Name: immunostaining-based detection of dynamic alterations in red blood cell proteins
Uploaded: 2023-03-17T13:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunostaining-Based Detection of Dynamic Alterations in Red Blood Cell Proteins at JoVE.com

LK anerkender støtten fra et australsk regeringsforskningsuddannelsesprogramstipendium.

De protokoller, der er beskrevet her, er i overensstemmelse med Helsingforserklæringen og blev godkendt af de etiske komitéer ved det tyske sportsuniversitet Köln (16.9.2013) og Griffith-universitetet (2019/808). Frivillige blev screenet for at sikre fraværet af relevante patologier og gav skriftligt informeret samtykke.
1. Farvning af RBC-proteiner ved anvendelse af immunhistokemiske protokoller
BEMÆRK: En detaljeret liste over de krævede kemik...

<ol>
	<li>Cohen, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+cell+life+span+heterogeneity+in+hematologically+normal+people+is+sufficient+to+alter+HbA1c.">Red cell life span heterogeneity in hematologically normal people is sufficient to alter HbA1c.</a> Blood. 112 (10), 4284-4291 (2008).</li><li>Mock, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+blood+cell+(RBC)+survival+determined+in+humans+using+RBCs+labeled+at+multiple+biotin+densities.">Red blood cell (RBC) survival determined in humans using RBCs labeled at multiple biotin densities.</a> Transfusion. 51 (5), 1047-1057 (2011).</li><li>Thiagarajan, P., Parker, C. J., Prchal, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+red+blood+cells+die?.">How do red blood cells die?.</a> Frontiers in Physiology. 12, 655393 (2021).</li><li>Moras, M., Lefevre, S. D., Ostuni, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+erythroblasts+to+mature+red+blood+cells:+organelle+clearance+in+mammals.">From erythroblasts to mature red blood cells: organelle clearance in mammals.</a> Frontiers in Physiology. 8, 1076 (2017).</li><li>Pretini, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+blood+cells:+chasing+interactions.">Red blood cells: chasing interactions.</a> Frontiers in Physiology. 10, 945 (2019).</li><li>Cahalan, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Piezo1+links+mechanical+forces+to+red+blood+cell+volume.">Piezo1 links mechanical forces to red blood cell volume.</a> eLife. 4, e07370 (2015).</li><li>Kuck, L., Peart, J. N., Simmonds, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Piezo1+regulates+shear-dependent+nitric+oxide+production+in+human+erythrocytes.">Piezo1 regulates shear-dependent nitric oxide production in human erythrocytes.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 323 (1), H24-H37 (2022).</li><li>Kuck, L., Peart, J. N., Simmonds, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+modulation+of+human+erythrocyte+mechanics.">Active modulation of human erythrocyte mechanics.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 319 (2), C250-C257 (2020).</li><li>Strader, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modification+as+a+response+to+cellular+stress+induced+by+hemoglobin+oxidation+in+sickle+cell+disease.">Post-translational modification as a response to cellular stress induced by hemoglobin oxidation in sickle cell disease.</a> Scientific Reports. 10 (1), 14218 (2020).</li><li>Pecankova, K., Majek, P., Cermak, J., Dyr, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranslational+modifications+of+red+blood+cell+ghost+proteins+as+&amp;#34;signatures&amp;#34;+for+distinguishing+between+low-+and+high-risk+myelodysplastic+syndrome+patients.">Posttranslational modifications of red blood cell ghost proteins as &amp;#34;signatures&amp;#34; for distinguishing between low- and high-risk myelodysplastic syndrome patients.</a> Turkish Journal of Haematology. 34 (1), 111-113 (2017).</li><li>Grau, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+red+blood+cell+nitric+oxide+synthase+activation+is+not+associated+with+improved+vascular+function+and+red+blood+cell+deformability+in+sickle+cell+anaemia.">High red blood cell nitric oxide synthase activation is not associated with improved vascular function and red blood cell deformability in sickle cell anaemia.