Biosens Bioelectron. 193, 113541 (2021).</li><li>Dronina, J., Bubniene, U. S., Ramanavicius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+DNA+polymerases+and+Cas9+as+representative+of+DNA-modifying+enzymes+group+in+DNA+sensor+design+(review).">The application of DNA polymerases and Cas9 as representative of DNA-modifying enzymes group in DNA sensor design (review).</a> Biosens Bioelectron. 175, 112867 (2021).</li><li>Fozouni, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplification-free+detection+of+SARS-CoV-2+with+CRISPR-Cas13a+and+mobile+phone+microscopy.">Amplification-free detection of SARS-CoV-2 with CRISPR-Cas13a and mobile phone microscopy.</a> Cell. 184 (2), 323-333.e9 (2021).</li><li>Kumar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FnCas9-based+CRISPR+diagnostic+for+rapid+and+accurate+detection+of+major+SARS-CoV-2+variants+on+a+paper+strip.">FnCas9-based CRISPR diagnostic for rapid and accurate detection of major SARS-CoV-2 variants on a paper strip.</a> eLife. 10, e67130 (2021).</li><li>Lee, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+CRISPR-based+diagnostic+for+field-applicable+detection+of+Plasmodium+species+in+symptomatic+and+asymptomatic+malaria.">Ultrasensitive CRISPR-based diagnostic for field-applicable detection of Plasmodium species in symptomatic and asymptomatic malaria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (41), 25722-25731 (2020).</li><li>Ganguli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hands-free+smartphone-based+diagnostics+for+simultaneous+detection+of+Zika,+Chikungunya,+and+Dengue+at+point-of-care.">Hands-free smartphone-based diagnostics for simultaneous detection of Zika, Chikungunya, and Dengue at point-of-care.</a> Biomed Microdevices. 19 (4), 73 (2017).</li><li>Yeo, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smartphone-based+fluorescent+diagnostic+system+for+highly+pathogenic+H5N1+viruses.">Smartphone-based fluorescent diagnostic system for highly pathogenic H5N1 viruses.</a> Theranostics. 6 (2), 231-242 (2016).</li><li>von Chamier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Democratising+deep+learning+for+microscopy+with+ZeroCostDL4Mic.">Democratising deep learning for microscopy with ZeroCostDL4Mic.</a> Nat Commun. 12 (1), 2276 (2021).</li><li>Shiaelis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus+detection+and+identification+in+minutes+using+single-particle+imaging+and+deep+learning.">Virus detection and identification in minutes using single-particle imaging and deep learning.</a> ACS Nano. 17 (1), 697-710 (2020).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixed-UNet:+Refined+class+activation+mapping+for+weakly-supervised+semantic+segmentation+with+multi-scale+inference.">Mixed-UNet: Refined class activation mapping for weakly-supervised semantic segmentation with multi-scale inference.</a> Front. Comput. Sci. 4, 1036934 (2022).</li><li>Lawrimore, J., Doshi, A., Walker, B., Bloom, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AI-assisted+forward+modeling+of+biological+structures.">AI-assisted forward modeling of biological structures.</a> Front Cell Dev Biol. 7, 279 (2019).</li><li>Yang, Y., Hu, Y., Zhang, X., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-stage+selective+ensemble+of+CNN+via+deep+tree+training+for+medical+image+classification.">Two-stage selective ensemble of CNN via deep tree training for medical image classification.</a> IEEE Trans Cybern. 52 (9), 9194-9207 (2022).</li><li>Zhang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RCMNet:+A+deep+learning+model+assists+CAR-T+therapy+for+leukemia.">RCMNet: A deep learning model assists CAR-T therapy for leukemia.</a> Comput Biol Med. 150, 106084 (2022).</li><li>Xie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroke+prediction+from+electrocardiograms+by+deep+neural+network.">Stroke prediction from electrocardiograms by deep neural network.</a> Multimed Tools Appl. 80, 17291-17297 (2021).</li><li>Wang, J., Zhu, H., Wang, S., Zhang, Y. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+deep+learning+on+medical+image+analysis.">A review of deep learning on medical image analysis.</a> Mobile Netw Appl. 26, 351-380 (2021).