Name: immunostaining-based detection of dynamic alterations in red blood cell proteins
Uploaded: 2023-03-17T13:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunostaining-Based Detection of Dynamic Alterations in Red Blood Cell Proteins at JoVE.com

LK reconnaît le soutien d’une bourse du programme de formation à la recherche du gouvernement australien.

Les protocoles décrits ici sont conformes à la Déclaration d’Helsinki et ont été approuvés par les comités d’éthique de l’Université allemande des sports de Cologne (16/09/2013) et de l’Université Griffith (2019/808). Les volontaires ont été sélectionnés pour s’assurer de l’absence de pathologies pertinentes et ont fourni un consentement éclairé écrit.
1. Coloration des protéines des globules rouges à l’aide de protocoles d’immunohistochimie</p...

<ol>
	<li>Cohen, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+cell+life+span+heterogeneity+in+hematologically+normal+people+is+sufficient+to+alter+HbA1c.">Red cell life span heterogeneity in hematologically normal people is sufficient to alter HbA1c.</a> Blood. 112 (10), 4284-4291 (2008).</li><li>Mock, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+blood+cell+(RBC)+survival+determined+in+humans+using+RBCs+labeled+at+multiple+biotin+densities.">Red blood cell (RBC) survival determined in humans using RBCs labeled at multiple biotin densities.</a> Transfusion. 51 (5), 1047-1057 (2011).</li><li>Thiagarajan, P., Parker, C. J., Prchal, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+red+blood+cells+die?.">How do red blood cells die?.</a> Frontiers in Physiology. 12, 655393 (2021).</li><li>Moras, M., Lefevre, S. D., Ostuni, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+erythroblasts+to+mature+red+blood+cells:+organelle+clearance+in+mammals.">From erythroblasts to mature red blood cells: organelle clearance in mammals.</a> Frontiers in Physiology. 8, 1076 (2017).</li><li>Pretini, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+blood+cells:+chasing+interactions.">Red blood cells: chasing interactions.</a> Frontiers in Physiology. 10, 945 (2019).</li><li>Cahalan, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Piezo1+links+mechanical+forces+to+red+blood+cell+volume.">Piezo1 links mechanical forces to red blood cell volume.</a> eLife. 4, e07370 (2015).</li><li>Kuck, L., Peart, J. N., Simmonds, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Piezo1+regulates+shear-dependent+nitric+oxide+production+in+human+erythrocytes.">Piezo1 regulates shear-dependent nitric oxide production in human erythrocytes.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 323 (1), H24-H37 (2022).</li><li>Kuck, L., Peart, J. N., Simmonds, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+modulation+of+human+erythrocyte+mechanics.">Active modulation of human erythrocyte mechanics.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 319 (2), C250-C257 (2020).</li><li>Strader, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modification+as+a+response+to+cellular+stress+induced+by+hemoglobin+oxidation+in+sickle+cell+disease.">Post-translational modification as a response to cellular stress induced by hemoglobin oxidation in sickle cell disease.</a> Scientific Reports. 10 (1), 14218 (2020).</li><li>Pecankova, K., Majek, P., Cermak, J., Dyr, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranslational+modifications+of+red+blood+cell+ghost+proteins+as+&amp;#34;signatures&amp;#34;+for+distinguishing+between+low-+and+high-risk+myelodysplastic+syndrome+patients.">Posttranslational modifications of red blood cell ghost proteins as &amp;#34;signatures&amp;#34; for distinguishing between low- and high-risk myelodysplastic syndrome patients.</a> Turkish Journal of Haematology. 34 (1), 111-113 (2017).