</a> British Journal of Haematology. 168 (5), 728-736 (2015).</li><li>Sae-Lee, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+organization+of+a+red+blood+cell.">The protein organization of a red blood cell.</a> Cell Reports. 40 (3), 111103 (2022).</li><li>Suhr, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderate+exercise+promotes+human+RBC-NOS+activity,+NO+production+and+deformability+through+Akt+kinase+pathway.">Moderate exercise promotes human RBC-NOS activity, NO production and deformability through Akt kinase pathway.</a> PLoS One. 7 (9), e45982 (2012).</li><li>Kuck, L., Grau, M., Bloch, W., Simmonds, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+ameliorates+superoxide+impairment+to+erythrocyte+deformability+with+concurrent+nitric+oxide+synthase+activation.">Shear stress ameliorates superoxide impairment to erythrocyte deformability with concurrent nitric oxide synthase activation.</a> Frontiers in Physiology. 10, 36 (2019).</li><li>Grau, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RBC-NOS-dependent+S-nitrosylation+of+cytoskeletal+proteins+improves+RBC+deformability.">RBC-NOS-dependent S-nitrosylation of cytoskeletal proteins improves RBC deformability.</a> PLoS One. 8 (2), e56759 (2013).</li><li>Simmonds, M. J., Detterich, J. A., Connes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide,+vasodilation+and+the+red+blood+cell.">Nitric oxide, vasodilation and the red blood cell.</a> Biorheology. 51 (2-3), 121-134 (2014).</li><li>Bor-Kucukatay, M., Wenby, R. B., Meiselman, H. J., Baskurt, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+nitric+oxide+on+red+blood+cell+deformability.">Effects of nitric oxide on red blood cell deformability.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 284 (5), H1577-H1584 (2003).</li><li>Suhr, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intensive+exercise+induces+changes+of+endothelial+nitric+oxide+synthase+pattern+in+human+erythrocytes.">Intensive exercise induces changes of endothelial nitric oxide synthase pattern in human erythrocytes.</a> Nitric Oxide: Biology and Chemistry. 20 (2), 95-103 (2009).</li><li>Grau, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+red+blood+cell+deformability+is+independent+of+red+blood+cell-nitric+oxide+synthase+under+hypoxia.">Regulation of red blood cell deformability is independent of red blood cell-nitric oxide synthase under hypoxia.</a> Clinical Hemorheology and Microcirculation. 63 (3), 199-215 (2016).</li><li>Grau, M., Kuck, L., Dietz, T., Bloch, W., Simmonds, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-fractions+of+red+blood+cells+respond+differently+to+shear+exposure+following+superoxide+treatment.">Sub-fractions of red blood cells respond differently to shear exposure following superoxide treatment.</a> Biology. 10 (1), 47 (2021).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Oz&#252;yaman, B., Grau, M., Kelm, M., Merx, M. W., Kleinbongard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RBC+NOS:+regulatory+mechanisms+and+therapeutic+aspects.">RBC NOS: regulatory mechanisms and therapeutic aspects.</a> Trends in Molecular Medicine. 14 (7), 314-322 (2008).</li><li>Kleinbongard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+blood+cells+express+a+functional+endothelial+nitric+oxide+synthase.">Red blood cells express a functional endothelial nitric oxide synthase.</a> Blood. 107 (7), 2943-2951 (2006).</li><li>McMahon, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+blood+cell+deformability,+vasoactive+mediators,+and+adhesion.">Red blood cell deformability, vasoactive mediators, and adhesion.</a> Frontiers in Physiology. 10, 1417 (2019).</li><li>Bizjak, D. A., Brinkmann, C., Bloch, W., Grau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+in+red+blood+cell-nitric+oxide+synthase+dependent+nitric+oxide+production+during+red+blood+cell+aging+in+health+and+disease:+a+study+on+age+dependent+changes+of+rheologic+and+enzymatic+properties+in+red+blood+cells.">Increase in red blood cell-nitric oxide synthase dependent nitric oxide production during red blood cell aging in health and disease: a study on age dependent changes of rheologic and enzymatic properties in red blood cells.