</li><li>Artoni, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+learning+of+spontaneous+arousal+fluctuations+detects+early+cholinergic+defects+across+neurodevelopmental+mouse+models+and+patients.">Deep learning of spontaneous arousal fluctuations detects early cholinergic defects across neurodevelopmental mouse models and patients.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (38), 23298-23303 (2020).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DeepLearnMOR:+a+deep-learning+framework+for+fluorescence+image-based+classification+of+organelle+morphology.">DeepLearnMOR: a deep-learning framework for fluorescence image-based classification of organelle morphology.</a> Plant Physiol. 186 (4), 1786-1799 (2021).</li><li>Yosinski, J., Clune, J., Bengio, Y., Lipson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+transferable+are+features+in+deep+neural+networks.">How transferable are features in deep neural networks.</a> Proceedings of the 27th International Conference on Neural Information Processing Systems. 2, 3320-3328 (2014).</li><li>He, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+and+all-solution+phase+African+Swine+Fever+Virus+(ASFV)+detection+using+CRISPR-Cas12a+and+fluorescence+based+point-of-care+system.">High-throughput and all-solution phase African Swine Fever Virus (ASFV) detection using CRISPR-Cas12a and fluorescence based point-of-care system.</a> Biosens Bioelectron. 154, 112068 (2020).</li><li>Krizhevsky, A., Sutskever, I., Hinton, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageNet+classification+with+deep+convolutional+neural+networks.">ImageNet classification with deep convolutional neural networks.</a> Commun. ACM. 60 (6), 84-90 (2017).</li><li>Lawton, S., Viriri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+COVID-19+from+CT+lung+scans+using+transfer+learning.">Detection of COVID-19 from CT lung scans using transfer learning.</a> Comput Intell Neurosci. 2021, 5527923 (2021).</li><li>Lei, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+frog+virus+3+by+integrating+RPA-CRISPR/Cas12a-SPM+with+deep+learning.">Detection of frog virus 3 by integrating RPA-CRISPR/Cas12a-SPM with deep learning.</a> ACS Omega. 8 (36), 32555-32564 (2023).</li><li>Chen, Z., Huang, J., Zhang, F., Zhou, Y., Huang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+shrimp+hemocyte+iridescent+virus+by+recombinase+polymerase+amplification+assay.">Detection of shrimp hemocyte iridescent virus by recombinase polymerase amplification assay.</a> Mol Cell Probes. 49, 101475 (2020).</li><li>Fu, X., Sun, J., Ye, Y., Zhang, Y., Sun, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+ultrasensitive+dual+detection+platform+based+on+Cas12a+for+simultaneous+detection+of+virulence+and+resistance+genes+of+drug-resistant+Salmonella.">A rapid and ultrasensitive dual detection platform based on Cas12a for simultaneous detection of virulence and resistance genes of drug-resistant Salmonella.</a> Biosens Bioelectron. 195, 113682 (2022).</li><li>Habimana, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insights+of+CRISPR/Cas+nucleases+for+programmable+targeting+and+early-stage+diagnosis:+A+review.">Mechanistic insights of CRISPR/Cas nucleases for programmable targeting and early-stage diagnosis: A review.</a> Biosens Bioelectron. 203, 114033 (2022).</li><li>Liang, Y., Lin, H., Zou, L., Deng, X., Tang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+and+tracking+of+Omicron+variant+of+SARS-CoV-2+using+CRISPR-Cas12a-based+assay.">Rapid detection and tracking of Omicron variant of SARS-CoV-2 using CRISPR-Cas12a-based assay.</a> Biosens Bioelectron. 205, 114098 (2022).</li><li>Sivaraman, D., Biswas, P., Cella, L. N., Yates, M. V., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+RNA+viruses+in+living+mammalian+cells+by+fluorescence+microscopy.">Detecting RNA viruses in living mammalian cells by fluorescence microscopy.</a> Trends Biotechnol. 29 (7), 307-313 (2011).</li><li>Wang, I. H., Burckhardt, C. J., Yakimovich, A., Greber, U. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging,+tracking+and+computational+analyses+of+virus+entry+and+egress+with+the+cytoskeleton.">Imaging, tracking and computational analyses of virus entry and egress with the cytoskeleton.</a> Viruses. 10 (4), 166 (2018).</li></ol>

