Name: immunostaining-based detection of dynamic alterations in red blood cell proteins
Uploaded: 2023-03-17T13:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunostaining-Based Detection of Dynamic Alterations in Red Blood Cell Proteins at JoVE.com

A LK reconhece o apoio de uma bolsa do Programa de Treinamento em Pesquisa do Governo Australiano.

Os protocolos aqui descritos estão alinhados com a Declaração de Helsinque e foram aprovados pelos Comitês de Ética da Universidade Alemã de Esportes de Colônia (16/9/2013) e da Universidade Griffith (2019/808). Os voluntários foram triados para garantir a ausência de patologias relevantes e assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido.
1. Coloração de proteínas eritrocitárias utilizando protocolos de imunohistoquímica
NOTA: Um...

<ol>
	<li>Cohen, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+cell+life+span+heterogeneity+in+hematologically+normal+people+is+sufficient+to+alter+HbA1c.">Red cell life span heterogeneity in hematologically normal people is sufficient to alter HbA1c.</a> Blood. 112 (10), 4284-4291 (2008).</li><li>Mock, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+blood+cell+(RBC)+survival+determined+in+humans+using+RBCs+labeled+at+multiple+biotin+densities.">Red blood cell (RBC) survival determined in humans using RBCs labeled at multiple biotin densities.</a> Transfusion. 51 (5), 1047-1057 (2011).</li><li>Thiagarajan, P., Parker, C. J., Prchal, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+red+blood+cells+die?.">How do red blood cells die?.</a> Frontiers in Physiology. 12, 655393 (2021).</li><li>Moras, M., Lefevre, S. D., Ostuni, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+erythroblasts+to+mature+red+blood+cells:+organelle+clearance+in+mammals.">From erythroblasts to mature red blood cells: organelle clearance in mammals.</a> Frontiers in Physiology. 8, 1076 (2017).</li><li>Pretini, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+blood+cells:+chasing+interactions.">Red blood cells: chasing interactions.</a> Frontiers in Physiology. 10, 945 (2019).</li><li>Cahalan, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Piezo1+links+mechanical+forces+to+red+blood+cell+volume.">Piezo1 links mechanical forces to red blood cell volume.</a> eLife. 4, e07370 (2015).</li><li>Kuck, L., Peart, J. N., Simmonds, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Piezo1+regulates+shear-dependent+nitric+oxide+production+in+human+erythrocytes.">Piezo1 regulates shear-dependent nitric oxide production in human erythrocytes.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 323 (1), H24-H37 (2022).</li><li>Kuck, L., Peart, J. N., Simmonds, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+modulation+of+human+erythrocyte+mechanics.">Active modulation of human erythrocyte mechanics.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 319 (2), C250-C257 (2020).</li><li>Strader, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modification+as+a+response+to+cellular+stress+induced+by+hemoglobin+oxidation+in+sickle+cell+disease.">Post-translational modification as a response to cellular stress induced by hemoglobin oxidation in sickle cell disease.</a> Scientific Reports. 10 (1), 14218 (2020).</li><li>Pecankova, K., Majek, P., Cermak, J., Dyr, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranslational+modifications+of+red+blood+cell+ghost+proteins+as+&amp;#34;signatures&amp;#34;+for+distinguishing+between+low-+and+high-risk+myelodysplastic+syndrome+patients.">Posttranslational modifications of red blood cell ghost proteins as &amp;#34;signatures&amp;#34; for distinguishing between low- and high-risk myelodysplastic syndrome patients.</a> Turkish Journal of Haematology. 34 (1), 111-113 (2017).</li><li>Grau, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+red+blood+cell+nitric+oxide+synthase+activation+is+not+associated+with+improved+vascular+function+and+red+blood+cell+deformability+in+sickle+cell+anaemia.">High red blood cell nitric oxide synthase activation is not associated with improved vascular function and red blood cell deformability in sickle cell anaemia.</a> British Journal of Haematology. 168 (5), 728-736 (2015).</li><li>Sae-Lee, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+organization+of+a+red+blood+cell.">The protein organization of a red blood cell.</a> Cell Reports. 40 (3), 111103 (2022).</li><li>Suhr, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderate+exercise+promotes+human+RBC-NOS+activity,+NO+production+and+deformability+through+Akt+kinase+pathway.">Moderate exercise promotes human RBC-NOS activity, NO production and deformability through Akt kinase pathway.</a> PLoS One. 7 (9), e45982 (2012).</li><li>Kuck, L., Grau, M., Bloch, W., Simmonds, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+ameliorates+superoxide+impairment+to+erythrocyte+deformability+with+concurrent+nitric+oxide+synthase+activation.">Shear stress ameliorates superoxide impairment to erythrocyte deformability with concurrent nitric oxide synthase activation.</a> Frontiers in Physiology. 10, 36 (2019).</li><li>Grau, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RBC-NOS-dependent+S-nitrosylation+of+cytoskeletal+proteins+improves+RBC+deformability.">RBC-NOS-dependent S-nitrosylation of cytoskeletal proteins improves RBC deformability.</a> PLoS One. 8 (2), e56759 (2013).</li><li>Simmonds, M. J., Detterich, J. A., Connes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide,+vasodilation+and+the+red+blood+cell.">Nitric oxide, vasodilation and the red blood cell.</a> Biorheology. 51 (2-3), 121-134 (2014).</li><li>Bor-Kucukatay, M., Wenby, R. B., Meiselman, H. J., Baskurt, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+nitric+oxide+on+red+blood+cell+deformability.">Effects of nitric oxide on red blood cell deformability.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 284 (5), H1577-H1584 (2003).</li><li>Suhr, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intensive+exercise+induces+changes+of+endothelial+nitric+oxide+synthase+pattern+in+human+erythrocytes.">Intensive exercise induces changes of endothelial nitric oxide synthase pattern in human erythrocytes.