</li><li>Grau, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+red+blood+cell+nitric+oxide+synthase+activation+is+not+associated+with+improved+vascular+function+and+red+blood+cell+deformability+in+sickle+cell+anaemia.">High red blood cell nitric oxide synthase activation is not associated with improved vascular function and red blood cell deformability in sickle cell anaemia.</a> British Journal of Haematology. 168 (5), 728-736 (2015).</li><li>Sae-Lee, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+organization+of+a+red+blood+cell.">The protein organization of a red blood cell.</a> Cell Reports. 40 (3), 111103 (2022).</li><li>Suhr, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderate+exercise+promotes+human+RBC-NOS+activity,+NO+production+and+deformability+through+Akt+kinase+pathway.">Moderate exercise promotes human RBC-NOS activity, NO production and deformability through Akt kinase pathway.</a> PLoS One. 7 (9), e45982 (2012).</li><li>Kuck, L., Grau, M., Bloch, W., Simmonds, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+ameliorates+superoxide+impairment+to+erythrocyte+deformability+with+concurrent+nitric+oxide+synthase+activation.">Shear stress ameliorates superoxide impairment to erythrocyte deformability with concurrent nitric oxide synthase activation.</a> Frontiers in Physiology. 10, 36 (2019).</li><li>Grau, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RBC-NOS-dependent+S-nitrosylation+of+cytoskeletal+proteins+improves+RBC+deformability.">RBC-NOS-dependent S-nitrosylation of cytoskeletal proteins improves RBC deformability.</a> PLoS One. 8 (2), e56759 (2013).</li><li>Simmonds, M. J., Detterich, J. A., Connes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide,+vasodilation+and+the+red+blood+cell.">Nitric oxide, vasodilation and the red blood cell.</a> Biorheology. 51 (2-3), 121-134 (2014).</li><li>Bor-Kucukatay, M., Wenby, R. B., Meiselman, H. J., Baskurt, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+nitric+oxide+on+red+blood+cell+deformability.">Effects of nitric oxide on red blood cell deformability.</a> American Journal of Physiology. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-fractions+of+red+blood+cells+respond+differently+to+shear+exposure+following+superoxide+treatment.">Sub-fractions of red blood cells respond differently to shear exposure following superoxide treatment.</a> Biology. 10 (1), 47 (2021).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Oz&#252;yaman, B., Grau, M., Kelm, M., Merx, M. W., Kleinbongard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RBC+NOS:+regulatory+mechanisms+and+therapeutic+aspects.">RBC NOS: regulatory mechanisms and therapeutic aspects.</a> Trends in Molecular Medicine. 14 (7), 314-322 (2008).</li><li>Kleinbongard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+blood+cells+express+a+functional+endothelial+nitric+oxide+synthase.">Red blood cells express a functional endothelial nitric oxide synthase.</a> Blood. 107 (7), 2943-2951 (2006).</li><li>McMahon, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+blood+cell+deformability,+vasoactive+mediators,+and+adhesion.">Red blood cell deformability, vasoactive mediators, and adhesion.</a> Frontiers in Physiology. 10, 1417 (2019).</li><li>Bizjak, D. A., Brinkmann, C., Bloch, W., Grau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+in+red+blood+cell-nitric+oxide+synthase+dependent+nitric+oxide+production+during+red+blood+cell+aging+in+health+and+disease:+a+study+on+age+dependent+changes+of+rheologic+and+enzymatic+properties+in+red+blood+cells.">Increase in red blood cell-nitric oxide synthase dependent nitric oxide production during red blood cell aging in health and disease: a study on age dependent changes of rheologic and enzymatic properties in red blood cells.</a> PLoS One. 10 (4), 0125206 (2015).