בשיטה זו, אנו מפתחים מערכת מהירה, קלה ליישום, רגישה מאוד, ספציפית לרצף וזיהוי וירוסי DNA POC בסיוע AI. לאחר קבלת דגימות, RPA מוחל כדי להגביר את רצף המטרה, ולאחר מכן CRISPR/Cas12a יכול לזהות את DNA המטרה ולשחרר פלואורסצנטיות, אשר מגדילה את אות האיתור. מיקרוסקופ סמארטפון נייד בנוי לצלם תמונות פלואורסצנטיות,...

בשנים האחרונות, מגיפות של מחלות זיהומיות הנגרמות על ידי וירוסים שונים התרחשו לעתים קרובות, כולל מגיפת נגיף האבולה (EVD) בשנת 20141 ו 20182, תסמונת הנשימה במזרח התיכון (MERS) בשנת 20153, מגיפת מחלת נגיף זיקה בשנת 20154, מחלת נגיף הקורונה 2019 (COVID-19) הנגרמת על ידי תסמונת נשימה חריפה חמורה קורונה 2 (SARS-CoV-2)5 ואבעבועות הקוף המתמשכת הנגרמת על ידי נגיף אבעבועות הקוף (MKPV) בשנת 20226. התפרצויות פתאומיות אלה של מחלות זיהומיות מגיפות גורמות למספר רב של מקרי מוות ומביאות להפסדים כלכליים עצומים ותסיסה חברתית. נדרשת בדחיפות מערכת זיהוי מהירה ומדויקת כדי לאבחן במהירות את הזיהום ולמנוע את המשך התפשטות הנגיף.
לאחרונה, חלבונים פלינדרומיים קצרים מקובצים במרווחים קבועים (CRISPR) וחלבונים הקשורים לקריספר (Cas) זכו לתשומת לב עולמית והראו תוצאות מבטיחות בזיהוי חומצות גרעין 7,8,9,10,11,12,13,14,15 . חלבון CRISPR/Cas12a, מונחה על ידי CRISPR RNA (crRNA), נקשר לדנ"א המטרה וקורע אותו. פעילות זו מובילה לשחרור DNA חד-גדילי לא ספציפי (ssDNA), המכונה trans-cleavage, וניתן להשתמש בה כדי לשפר את אות הזיהוי לזיהוי חומצות גרעין. כמה שיטות זיהוי מסורתיות כמו תגובת שרשרת פולימראז (PCR), PCR כמותי בזמן אמת (qPCR) ובדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים (ELISA) הן מסובכות, גוזלות זמן ויקרות לזיהוי נקודת טיפול (POC). בעבודתנו הקודמת פיתחנו בהצלחה מערכת זיהוי אוטומטית, משולבת וחסכונית לנגיף קדחת החזירים האפריקנית (ASFV) המבוססת על טכנולוגיית CRISPR/Cas12a. במערכת זו השגנו מגבלת זיהוי של 1 pM בתוך מסגרת זמן של שעתיים ללא צורך בהגברה. מערכת CRISPR/Cas12a והגברה של רקומבינאז פולימראז (RPA) משולבות כדי לשפר את הרגישות והספציפיות לזיהוי עקבות DNA. בהשוואה לטכניקות הגברה איזותרמיות אחרות, RPA הוא פשוט בעיצוב ונוח לתפעול מכיוון שיש לו זמן תגובה קצר יותר ללא ציוד בקרת טמפרטורה מתוחכם.
לזיהוי POC של פתוגנים, מכשירים כגון מיקרוסקופ סמארטפון (SPM), פלואורימטר כף יד או פסי זרימה רוחביים מפותחים עבור קריאות התוצאות 16,17,18. SPM לוכד תמונות באמצעות מצלמה ומעלה אותן ליישומים ניידים מסוימים לצורך ניתוח נתונים מהיר. מיקרוסקופיה כזו מייצרת מערכת קליטת אותות ניידת, זולה וממוזערת עם רגישות גבוהה והראתה יתרונות באיתור פתוגנים כגון H5N1, נגיף זיקה ו- SARS-CoV-219,20. לכן, אנו בונים SPM נייד כדי לתפוס את אותות הפלואורסצנטיות המופעלים על ידי זיהוי RPA-CRISPR/Cas12a של נגיף ה- DNA המטרה. גשושית כתב ssDNA המקשרת בין פלואורופור ומרווה תיבקע כאשר CRISPR/Cas12a יזהה את נגיף ה- DNA המטרה, והפלואורסצנטיות הנפלטת מהפלואורופור יכולה להילכד על ידי SPM.
בהשוואה לתוכנה המקצועית המשמשת בדרך כלל להשגת מידע התוצאות מתמונות הפלואורסצנטיות מ- SPM21, חלק מהמומחים משתמשים בלמידת מכונה ובלמידה עמוקה כדי לכמת את ריכוזי ה- DNA של הנגיף לאחר השגת תמונות פלואורסצנטיות22, דבר הגוזל זמן רב יותר. כשמדובר בסיווג תמונות רפואיות, רשתות עצביות קונבנציונליות (CNN) משמשות לעתים קרובות כדי ללמוד תכונות מהתמונות המפוקסלות הגולמיות באופן מקצה לקצה 23,24,25,26. מודלים פופולריים מבוססי למידה עמוקה מבוססי CNN כמו AlexNet, DenseNet-121 ו- EfficientNet-B7 יושמו בהצלחה בתחום זה27,28. עם זאת, השגת מערכי נתונים גדולים בתחומים ספציפיים יכולה להיות מאתגרת, ומחייבת למידה העברה29,30. גישה זו מאמנת מראש מודל למידה עמוקה עם מערך נתונים גדול, והמודל שהוכשר מראש משמש כנקודת התחלה למשימה חדשה עם מערך נתונים קטן. טכניקה זו יכולה להפחית את הצורך במערכי נתונים גדולים, להילחם בהתאמת יתר ולהפחית את זמן האימון31. כאן, אנו משתמשים במודלים של למידה עמוקה עם למידת העברה לסיווג בינארי של תמונות פלואורסצנטיות של הדגימות החיוביות והשליליות.
בשיטה זו אנו משלבים RPA ומערכת CRISPR/Cas12a לאיתור עקבות של נגיפי DNA. דנ"א המטרה מוגבר ומזוהה על ידי RPA ו-CRISPR/Cas12a בנפרד, מה שמפעיל את פעילות המחשוף ההיקפי של Cas12a שחותכת כתב DNA עם תווית פלואורופורית ומכלילה פלואורסצנטיות. אנו בונים SPM נייד כדי לצלם את התמונות הפלואורסצנטיות לזיהוי POC ולפתח מודלים של למידה עמוקה לסיווג בינארי. הסכימה של מערכת זיהוי POC הבנויה מוצגת באיור 1. ללא מפעילים מיומנים ומכשירים מגושמים, הסיווג בסיוע RPA-CRISPR/Cas12a-SPM עם בינה מלאכותית (AI) מראה פוטנציאל גדול לזיהוי וירוסי DNA POC.