</a> Nitric Oxide: Biology and Chemistry. 20 (2), 95-103 (2009).</li><li>Grau, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+red+blood+cell+deformability+is+independent+of+red+blood+cell-nitric+oxide+synthase+under+hypoxia.">Regulation of red blood cell deformability is independent of red blood cell-nitric oxide synthase under hypoxia.</a> Clinical Hemorheology and Microcirculation. 63 (3), 199-215 (2016).</li><li>Grau, M., Kuck, L., Dietz, T., Bloch, W., Simmonds, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-fractions+of+red+blood+cells+respond+differently+to+shear+exposure+following+superoxide+treatment.">Sub-fractions of red blood cells respond differently to shear exposure following superoxide treatment.</a> Biology. 10 (1), 47 (2021).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Oz&#252;yaman, B., Grau, M., Kelm, M., Merx, M. W., Kleinbongard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RBC+NOS:+regulatory+mechanisms+and+therapeutic+aspects.">RBC NOS: regulatory mechanisms and therapeutic aspects.</a> Trends in Molecular Medicine. 14 (7), 314-322 (2008).</li><li>Kleinbongard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+blood+cells+express+a+functional+endothelial+nitric+oxide+synthase.">Red blood cells express a functional endothelial nitric oxide synthase.</a> Blood. 107 (7), 2943-2951 (2006).</li><li>McMahon, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+blood+cell+deformability,+vasoactive+mediators,+and+adhesion.">Red blood cell deformability, vasoactive mediators, and adhesion.</a> Frontiers in Physiology. 10, 1417 (2019).</li><li>Bizjak, D. A., Brinkmann, C., Bloch, W., Grau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+in+red+blood+cell-nitric+oxide+synthase+dependent+nitric+oxide+production+during+red+blood+cell+aging+in+health+and+disease:+a+study+on+age+dependent+changes+of+rheologic+and+enzymatic+properties+in+red+blood+cells.">Increase in red blood cell-nitric oxide synthase dependent nitric oxide production during red blood cell aging in health and disease: a study on age dependent changes of rheologic and enzymatic properties in red blood cells.</a> PLoS One. 10 (4), 0125206 (2015).</li><li>Di Pietro, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+synthetic+pathway+and+cGMP+levels+are+altered+in+red+blood+cells+from+end-stage+renal+disease+patients.">Nitric oxide synthetic pathway and cGMP levels are altered in red blood cells from end-stage renal disease patients.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. 417 (1-2), 155-167 (2016).</li><li>Grau, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Even+patients+with+mild+COVID-19+symptoms+after+SARS-CoV-2+infection+show+prolonged+altered+red+blood+cell+morphology+and+rheological+parameters.">Even patients with mild COVID-19 symptoms after SARS-CoV-2 infection show prolonged altered red blood cell morphology and rheological parameters.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 26 (10), 3022-3030 (2022).</li><li>Mozar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+blood+cell+nitric+oxide+synthase+modulates+red+blood+cell+deformability+in+sickle+cell+anemia.">Red blood cell nitric oxide synthase modulates red blood cell deformability in sickle cell anemia.</a> Clinical Hemorheology and Microcirculation. 64 (1), 47-53 (2016).</li><li>Ulker, P., Gunduz, F., Meiselman, H. J., Baskurt, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+generated+by+red+blood+cells+following+exposure+to+shear+stress+dilates+isolated+small+mesenteric+arteries+under+hypoxic+conditions.">Nitric oxide generated by red blood cells following exposure to shear stress dilates isolated small mesenteric arteries under hypoxic conditions.</a> Clinical Hemorheology and Microcirculation. 54 (4), 357-369 (2013).</li><li>Nader, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxyurea+therapy+modulates+sickle+cell+anemia+red+blood+cell+physiology:+Impact+on+RBC+deformability,+oxidative+stress,+nitrite+levels+and+nitric+oxide+synthase+signalling+pathway.">Hydroxyurea therapy modulates sickle cell anemia red blood cell physiology: Impact on RBC deformability, oxidative stress, nitrite levels and nitric oxide synthase signalling pathway.</a> Nitric Oxide: Biology and Chemistry. 81, 28-35 (2018).</li><li>Fischer, U. M., Schindler, R., Brixius, K., Mehlhorn, U., Bloch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracorporeal+circulation+activates+endothelial+nitric+oxide+synthase+in+erythrocytes.">Extracorporeal circulation activates endothelial nitric oxide synthase in erythrocytes.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 84 (6), 2000-2003 (2007).</li><li>Horobin, J. T., Sabapathy, S., Kuck, L., Simmonds, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+and+RBC-NOS+Serine1177+Phosphorylation+in+humans:+a+dose+response.">Shear stress and RBC-NOS Serine1177 Phosphorylation in humans: a dose response.</a> Life. 11 (1), 36 (2021).</li><li>Kuck, L., Grau, M., Simmonds, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+time+course+of+erythrocyte+deformability+following+exposure+to+shear+is+dependent+upon+conditioning+shear+stress.">Recovery time course of erythrocyte deformability following exposure to shear is dependent upon conditioning shear stress.</a> Biorheology. 54 (5-6), 141-152 (2018).</li><li>Grau, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+acute+exercise+on+RBC+deformability+and+RBC+nitric+oxide+synthase+signalling+pathway+in+young+sickle+cell+anaemia+patients.">Effect of acute exercise on RBC deformability and RBC nitric oxide synthase signalling pathway in young sickle cell anaemia patients.</a> Scientific Reports. 9 (1), 11813 (2019).</li><li>Feelisch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Nitric Oxide Research. , (1998).</li><li>Cortese-Krott, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+red+blood+cells+at+work:+identification+and+visualization+of+erythrocytic+eNOS+activity+in+health+and+disease.">Human red blood cells at work: identification and visualization of erythrocytic eNOS activity in health and disease.</a> Blood>. 120 (20), 4229-4237 (2012).</li></ol>