</li><li>Di Pietro, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+synthetic+pathway+and+cGMP+levels+are+altered+in+red+blood+cells+from+end-stage+renal+disease+patients.">Nitric oxide synthetic pathway and cGMP levels are altered in red blood cells from end-stage renal disease patients.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. 417 (1-2), 155-167 (2016).</li><li>Grau, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Even+patients+with+mild+COVID-19+symptoms+after+SARS-CoV-2+infection+show+prolonged+altered+red+blood+cell+morphology+and+rheological+parameters.">Even patients with mild COVID-19 symptoms after SARS-CoV-2 infection show prolonged altered red blood cell morphology and rheological parameters.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 26 (10), 3022-3030 (2022).</li><li>Mozar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+blood+cell+nitric+oxide+synthase+modulates+red+blood+cell+deformability+in+sickle+cell+anemia.">Red blood cell nitric oxide synthase modulates red blood cell deformability in sickle cell anemia.</a> Clinical Hemorheology and Microcirculation. 64 (1), 47-53 (2016).</li><li>Ulker, P., Gunduz, F., Meiselman, H. J., Baskurt, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+generated+by+red+blood+cells+following+exposure+to+shear+stress+dilates+isolated+small+mesenteric+arteries+under+hypoxic+conditions.">Nitric oxide generated by red blood cells following exposure to shear stress dilates isolated small mesenteric arteries under hypoxic conditions.</a> Clinical Hemorheology and Microcirculation. 54 (4), 357-369 (2013).</li><li>Nader, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxyurea+therapy+modulates+sickle+cell+anemia+red+blood+cell+physiology:+Impact+on+RBC+deformability,+oxidative+stress,+nitrite+levels+and+nitric+oxide+synthase+signalling+pathway.">Hydroxyurea therapy modulates sickle cell anemia red blood cell physiology: Impact on RBC deformability, oxidative stress, nitrite levels and nitric oxide synthase signalling pathway.</a> Nitric Oxide: Biology and Chemistry. 81, 28-35 (2018).</li><li>Fischer, U. M., Schindler, R., Brixius, K., Mehlhorn, U., Bloch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracorporeal+circulation+activates+endothelial+nitric+oxide+synthase+in+erythrocytes.">Extracorporeal circulation activates endothelial nitric oxide synthase in erythrocytes.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 84 (6), 2000-2003 (2007).</li><li>Horobin, J. T., Sabapathy, S., Kuck, L., Simmonds, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+and+RBC-NOS+Serine1177+Phosphorylation+in+humans:+a+dose+response.">Shear stress and RBC-NOS Serine1177 Phosphorylation in humans: a dose response.</a> Life. 11 (1), 36 (2021).</li><li>Kuck, L., Grau, M., Simmonds, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+time+course+of+erythrocyte+deformability+following+exposure+to+shear+is+dependent+upon+conditioning+shear+stress.">Recovery time course of erythrocyte deformability following exposure to shear is dependent upon conditioning shear stress.</a> Biorheology. 54 (5-6), 141-152 (2018).</li><li>Grau, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+acute+exercise+on+RBC+deformability+and+RBC+nitric+oxide+synthase+signalling+pathway+in+young+sickle+cell+anaemia+patients.">Effect of acute exercise on RBC deformability and RBC nitric oxide synthase signalling pathway in young sickle cell anaemia patients.</a> Scientific Reports. 9 (1), 11813 (2019).</li><li>Feelisch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Nitric Oxide Research. , (1998).</li><li>Cortese-Krott, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+red+blood+cells+at+work:+identification+and+visualization+of+erythrocytic+eNOS+activity+in+health+and+disease.">Human red blood cells at work: identification and visualization of erythrocytic eNOS activity in health and disease.</a> Blood>. 120 (20), 4229-4237 (2012).</li></ol>