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64833/64833fig01.jpg"> איור 1: הסכימה של מערכת זיהוי RPA-CRISPR/Cas12-SPM יחד עם סיווג AI עבור תמונות שנאספו. חומצות הגרעין של דגימות שמקורן בבעלי חיים משוחררות על ידי PINDBK. דנ"א המטרה של הנגיף מוגבר ומזוהה באופן ספציפי על ידי מערכת RPA-CRISPR/Cas12a. קשרי CRISPR/Cas12a עם crRNA וקשרים מורכבים Cas12a-crRNA עם DNA מטרה, מה שמפעיל את הפיצול הבטחוני של CRISPR/Cas12a על גשושיות כתב ssDNA. הפלואורופור על הכתב משתחרר, והפלואורסצנטיות מזוהה על ידי קורא לוחות ממוסחר או SPM שאנו בונים. שלושה מודלים שונים של למידה עמוקה, כולל AlexNet, DenseNet-121 ו- EfficientNet-B7 עם למידת העברה, משמשים לסיווג תמונות הפלואורסצנטיות. נעשה שימוש חוזר בנתון זה באישור Lei et al.35. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64833/64833fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>20x amplification</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>OPLN20X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>532 nm green laser</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PL201</td>
			<td>with 0.9 mW output power</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>535 nm cutoff wavelength</td>
			<td>chrome</td>
			<td>AT535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6x DNA loading buffer</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well black microplate</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3603</td>
			<td>Black with flat clear bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspherical lens</td>
			<td>Lubang</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bandpass filter</td>
			<td>SEMROCK</td>
			<td>FF01-542/27-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bsu DNA Polymerase</td>
			<td>ATG Biotechnology</td>
			<td>M103</td>
			<td>Large Fragment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>crRNA</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA fragments</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic holders</td>
			<td>Ruicage</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>SEMROCK</td>
			<td>FF555-Di03-25x36</td>
			<td>with a cutoff wavelength of 535 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.Z.N.A Gel Extraction Kit</td>
			<td>Omega Biotek</td>
			<td>D2500-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnGen Lba Cas12a (Cpf1)</td>
			<td>New England Biolabs (Beijing) LTD</td>
			<td>M0653T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter holders</td>
			<td>Ruicage</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorophore-ssDNA-Quencher reporter probes</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>N/A</td>
			<td>TAMRA (carboxy tetramethylrhodamine) as the fluorophore at the 5 ends; BHQ2 (Black Hole Quencher-2) as the quencher at the 3 ends</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GP32</td>
			<td>ATG Biotechnology</td>
			<td>M104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Open-source</td>
			<td>Version 1.53t 24</td>
			<td>Downloaded from https://imagej.nih.gov/ij/&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>SPARK, TECAN</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Block thermal Cycler PCR instrument</td>
			<td>LongGene</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer r2.1</td>
			<td>New England Biolabs (Beijing) LTD</td>
			<td>B6002S</td>
			<td>10x CRISPR/Cas12a Reaction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen plasma treatment&#160;</td>
			<td>Electro-Technic&#160; Products</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pathogen Inactivate, Nucleic acid extraction-free, Direct-to-PCR Buffer with Proteinase K (PINDBK)</td>
			<td>Ebio</td>
			<td>PINDBK -25mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR primer pairs</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPA primer pairs</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smartphone</td>
			<td>Huawei</td>
			<td>Mate10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translation stages</td>
			<td>Ruicage</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmitted neutral density filters</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>ND40A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triplet achromatic lenses</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TRH127-020-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UvsX</td>
			<td>ATG Biotechnology</td>
			<td>M105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UvsY</td>
			<td>ATG Biotechnology</td>
			<td>M106</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dna virus detection system based on rpa-crispr/cas12a-spm and deep learning