</a> PLoS One. 10 (4), 0125206 (2015).</li><li>Di Pietro, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+synthetic+pathway+and+cGMP+levels+are+altered+in+red+blood+cells+from+end-stage+renal+disease+patients.">Nitric oxide synthetic pathway and cGMP levels are altered in red blood cells from end-stage renal disease patients.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. 417 (1-2), 155-167 (2016).</li><li>Grau, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Even+patients+with+mild+COVID-19+symptoms+after+SARS-CoV-2+infection+show+prolonged+altered+red+blood+cell+morphology+and+rheological+parameters.">Even patients with mild COVID-19 symptoms after SARS-CoV-2 infection show prolonged altered red blood cell morphology and rheological parameters.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 26 (10), 3022-3030 (2022).</li><li>Mozar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+blood+cell+nitric+oxide+synthase+modulates+red+blood+cell+deformability+in+sickle+cell+anemia.">Red blood cell nitric oxide synthase modulates red blood cell deformability in sickle cell anemia.</a> Clinical Hemorheology and Microcirculation. 64 (1), 47-53 (2016).</li><li>Ulker, P., Gunduz, F., Meiselman, H. J., Baskurt, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+generated+by+red+blood+cells+following+exposure+to+shear+stress+dilates+isolated+small+mesenteric+arteries+under+hypoxic+conditions.">Nitric oxide generated by red blood cells following exposure to shear stress dilates isolated small mesenteric arteries under hypoxic conditions.</a> Clinical Hemorheology and Microcirculation. 54 (4), 357-369 (2013).</li><li>Nader, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxyurea+therapy+modulates+sickle+cell+anemia+red+blood+cell+physiology:+Impact+on+RBC+deformability,+oxidative+stress,+nitrite+levels+and+nitric+oxide+synthase+signalling+pathway.">Hydroxyurea therapy modulates sickle cell anemia red blood cell physiology: Impact on RBC deformability, oxidative stress, nitrite levels and nitric oxide synthase signalling pathway.</a> Nitric Oxide: Biology and Chemistry. 81, 28-35 (2018).</li><li>Fischer, U. M., Schindler, R., Brixius, K., Mehlhorn, U., Bloch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracorporeal+circulation+activates+endothelial+nitric+oxide+synthase+in+erythrocytes.">Extracorporeal circulation activates endothelial nitric oxide synthase in erythrocytes.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 84 (6), 2000-2003 (2007).</li><li>Horobin, J. T., Sabapathy, S., Kuck, L., Simmonds, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+and+RBC-NOS+Serine1177+Phosphorylation+in+humans:+a+dose+response.">Shear stress and RBC-NOS Serine1177 Phosphorylation in humans: a dose response.</a> Life. 11 (1), 36 (2021).</li><li>Kuck, L., Grau, M., Simmonds, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+time+course+of+erythrocyte+deformability+following+exposure+to+shear+is+dependent+upon+conditioning+shear+stress.">Recovery time course of erythrocyte deformability following exposure to shear is dependent upon conditioning shear stress.</a> Biorheology. 54 (5-6), 141-152 (2018).</li><li>Grau, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+acute+exercise+on+RBC+deformability+and+RBC+nitric+oxide+synthase+signalling+pathway+in+young+sickle+cell+anaemia+patients.">Effect of acute exercise on RBC deformability and RBC nitric oxide synthase signalling pathway in young sickle cell anaemia patients.</a> Scientific Reports. 9 (1), 11813 (2019).</li><li>Feelisch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Nitric Oxide Research. , (1998).</li><li>Cortese-Krott, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+red+blood+cells+at+work:+identification+and+visualization+of+erythrocytic+eNOS+activity+in+health+and+disease.">Human red blood cells at work: identification and visualization of erythrocytic eNOS activity in health and disease.</a> Blood>. 120 (20), 4229-4237 (2012).</li></ol>