La littérature récente suggère fortement que la protéine RBC-NOS est d’une importance cruciale pour la régulation de la déformabilité des globules rouges 15,22,23, ce qui facilite leur passage à travers les capillaires étroits 24. L’activité protéique dépend fortement des modifications protéiques post-traductionnelles, en particulier de la phosphorylation de certains résidus<sup class="...

Les globules rouges (GR) traversent le système cardiovasculaire pendant 70 à 140 jours, avec un âge moyen des globules rouges d’environ 115 jours 1,2. Les globules rouges sénescents ou endommagés sont éliminés de la circulation par érythrophagocytose, un processus d’élimination efficace entraîné par les macrophages3. La durée de vie prédéterminée de ces cellules est une conséquence de l’abandon des organites cellulaires, y compris le noyau, les mitochondries et les ribosomes, au cours de la différenciation et de la maturation4. Ainsi, les globules rouges circulants sont dépourvus de machinerie translationnelle, empêchant la synthèse de nouvelles protéines3. Il s’ensuit que les modifications dynamiques post-traductionnelles des protéines existantes représentent le seul mécanisme viable de régulation biochimique aiguë en réponse aux facteurs de stress extracellulaires et intracellulaires agissant sur les globules rouges5.
Les forces mécaniques semblent être les principaux indices extracellulaires qui provoquent l’activation ou la modulation des voies biochimiques dans les globules rouges. La découverte de la protéine mécanosensible, Piezo1, dans les membranes des globules rouges6 a inspiré plusieurs lignes de recherche sur la signalisation activée mécaniquement dans ces cellules7. Par exemple, des progrès récents ont montré que les propriétés physiques des globules rouges sont activement régulées par des changements aigus et dynamiques des protéines8, ce qui comprend la phosphorylation post-traductionnelle et l’ubiquitination9. Étant donné que ces modifications normales diffèrent dans certaines maladies 9,10,11, il semble être d’intérêt scientifique et clinique de déterminer l’état d’activation des protéines rouges, en particulier en relation avec les processus mécanobiologiques.
La détermination des changements aigus dans les états d’activation des protéines rouges pose certains défis méthodologiques. Par exemple, le stockage d’échantillons de globules rouges en vue d’une analyse ultérieure nécessite la préservation des protéines de globules rouges modifiées, car les modifications post-traductionnelles ne sont pas durables. De plus, les méthodes classiques de détection des protéines (par exemple, le transfert Western) sont notoirement difficiles à normaliser dans les globules rouges en raison de la faible abondance des protéines par rapport à l’hémoglobine, qui représente ~98% de la teneur en protéines de ces cellules12. Ainsi, la coloration par anticorps des globules rouges conservés chimiquement a été la méthode de choix pour étudier les modifications aiguës d’importantes protéines rouges, telles que l’isoforme spécifique des globules rouges de l’oxyde nitrique synthase (RBC-NOS)13,14. Il a été démontré que RBC-NOS produit de l’oxyde nitrique (NO) par voie enzymatique, ce qui semble indispensable pour les propriétés essentielles des globules rouges, y compris la déformabilité des globules rouges15,16,17. Les modifications post-traductionnelles de RBC-NOS régulent l’activité enzymatique catalytique, la phosphorylation du résidu de sérine 1177 étant décrite pour augmenter l’activité enzymatique, tandis que la phosphorylation des résidus sérine 114 ou thréonine 495 a été associée à une diminution de l’activité RBC-NOS18,19.
Collectivement, les modifications temporaires des protéines des globules rouges contribuent à une fonction cellulaire importante, et les protocoles normalisés qui permettent la détection de ces protéines modifiées sont d’une grande valeur. Ici, nous présentons deux protocoles distincts qui exploitent des anticorps spécifiques pour faciliter la détection de l’activation de la protéine RBC-NOS, et discutons des recommandations pour l’analyse et l’interprétation des données.
La performance des protocoles décrits a été évaluée en mesurant l’augmentation bien rapportée de la phosphorylation des globules rouges NOS au niveau du résidu de sérine 1177 en réponse à des forces mécaniques reflétant celles qui se produisent dans le système vasculaire humain (5 Pa).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3,3&#8242;-Diaminobenzidin -tetrahydrochloride Hydrate</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>D5637</td>
			<td>DAB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammoniumchloride&#160;</td>
			<td>Merck /Millipore</td>
			<td>101145</td>
			<td>NH4Cl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5427 R&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5409000010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0147&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>di-sodium Hydrogen Phosphate Dihydrate&#160;</td>
			<td>Merck /Millipore</td>
			<td>106580</td>
			<td>Na2HPO4. 2 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable transfer pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-6803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Entellan</td>
			<td>Merck /Millipore</td>
			<td>107961</td>
			<td>rapid mounting medium for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol denaturated using 1 % methyl ethyl ketone (MEK)</td>
			<td>Hofmann</td>
			<td>642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose-Oxidase</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>G2133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grease pencil&#160;</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S 2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse-radish peroxidase/ExtrAvidin&#8722;Peroxidase</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>E-2886</td>
			<td>HRP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid&#160;</td>
			<td>Merck /Millipore</td>
			<td>109057</td>
			<td>HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide, 30%</td>
			<td>Merck /Millipore</td>
			<td>107203</td>
			<td>H2O2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>Freeware</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser-assisted optical rotational cell analyser (LORCA)</td>
			<td>RR Mechatronics</td>
			<td></td>
			<td>Ektacytometer instrument used for shearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Merck /Millipore</td>
			<td>106009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>630-1985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel(II)-sulfate Hexahydrate&#160;</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>N4882</td>
			<td>NiSO4.6H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat serum</td>
			<td>Agilent/DAKO</td>
			<td>X0907</td>
			<td>NGS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck /Millipore</td>
			<td>818715</td>
			<td>PFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes Eppendorf Reference 2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-5836/ 613-5839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-phospho eNOS Antibody (Ser1177)</td>
			<td>Merck/Millipore</td>
			<td>07-428-I</td>
			<td>Primary Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction tubes, 2ml</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary Antibody goat anti rabbit</td>
			<td>Agilent/DAKO</td>
			<td>E0432</td>
			<td>Secondary Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk powder</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-6404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride&#160;</td>
			<td>Merck /Millipore</td>
			<td>106404</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate</td>
			<td>Merck /Millipore</td>
			<td>106346</td>
			<td>NaH2PO4.H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide, 1 M</td>
			<td>Merck /Millipore</td>
			<td>150706</td>
			<td>NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)-aminomethane</td>
			<td>Merck /Millipore</td>
			<td>108382</td>
			<td>Tris</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>T7409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20&#160;</td>
			<td>Merck /Millipore</td>
			<td>822184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Glas microfiber filter, quality GF/F</td>
			<td>Merck /Millipore</td>
			<td>WHA1825047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylol</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>2,89,73,465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#223;-D-Glucose monohydrate</td>
			<td>Merck /Millipore</td>
			<td>14431-43-7</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunostaining-based detection of dynamic alterations in red blood cell proteins