אנו מדווחים על מערכת זיהוי נגיפי DNA מהירה, קלה ליישום, רגישה מאוד, ספציפית לרצף ונקודת טיפול (POC), המשלבת הגברה של רקומבינאז פולימראז (RPA) ומערכת CRISPR/Cas12a לאיתור עקבות של נגיפי DNA. דנ"א המטרה מוגבר ומזוהה על ידי RPA ו-CRISPR/Cas12a בנפרד, מה שמפעיל את פעילות המחשוף ההיקפי של Cas12a שחותכת כתב DNA עם תווית פלואורופורית ומכלילה פלואורסצנטיות. לזיהוי POC, מיקרוסקופ סמארטפון נייד בנוי לצלם תמונות פלואורסצנטיות. חוץ מזה, מודלים של למידה עמוקה לסיווג בינארי של דגימות חיוביות או שליליות, להשגת דיוק גבוה, נפרסים בתוך המערכת. וירוס צפרדע 3 (FV3, סוג Ranavirus, משפחה Iridoviridae) נבדק כדוגמה למערכת זיהוי POC זו של נגיף DNA, וגבולות הזיהוי (LoD) יכולים להשיג 10 aM תוך 40 דקות. ללא מפעילים מיומנים ומכשירים מגושמים, הסיווג הנייד והזעיר בסיוע RPA-CRISPR/Cas12a-SPM עם בינה מלאכותית (AI) מראה פוטנציאל גדול לזיהוי וירוסי POC DNA ויכול לסייע במניעת התפשטות וירוסים כאלה.