Nyere litteratur tyder stærkt på, at RBC-NOS-proteinet er af afgørende betydning for reguleringen af RBC-deformerbarhed 15,22,23, hvilket igen letter deres passage gennem smalle kapillærer 24. Proteinaktivitet afhænger i høj grad af posttranslationelle proteinmodifikationer, især phosphoryleringen af visse restkoncentrationer18. Fokus af interesse ligger i fosforyleringsste...

Røde blodlegemer (RBC'er) krydser det kardiovaskulære system i 70 til 140 dage med en gennemsnitlig RBC-alder på ca. 115 dage 1,2. Senescerende eller beskadigede RBC'er fjernes fra cirkulationen ved erythrofagocytose, en effektiv clearingproces drevet af makrofager3. Den forudbestemte levetid for disse celler er en konsekvens af overgivelse af celleorganellerne, herunder kernen, mitokondrier og ribosomer, under differentiering og modning4. Således er cirkulerende RBC'er blottet for et translationelt maskineri, der udelukker syntese af nye proteiner3. Det følger heraf, at dynamiske, posttranslationelle modifikationer af eksisterende proteiner repræsenterer den eneste levedygtige mekanisme for akut, biokemisk regulering som reaktion på ekstracellulære og intracellulære stressorer, der virker på RBC'er5.
Mekaniske kræfter synes at være de vigtigste ekstracellulære signaler, der forårsager aktivering eller modulering af biokemiske veje inden for RBC'er. Opdagelsen af det mekanofølsomme protein, Piezo1, i RBC-membraner6 inspirerede flere forskningslinjer, der undersøgte mekanisk aktiveret signalering i disse celler7. For eksempel har nylige fremskridt vist, at RBC'ernes fysiske egenskaber reguleres aktivt af akutte og dynamiske ændringer af proteiner8, som omfatter posttranslationel phosphorylering og ubiquitination9. Da disse normale modifikationer adskiller sig i visse sygdomme 9,10,11, synes det at være af videnskabelig og klinisk interesse at bestemme aktiveringstilstanden for RBC-proteiner, specifikt i forhold til mekanobiologiske processer.
Bestemmelsen af akutte ændringer i RBC-proteinaktiveringstilstande udgør nogle metodologiske udfordringer. For eksempel kræver opbevaring af RBC-prøver til senere analyse konservering af de modificerede RBC-proteiner, da posttranslationelle modifikationer er ikke-holdbare. Desuden er klassiske proteindetekteringsmetoder (f.eks. Western blotting) notorisk vanskelige at standardisere i RBC'er på grund af den lave overflod af proteiner i forhold til hæmoglobin, som tegner sig for ~ 98% af proteinindholdet i disse celler12. Antistofbaseret farvning af kemisk konserverede RBC'er har således været den foretrukne metode til undersøgelse af akutte modifikationer af vigtige RBC-proteiner, såsom den RBC-specifikke isoform af nitrogenoxidsyntase (RBC-NOS)13,14. RBC-NOS har vist sig enzymatisk at producere nitrogenoxid (NO), hvilket synes uundværligt for væsentlige RBC-egenskaber, herunder RBC-deformerbarhed15,16,17. Posttranslationelle modifikationer af RBC-NOS regulerer katalytisk enzymaktivitet, idet phosphorylering af serin 1177-resten beskrives for at øge enzymaktiviteten, mens phosphorylering af resterne serin 114 eller threonin 495 er blevet forbundet med nedsat RBC-NOS-aktivitet18,19.
Samlet set bidrager midlertidige modifikationer af RBC-proteiner til vigtig cellulær funktion, og standardiserede protokoller, der muliggør påvisning af disse modificerede proteiner, er af høj værdi. Her præsenterer vi to forskellige protokoller, der udnytter specifikke antistoffer til at lette påvisning af RBC-NOS-proteinaktivering, og diskuterer anbefalinger til dataanalyse og fortolkning.
De beskrevne protokollers ydeevne blev vurderet ved at måle den velrapporterede stigning i phosphoryleringen af RBC-NOS ved serin 1177-resterne som reaktion på mekaniske kræfter, der reflekteres af dem, der forekommer i den humane vaskulatur (5 Pa).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3,3&#8242;-Diaminobenzidin -tetrahydrochloride Hydrate</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>D5637</td>
			<td>DAB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammoniumchloride&#160;</td>
			<td>Merck /Millipore</td>
			<td>101145</td>
			<td>NH4Cl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5427 R&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5409000010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0147&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>di-sodium Hydrogen Phosphate Dihydrate&#160;</td>
			<td>Merck /Millipore</td>
			<td>106580</td>
			<td>Na2HPO4. 2 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable transfer pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-6803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Entellan</td>
			<td>Merck /Millipore</td>
			<td>107961</td>
			<td>rapid mounting medium for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol denaturated using 1 % methyl ethyl ketone (MEK)</td>
			<td>Hofmann</td>
			<td>642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose-Oxidase</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>G2133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grease pencil&#160;</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S 2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse-radish peroxidase/ExtrAvidin&#8722;Peroxidase</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>E-2886</td>
			<td>HRP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid&#160;</td>
			<td>Merck /Millipore</td>
			<td>109057</td>
			<td>HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide, 30%</td>
			<td>Merck /Millipore</td>
			<td>107203</td>
			<td>H2O2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>Freeware</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser-assisted optical rotational cell analyser (LORCA)</td>
			<td>RR Mechatronics</td>
			<td></td>
			<td>Ektacytometer instrument used for shearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Merck /Millipore</td>
			<td>106009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>630-1985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel(II)-sulfate Hexahydrate&#160;</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>N4882</td>
			<td>NiSO4.6H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat serum</td>
			<td>Agilent/DAKO</td>
			<td>X0907</td>
			<td>NGS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck /Millipore</td>
			<td>818715</td>
			<td>PFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes Eppendorf Reference 2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-5836/ 613-5839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-phospho eNOS Antibody (Ser1177)</td>
			<td>Merck/Millipore</td>
			<td>07-428-I</td>
			<td>Primary Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction tubes, 2ml</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary Antibody goat anti rabbit</td>
			<td>Agilent/DAKO</td>
			<td>E0432</td>
			<td>Secondary Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk powder</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-6404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride&#160;</td>
			<td>Merck /Millipore</td>
			<td>106404</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate</td>
			<td>Merck /Millipore</td>
			<td>106346</td>
			<td>NaH2PO4.H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide, 1 M</td>
			<td>Merck /Millipore</td>
			<td>150706</td>
			<td>NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)-aminomethane</td>
			<td>Merck /Millipore</td>
			<td>108382</td>
			<td>Tris</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>T7409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20&#160;</td>
			<td>Merck /Millipore</td>
			<td>822184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Glas microfiber filter, quality GF/F</td>
			<td>Merck /Millipore</td>
			<td>WHA1825047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylol</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>2,89,73,465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#223;-D-Glucose monohydrate</td>
			<td>Merck /Millipore</td>
			<td>14431-43-7</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunostaining-based detection of dynamic alterations in red blood cell proteins