Le marquage des anticorps des protéines des globules rouges (GR) est une méthode semi-quantitative couramment utilisée pour détecter les changements dans la teneur globale en protéines ou les altérations aiguës des états d’activation des protéines. Il facilite l’évaluation des traitements des globules rouges, la caractérisation des différences dans certains états pathologiques et la description des cohérences cellulaires. La détection d’une altération aiguë de l’activation protéique (p. ex. par mécanotransduction) nécessite une préparation adéquate de l’échantillon pour préserver les modifications protéiques autrement temporaires. Le principe de base comprend l’immobilisation des sites de liaison cibles des protéines rouges souhaitées pour permettre la liaison initiale d’anticorps primaires spécifiques. L’échantillon est ensuite traité pour garantir des conditions optimales pour la liaison de l’anticorps secondaire à l’anticorps primaire correspondant. La sélection d’anticorps secondaires non fluorescents nécessite un traitement supplémentaire, y compris le couplage biotine-avidine et l’application de 3,3-diaminobenzidine-tétrachlorhydrate (DAB) pour développer la coloration, qui doit être contrôlée en temps réel au microscope afin d’arrêter l’oxydation, et donc l’intensité de la coloration, à temps. Pour la détection de l’intensité de la coloration, les images sont prises à l’aide d’un microscope optique standard. Dans une modification de ce protocole, un anticorps secondaire conjugué à la fluorescéine peut être appliqué à la place, ce qui présente l’avantage qu’aucune autre étape de développement n’est nécessaire. Cette procédure, cependant, nécessite un objectif de fluorescence attaché à un microscope pour la détection des colorations. Compte tenu de la nature semi-quantitative de ces méthodes, il est impératif de fournir plusieurs colorants de contrôle pour tenir compte des réactions d’anticorps non spécifiques et des signaux de fond. Ici, nous présentons à la fois les protocoles de coloration et les processus analytiques correspondants pour comparer et discuter des résultats et avantages respectifs des différentes techniques de coloration.