שיטה זו מתמקדת במערכת זיהוי מהירה, קלה ליישום, רגישה ביותר ונקודת טיפול (POC) עבור נגיפי DNA. תכנון זוגות פריימרים עבור תגובת RPA ועיצוב crRNA עבור תגובת CRISPR/Cas12a הם שניים מהחלקים החיוניים מכיוון שהם ישפיעו על יעילות תגובת RPA-CRISPR/Cas12a וישפיעו על הזיהוי והסיווג הבאים.
בשיטה ...

Watch this Scientific Journal Video about DNA Virus Detection System Based on RPA-CRISPR/Cas12a-SPM and Deep Learning at JoVE.com

DNA Virus Detection System Based on RPA-CRISPR/Cas12a-SPM and Deep Learning

אנו מציגים פרוטוקול המשלב הגברה של רקומבינאז פולימראז עם מערכת CRISPR/Cas12a לאיתור עקבות של נגיפי DNA ובונים מיקרוסקופ סמארטפון נייד עם סיווג בעזרת בינה מלאכותית לזיהוי נגיפי DNA נקודתיים.

מערכת זיהוי וירוסי DNA מבוססת על RPA-CRISPR/Cas12A-SPM ולמידה עמוקה

We report a fast, easy-to-implement, highly sensitive, sequence-specific, and point-of-care (POC) DNA virus detection system, which combines recombinase ...

הפרוטוקול שלנו מציג מערכת זיהוי מהירה ורגישה ביותר לנגיף צפרדע 3. באופן משמעותי, שיטה זו מאפשרת זיהוי נקודתי של נגיפי DNA, הממלאים תפקיד מכריע במניעת הופעתן של מחלות פנדמיות. היתרון העיקרי של טכניקה זו טמון בשילוב של RPA עם מערכת CRISPR/Cas12a, בתוספת מיקרוסקופ נייד מבוסס סמארטפון וסיווג AI.שילוב זה משפר באופן משמעותי את יעילות הזיהוי והדיוק ובו זמנית מפחית טעויות המיוחסות לגורמים אנושיים. כדי להתחיל, הוסף את ארבעת אנזימי RPA העיקריים במאגר התגובה. לאחר מכן הוסיפו לתערובת את הפריימרים המעוצבים מראש.מערבבים היטב את התערובת. הוסיפו מיקרוליטר אחד של דנ"א המטרה המתקבל מווירוס צפרדע 3 לכל תגובת RPA, ומערבלים כדי להתערבב היטב. לאחר מכן, פיפטה שבעה מיקרוליטר של 100 מילימולר מגנזיום כלורי כדי ליזום את התגובה.לדגור על התערובת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות כדי להשלים את הבדיקה. הכינו את החיידק Lachnospiraceae CAS12a חלבון עם CRISPR RNA ליצירת קומפלקסים פונקציונליים. ערבבו את החלבון החיידקי ואת מאגר התגובה 10 X CRISPR/Cas12a.כעת הוסף 500 ננו-מולרית חד-גדילית גשושית כתב DNA. הוסף מיקרוליטר אחד של מוצר תגובת RPA לתערובת תגובת CRISPR/Cas12a CRISPR RNA. דוגרים על התערובת בחום של 37 מעלות למשך 30 דקות.מדוד את האותות הפלואורסצנטיים באמצעות קורא מיקרו-לוחות. לזיהוי באמצעות מיקרוסקופ סמארטפון, ראשית, יש לדחוס את תערובת התגובה המוכנה על מגלשת זכוכית נסוגה. לאחר מכן מכסים אותו בכיסוי לפני הדגירה.מקם את השקופית על במת המיקרוסקופ של הטלפון החכם, וכוונן את אורך המוקד והבהירות. צלם תמונה כדי למדוד את האותות הפלואורסצנטיים. השתמשו ב- ImageJ כדי למדוד את הערך האפור הממוצע של כל תמונה ואת סטיית התקן של הערך האפור הממוצע בקבוצת ריכוז.אמצו את מודל הלמידה העמוקה AlexNet 33 לסיווג. כעת השתמש ב- Python כדי לעצב מחדש את תמונות הקלט ל- 224 על 224 על ידי שלושה ערוצים. לבסוף, השתמש ברשת עמוד שדרה מאומנת מראש עם ערכת נתונים של ImageNet כדי לחלץ תכונות תמונה.זוג הפריימרים השישי סיפק את יעילות ההגברה המרבית, ונבחרו. CRISPR RNA-3 התגלה כיעיל ביותר עבור מחשוף בטחוני. השימוש במערכת זיהוי מפותחת עם פריימרים נבחרים של RPA ו-CRISPR RNA הביא להבדלים משמעותיים בין FV3 של 10 aM לבין הבקרה.הנקודה החשובה ביותר שיש לזכור היא שלב זיהוי CAS 12a הספציפי. ניתן לשנות או לעצב מחדש את ה-CRISPR RNA של התגובה כך שתתמקד בנגיפי DNA אחרים בהתבסס על זיהוי CAS 12a. השיטה המוצעת יכולה לסייע בהערכה ראשונית של כמות נגיף היעד.בהתבסס על כך, ניתן להשתמש בשיטות אחרות כמו qPCR כדי להשיג עומס נגיפי מדויק יותר. טכניקה זו מספקת ניסיון ראשוני לקראת זיהוי נייד של נגיפי DNA. באשר וירוס צפרדע 3 המשמש בפרוטוקול זה, זיהוי בזמן יכול להניע אמצעי הגנה יעילים, הפחתת הפסדים בתעשיית הרבייה.