Antistofmærkning af proteiner med røde blodlegemer (RBC) er en almindeligt anvendt, semikvantitativ metode til påvisning af ændringer i det samlede proteinindhold eller akutte ændringer i proteinaktiveringstilstande. Det letter vurderingen af RBC-behandlinger, karakterisering af forskelle i visse sygdomstilstande og beskrivelse af cellulære kohærenser. Påvisning af akut ændret proteinaktivering (f.eks. gennem mekanotransduktion) kræver tilstrækkelig prøveforberedelse for at bevare ellers midlertidige proteinmodifikationer. Det grundlæggende princip omfatter immobilisering af målbindingsstederne for de ønskede RBC-proteiner for at muliggøre den indledende binding af specifikke primære antistoffer. Prøven behandles yderligere for at sikre optimale betingelser for binding af det sekundære antistof til det tilsvarende primære antistof. Udvælgelsen af ikke-fluorescerende sekundære antistoffer kræver yderligere behandling, herunder biotin-avidin-kobling og anvendelse af 3,3-diaminobenzidin-tetrahydrochlorid (DAB) for at udvikle farvningen, som skal kontrolleres i realtid under et mikroskop for at stoppe oxidationen og dermed farvningsintensiteten til tiden. Til detektion af farvningsintensitet tages billeder ved hjælp af et standard lysmikroskop. I en modifikation af denne protokol kan et fluoresceinkonjugeret sekundært antistof anvendes i stedet, hvilket har den fordel, at der ikke er behov for yderligere udviklingstrin. Denne procedure kræver imidlertid et fluorescensmål fastgjort til et mikroskop til farvningsdetektion. I betragtning af disse metoders semikvantitative karakter er det bydende nødvendigt at tilvejebringe flere kontrolpletter for at tage højde for ikke-specifikke antistofreaktioner og baggrundssignaler. Her præsenterer vi både farvningsprotokoller og de tilsvarende analytiske processer for at sammenligne og diskutere de respektive resultater og fordele ved de forskellige farvningsteknikker.