Le protocole présenté, décrivant les méthodes qui facilitent la détection des altérations aiguës des protéines rouges, a été testé sur une altération protéique bien connue et sensible mécaniquement : la phosphorylation des globules rouges-NOS au niveau du résidu de sérine 1177. Le sang total a été obtenu à partir de volontaires sains et ensuite divisé en deux aliquotes distinctes. Un échantillon de sang donné a été exposé à une contrainte de cisaillement mécanique d’une ampleur physiologique ...

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Immunostaining-Based Detection of Dynamic Alterations in Red Blood Cell Proteins

La capture des changements dynamiques dans l’activation protéique des globules rouges énucléés pose des défis méthodologiques, comme la préservation des changements dynamiques des stimuli aigus pour une évaluation ultérieure. Le protocole présenté décrit les techniques de préparation et de coloration des échantillons qui permettent la préservation et l’analyse des changements protéiques pertinents et la détection ultérieure.

Détection basée sur l’immunomarquage d’altérations dynamiques dans les protéines des globules rouges

Antibody labeling of red blood cell (RBC) proteins is a commonly used, semi-quantitative method to detect changes in overall protein content or acute ...

Notre méthode rend possibles les investigations subcellulaires mécanistes dans le domaine en évolution rapide de la mécanobiologie en fixant les modifications protéiques temporaires en place, puis en les détectant avec des anticorps spécifiques. Cette méthode est techniquement facile à appliquer. Les résultats sont très valables et reproductibles.De plus, par rapport à d’autres techniques, notre méthode pourrait vraiment être utilisée efficacement dans le domaine émergent de la signalisation post-traductionnelle des globules rouges, qui dépend de modifications temporaires des protéines, en particulier la mécanosignalisation des globules rouges. Pour effectuer la fixation des protéines de globules rouges, diluer le sang total dans un rapport de un à deux dans une solution de paraformaldéhyde à 4% pendant 20 minutes à température ambiante. Centrifuger la solution sanguine à 132 g pendant trois minutes à température ambiante et retirer délicatement le surnageant.Remettez en suspension la pastille de globule de globule de globule de globule en deux volumes de PBS 0,1 molaire et incuber pendant cinq minutes à température ambiante. Encore une fois, centrifuger l’échantillon et retirer le surnageant avant de remettre en suspension la pastille de globule rouge dans un volume de 0,1 molaire de PBS. Étiquetez une lame de microscope avec l’ID de l’échantillon et l’anticorps appliqué à l’aide d’un stylo résistant à l’alcool.Ajouter 10 microlitres de la solution de globule rouge préparée. Placez une deuxième lame sur l’échantillon à un angle de 45 degrés et dispersez l’échantillon uniformément le long de la lame. Fixez la lame à chaud en faisant passer l’échantillon au-dessus du brûleur Bunsen avec un mouvement constant pendant cinq à sept secondes.Pour la coloration immunohistochimique, marquez la zone 2/3 de la lame comme test et 1/3 comme témoin à l’aide d’un crayon à graisse. Ensuite, lavez les zones d’échantillon deux fois en appliquant TBS pendant 30 secondes. Après le deuxième lavage, ajoutez 0,1% de trypsine et couvrez la lame à l’aide d’une chambre d’incubation spécialement conçue avec un couvercle.Incuber l’échantillon pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Remplissez un bécher avec de l’eau du robinet et arrêtez la réaction enzymatique en ajoutant l’eau du robinet du bécher sur la lame. Versez la solution et lavez les deux zones trois fois avec TBS.Après le lavage final, ajouter la solution bloquant la peroxydase et incuber pendant 30 minutes à température ambiante. Après l’incubation, verser la solution et laver les deux zones trois fois avec TBS. Ajouter ensuite la solution de lait écrémé à 3% et incuber pendant 30 minutes.Après l’incubation, verser la solution et ajouter la solution d’anticorps primaires dans la zone d’essai. Ajouter la solution de contrôle des anticorps à la zone de contrôle. Incuber les échantillons à quatre degrés Celsius pendant la nuit.Le lendemain, versez la solution d’anticorps et lavez les deux zones trois fois avec TBS. Ajoutez ensuite une solution de sérum de chèvre normale à 3% pour éviter une liaison non spécifique et incuber pendant 30 minutes. Après l’incubation, ajouter une solution d’anticorps secondaire et incuber pendant 30 minutes.Versez la solution d’anticorps et lavez les zones trois