Research

JoVE Journal

Biology

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Microinjection Intranuclear של דנ&quot;א לתוך ניתק נוירונים היונקים למבוגרים

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

מחקרים גנטיים של חלבונים תיקון דנ&quot;א אנושי באמצעות שמרים כמודל למערכת

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Associated Chromosome Trap for Identifying Long-range DNA Interactions

כרומוזום מלכודת הידיעות AP עבור זיהוי לטווח ארוך אינטראקציות DNA

Genetic information encoded by DNA is organized in a complex and highly regulated chromatin structure.  Each chromosome occupies a specific territory, ...

Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma

אופטימליים PCR מבוססי זיהוי של Mycoplasma

The maintenance of contamination-free cell lines is essential to cell-based research. Among the biggest contaminant concerns are mycoplasma contamination. ...

Visualization of DNA Replication in the Vertebrate Model System DT40 using the DNA Fiber Technique

ויזואליזציה של שכפול ה-DNA של DT40 דגם מערכת החולייתנים באמצעות טכניקה סיב ה-DNA

Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not ...

SA-&#946;-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

א-β-גלטוסידאז-מבוסס על הקרנת ההקרנה לזיהוי תרופות הסאותרפיה

Cell senescence is one of the hallmarks of aging known to negatively influence a healthy lifespan. Drugs able to kill senescent cells specifically in cell ...

Visualizing and Quantifying Endonuclease-Based Site-Specific DNA Damage

הדמיה וכימות נזק DNA ספציפי לאתר מבוסס אנדונוקלאז

Cells are continuously exposed to various DNA damaging agents, inducing different cellular responses. Applying biochemical and genetic approaches is ...

Deep Learning-Based Segmentation of Cryo-Electron Tomograms

פילוח מבוסס למידה עמוקה של טומוגרפיות קריו-אלקטרונים

Cryo-electron tomography (cryo-ET) allows researchers to image cells in their native, hydrated state at the highest resolution currently possible. The ...

Generation of Brown Fat-Specific Knockout Mice Using a Combined Cre-LoxP, CRISPR-Cas9, and Adeno-Associated Virus Single-Guide RNA System

יצירת עכברי נוקאאוט ספציפיים לשומן חום באמצעות מערכת RNA חד-מנחה משולבת של Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 ו-Adeno-Associated Virus

Brown adipose tissue (BAT) is an adipose depot specialized in energy dissipation that can also serve as an endocrine organ via the secretion of bioactive ...

Image Analysis of Immunohistochemically Stained Endometrial Tissue

Platform for Quantitative Detection of Endometrial Immune Cells Based on Immunohistochemistry and Digital Image Analysis

Author Spotlight: Advancing Reproductive Immunology with a Protocol for the Quantitative Evaluation of Endometrial Immune Cells 

פלטפורמה לזיהוי כמותי של תאי מערכת החיסון ברירית הרחם על בסיס אימונוהיסטוכימיה וניתוח תמונה דיגיטלית

To evaluate the endometrial immune microenvironment of patients with recurrent miscarriage (RM), a digital immunohistochemistry image analysis platform ...