Den præsenterede protokol, der beskriver metoder, der letter påvisning af akutte ændringer i RBC-proteiner, blev testet på en velkendt mekanisk følsom proteinændring: phosphorylering af RBC-NOS ved serin 1177-resten. Fuldblod blev opnået fra raske frivillige og efterfølgende opdelt i to separate alikvoter. En given blodprøve blev udsat for mekanisk forskydningsspænding af fysiologisk størrelse (5 Pa) i 300 s, hvilket tidligere viste sig at fremkalde RBC-NOS-phosphorylering ved serin 117714</s...

Watch this Scientific Journal Video about Immunostaining-Based Detection of Dynamic Alterations in Red Blood Cell Proteins at JoVE.com

Immunostaining-Based Detection of Dynamic Alterations in Red Blood Cell Proteins

Registrering af dynamiske ændringer i proteinaktiveringen af enukleerede røde blodlegemer udgør metodologiske udfordringer, som bevarelse af dynamiske ændringer i akutte stimuli til senere vurdering. Den præsenterede protokol beskriver prøveforberedelse og farvningsteknikker, der muliggør konservering og analyse af relevante proteinændringer og efterfølgende påvisning.

Immunfarvningsbaseret påvisning af dynamiske ændringer i proteiner fra røde blodlegemer

Antibody labeling of red blood cell (RBC) proteins is a commonly used, semi-quantitative method to detect changes in overall protein content or acute ...