fois avec TBS avant de procéder au développement de la coloration. Ensuite, pour effectuer une réaction de peroxydase de raifort couplée à l’avidine, ajoutez une solution diluée d’avidine peroxydase et incuber pendant 30 minutes. Placez la lame sous un microscope à un grossissement de 200 fois et ajoutez une solution de DAB fraîchement préparée aux deux zones.Surveillez la coloration des globules rouges en continu et arrêtez la coloration en retirant la solution DAB avec une pipette jetable avant que l’arrière-plan ne commence à colorer. Pour effectuer la déshydratation de l’échantillon, placez la lame dans une grille en verre et plongez pendant cinq secondes chacune dans des concentrations croissantes d’éthanol et, enfin, dans du xylol. Après la déshydratation, placez la lame sur du papier de soie avec les globules rouges en haut pour absorber l’excès de liquide.Ajouter deux ou trois gouttes de support de montage sur un bordereau de couvercle et couvrir la lame à l’aide du bordereau de couverture. Pour la visualisation et l’imagerie, placez la lame dans un microscope à lumière transmise couplé à une caméra. Allumez la source lumineuse et l’appareil photo et démarrez le logiciel.En mode Champ clair, concentrez les globules rouges en tournant les boutons de réglage de la mise au point grossiers et fins. De même, concentrez les globules rouges en mode fluorescent. Pour analyser la valeur de gris RBC, marquez le bord de chaque RBC à l’aide de l’outil de sélection ovale du logiciel ImageJ.À l’aide de la commande Mesurer, mesurez les valeurs de gris de 50 RBC du test et de 10 RBC du contrôle. Pour la coloration immunofluorescente des protéines rouges, incuber l’échantillon avec un anticorps secondaire conjugué par fluorescence pendant 30 minutes à température ambiante, en le protégeant de la lumière. Après l’incubation, versez la solution d’anticorps et lavez la lame trois fois avec TBS.Laisser le TBS sur l’échantillon après le lavage final. Déshydrater l’échantillon et préparer la lame avec un couvercle pour l’évaluation microscopique comme démontré. Allumez le microscope et la source lumineuse fluorescente, puis faites la mise au point des globules rouges en mode Champ clair.Capturez des images en fond clair et fluorescentes dans au moins trois zones distinctes de la zone de test de la diapositive sélectionnée au hasard. Réglez le temps d’exposition sur une seconde pour les images fluorescentes et capturez une image. Passez ensuite en mode Champ clair, réglez le temps d’exposition sur Auto et capturez l’image en champ clair correspondante.Enregistrez les images au format TIFF. Capturez des images fluorescentes et en champ clair dans au moins deux zones distinctes sélectionnées au hasard de la zone de contrôle de la diapositive. Enregistrez les images au format TIFF pour préserver les valeurs de gris d’origine des pixels, empêcher la compression et transporter les métadonnées de l’acquisition.Pour mesurer les valeurs de gris des GRC capturés, ouvrez ImageJ. Marquez chaque cellule avec l’outil de sélection ovale et analysez à l’aide de la commande Mesurer. Mettez en surbrillance entre trois et cinq zones exemptes de globules rouges et déterminez les valeurs de gris pour mesurer le signal de fond.Pour effectuer une analyse alternative des données des images capturées, créez une commande macro via la version fidjienne d’ImageJ pour la sélection automatisée, la correction de l’arrière-plan et l’analyse des valeurs de gris d’une image donnée. Ouvrez l’image au format TIFF pour analyse aux Fidji. Ouvrez ensuite la fluorescence des globules rouges.ijm , puis cliquez sur Exécuter. Le signal des anticorps ciblant l’oxyde nitrique synthase RB, ou NOS, phosphorylés au niveau du résidu de sérine 1177 au repos et en réponse à une exposition à la force mécanique a été évalué à l’aide de l’immunohistochimie et de l’immunofluorescence. Une multiplication par trois du signal des anticorps ciblant les globules rouges phosphorylés au niveau du résidu de sérine 1177 a été détectée en réponse à l’exposition à la force mécanique des globules rouges par rapport aux cellules non cisaillées respectives lors de l’évaluation par immunohistochimie ou immunofluorescence.L’utilisateur doit s’assurer que l’anticorps n’est appliqué que sur la zone de test. Sinon, l’échantillon ne peut pas être analysé en raison d’un contrôle manquant. Compte tenu de la disponibilité d’une grande variété d’anticorps, il est possible de cibler de nombreuses protéines et processus de signalisation différents en utilisant cette méthode.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

Détection de détergent-sensibles aux Interactions entre les protéines membranaires

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

Recherche

Biochimie

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

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Isolement des glomérules et In Vivo , marquage des protéines de Surface de cellules glomérulaire

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

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Étude sur le métabolisme de six insecticides systémiques dans une culture de suspension cellulaire nouvellement établie dérivée du thé (Camellia Sinensis L.) feuilles

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Traduire Ribosome Affinity Purification (TRAP) pour l'isolement de l'ARN des cellules endothéliales in vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Induction of Eryptosis in Red Blood Cells Using a Calcium Ionophore

Induction de l'éryptose dans les globules rouges à l'aide d'un ionophore de calcium

Eryptosis, erythrocyte programmed cell death, occurs in a number of hematological diseases and during injury to erythrocytes. A hallmark of eryptotic ...

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

Caractériser les protéines cellulaires avec l’oxydation photochimique rapide à cellule des protéines

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

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Sectionnement transversal du riz mature (Oryza sativa L.) Noyaux pour l’imagerie par microscopie électronique à balayage à l’aide d’embouts de pipette comme support d’immobilisation

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry

Incorporation optimisée d’analogues d’acides gras alcynyles pour la détection de protéines acylées grasses à l’aide de la chimie du clic

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in ...

Myosin-Specific Adaptations of In vitro Fluorescence Microscopy-Based Motility Assays

Adaptations spécifiques à la myosine des tests de motilité basés sur la microscopie à fluorescence in vitro

Myosin proteins bind and interact with filamentous actin (F-actin) and are found in organisms across the phylogenetic tree. Their structure and enzymatic ...

F&#246;rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

Mesures de transfert d’énergie par résonance de Förster dans des cellules végétales vivantes

Sensitized emission-based F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) experiments are easily done but depend on the microscopic setup. Confocal laser ...