Vores metode muliggør mekanistiske subcellulære undersøgelser inden for mekanobiologiens hurtigt bevægende felt ved at fastsætte midlertidige proteinmodifikationer på plads og derefter detektere dem med specifikke antistoffer. Denne metode er teknisk let at anvende. Resultaterne er meget valide og reproducerbare.Også i sammenligning med andre teknikker kunne vores metode virkelig bruges effektivt i det nye felt af posttranslationel signalering af røde blodlegemer, som er afhængig af midlertidige proteinmodifikationer, især mekanosignalering af røde blodlegemer. For at udføre RBC-proteinfiksering fortyndes fuldblod i et forhold på en til to i 4% paraformaldehydopløsning i 20 minutter ved stuetemperatur. Blodopløsningen centrifugeres ved 132 g i tre minutter ved stuetemperatur, og supernatanten fjernes forsigtigt.RBC-pelleten resuspenderes i to volumener af 0,1 molær PBS og inkuberes i fem minutter ved stuetemperatur. Prøven centrifugeres igen, og supernatanten fjernes, inden RBC-pelletten resuspenderes i et volumen på 0,1 molær PBS. Mærk et mikroskopglas med prøve-id'et og antistoffet påført ved hjælp af en alkoholresistent pen.Tilsæt 10 mikroliter af den fremstillede RBC-opløsning. Placer et andet dias på prøven i en vinkel på 45 grader, og fordel prøven jævnt langs diaset. Varm fikser diaset ved at holde prøven over Bunsen-brænderen med en konstant bevægelse i fem til syv sekunder.Til immunohistokemisk farvning skal du markere 2/3-området af diaset som en test og 1/3 som en kontrol ved hjælp af en fedtblyant. Derefter vaskes prøveområderne to gange ved at påføre TBS i 30 sekunder. Efter den anden vask tilsættes 0,1% trypsin og dækkes diaset ved hjælp af et specialbygget inkubationskammer med låg.Inkuber prøven i 30 minutter ved 37 grader Celsius. Fyld et bægerglas med postevand og stop enzymreaktionen ved at tilsætte postevand fra bægerglasset til objektglasset. Hæld opløsningen af, og vask begge områder tre gange med TBS.Efter den endelige vask tilsættes peroxidaseblokerende opløsning og inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur. Efter inkubation hældes opløsningen af og vaskes begge områder tre gange med TBS. Derefter tilsættes 3% skummetmælksopløsning og inkuberes i 30 minutter.Efter inkubation hældes opløsningen af, og den primære antistofopløsning tilsættes til testområdet. Tilføj antistofkontrolopløsning til kontrolområdet. Prøverne inkuberes ved fire grader Celsius natten over.Den næste dag hældes antistofopløsningen af og vaskes begge områder tre gange med TBS. Derefter tilsættes 3% normal gedeskrumopløsning for at forhindre uspecifik binding og inkuberes i 30 minutter. Efter inkubation tilsættes en sekundær antistofopløsning og inkuberes i 30 minutter.Hæld antistofopløsningen af og vask områderne tre gange med TBS, inden du fortsætter med udviklingen af farvning. For at udføre en avidinkoblet peberrodsperoxidasereaktion tilsættes fortyndet avidinperoxidaseopløsning og inkuberes i 30 minutter. Placer objektglasset under et mikroskop ved 200 gange forstørrelse, og tilsæt frisklavet DAB-opløsning til begge områder.Overvåg farvningen af RBC'erne kontinuerligt, og stop farvningen ved at fjerne DAB-opløsningen med en engangspipette, før baggrunden begynder at farve. For at udføre prøvedehydrering skal du placere diaset i et glasstativ og nedsænke i fem sekunder hver i stigende ethanolkoncentrationer og til sidst i xylol. Efter dehydrering skal du placere diaset på silkepapir med RBC'erne øverst for at absorbere overskydende væske.Tilsæt to eller tre dråber monteringsmedium på en dæksel, og dæk diaset ved hjælp af dækselsedlen. For visualisering og billeddannelse skal du placere diaset i et transmitteret lysmikroskop kombineret med et kamera. Tænd lyskilden og kameraet, og start softwaren.Under Bright-Field Mode skal du fokusere RBC'erne ved at dreje på de grove og fine fokusjusteringsknapper. På samme måde skal du fokusere RBC'erne under fluorescerende tilstand. For at analysere RBC-grå værdi skal du markere kanten af hver RBC ved hjælp af det ovale markeringsværktøj i ImageJ-softwaren.Brug kommandoen Måling til at måle de grå værdier for 50 RBC'er fra testen og 10 RBC'er fra kontrolelementet. Til immunofluorescerende farvning af RBC-proteiner inkuberes prøven med et sekundært fluorescerende konjugeret antistof i 30 minutter ved stuetemperatur og beskytter det mod lys. Efter inkubation hældes antistofopløsningen af og vaskes diaset tre gange med TBS.Lad TBS blive på prøven efter den sidste vask. Prøven dehydreres, og objektglasset klargøres med en dækseddel til mikroskopisk vurdering som vist. Tænd mikroskopet og lysstofrørskilden, og fokuser RBC'erne i en lysfelttilstand.Tag lysfeltsbilleder og fluorescerende billeder i mindst tre forskellige områder af testområdet på det tilfældigt valgte dias. Indstil eksponeringstiden til et sekund for fluorescerende billeder, og tag et billede. Skift derefter til Bright-Field Mode, indstil eksponeringstiden til Auto, og tag det tilsvarende lysfeltbillede.Gem billederne i TIFF-format. Tag fluorescerende billeder og lysfeltsbilleder i mindst to forskellige tilfældigt udvalgte områder af diasets kontrolområde. Gem billederne i TIFF-format for at bevare de oprindelige grå værdier for pixels, forhindre komprimering og bære metadata for erhvervelsen.Hvis du vil måle de grå værdier for hentede RBC'er, skal du åbne ImageJ. Markér hver celle med det ovale markeringsværktøj, og analysér ved hjælp af kommandoen Måling. Fremhæv mellem tre og fem områder fri for RBC'er, og bestem de grå værdier for at måle baggrundssignalet.Hvis du vil udføre alternativ dataanalyse af optagne billeder, skal du oprette en makrokommando via Fiji-udgivelsen af ImageJ til automatisk markering, baggrundskorrektion og analyse af grå værdier af et givet billede. Åbn billedet i TIFF-format til analyse i Fiji. Åbn derefter RBC-fluorescensen.ijm makro, og klik på Kør. Signalet af antistoffer rettet mod RBC nitrogenoxidsyntase eller NOS, phosphoryleret ved serin 1177-resten i hvile og som reaktion på mekanisk krafteksponering blev vurderet under anvendelse af både immunhistokemi og immunofluorescens. En tredobling af signalet fra antistoffer rettet mod RBC-NOS-phosphoryleret ved serin 1177-resterne blev påvist som reaktion på mekanisk krafteksponering af RBC'er sammenlignet med de respektive ikke-klippede celler, når de blev vurderet med enten immunhistokemisk eller immunofluorescensmetoden.Brugeren skal sørge for, at antistoffet kun påføres testområdet. Ellers kan prøven ikke analyseres på grund af manglende kontrol. I betragtning af tilgængeligheden af en lang række antistoffer er det muligt at målrette mod mange forskellige proteiner og signalprocesser ved hjælp af denne metode.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

Påvisning af vaskemiddel-følsomme interaktioner mellem Membranproteiner

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolering af Glomeruli og In Vivo mærkning af glomerulær celle overflade proteiner

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

Undersøgelse af metabolismen af seks systemiske insekticider i en nyetableret celle affjedrings kultur afledt af te (Camellia sinensis L.) Blade

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Oversættelse af Ribosome affinitets rensning (TRAP) for RNA-isolation fra endotelceller in vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Induction of Eryptosis in Red Blood Cells Using a Calcium Ionophore

Induktion af Eryptose i røde blodlegemer ved hjælp af en calcium Ionophore

Eryptosis, erythrocyte programmed cell death, occurs in a number of hematological diseases and during injury to erythrocytes. A hallmark of eryptotic ...

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

Karakteriserecellulære proteiner med in-cell hurtig fotokemisk oxidation af proteiner

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Tværgående 2000 af ældre ris(Oryza sativa L.) Kerner til scanning elektronmikroskopi imaging ved hjælp af pipette tips som immobilisering Support

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry

Optimeret inkorporering af alkynylfedtsyreanaloger til påvisning af fedtaylerede proteiner ved hjælp af klikkemi

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in ...

Myosin-Specific Adaptations of In vitro Fluorescence Microscopy-Based Motility Assays

Myosin-specifikke tilpasninger af In vitro Fluorescens Mikroskopi-Baserede Motilitet Assays

Myosin proteins bind and interact with filamentous actin (F-actin) and are found in organisms across the phylogenetic tree. Their structure and enzymatic ...

F&#246;rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

Förster Resonans Energioverførsel Målinger i Levende PlanteCeller

Sensitized emission-based F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) experiments are easily done but depend on the microscopic setup. Confocal laser ...