A literatura recente sugere que a proteína RBC-NOS é de fundamental importância para a regulação da deformabilidade das hemácias 15,22,23, o que, por sua vez, facilita sua passagem por capilares estreitos 24. A atividade proteica depende fortemente de modificações proteicas pós-traducionais, particularmente da fosforilação de certos resíduos18. O foco de interesse est?...

As hemácias (hemácias) atravessam o sistema cardiovascular por 70 a 140 dias, com idade média das hemácias de aproximadamente 115 dias 1,2. As hemácias senescentes ou lesadas são removidas da circulação por eritrofagocitose, um eficiente processo de clareamento conduzido por macrófagos3. O tempo de vida predeterminado dessas células é uma consequência da entrega das organelas celulares, incluindo o núcleo, as mitocôndrias e os ribossomos, durante a diferenciação e maturação4. Assim, as hemácias circulantes são desprovidas de maquinaria translacional, impossibilitando a síntese de novas proteínas3. Conclui-se que modificações dinâmicas e pós-traducionais em proteínas existentes representam o único mecanismo viável de regulação bioquímica aguda em resposta a estressores extracelulares e intracelulares que atuam sobre as hemácias5.
As forças mecânicas parecem ser as principais pistas extracelulares que causam a ativação ou modulação de vias bioquímicas dentro das hemácias. A descoberta da proteína mecanossensível, Piezo1, em membranas eritrocitárias6 inspirou várias linhas de pesquisa investigando a sinalização ativada mecanicamente nessas células7. Por exemplo, avanços recentes têm mostrado que as propriedades físicas das hemácias são ativamente reguladas por mudanças agudas e dinâmicas das proteínas8, o que inclui fosforilação pós-traducional e ubiquitinação9. Como essas modificações normais diferem em certas doenças 9,10,11, parece ser de interesse científico e clínico determinar o estado de ativação das proteínas eritrocitárias, especificamente em relação aos processos mecanobiológicos.
A determinação de alterações agudas nos estados de ativação de proteínas eritrocitárias apresenta alguns desafios metodológicos. Por exemplo, o armazenamento de amostras de hemácias para análise posterior requer a preservação das proteínas eritrocitárias modificadas, uma vez que as modificações pós-traducionais não são duráveis. Além disso, os métodos clássicos de detecção de proteínas (por exemplo, western blotting) são notoriamente difíceis de padronizar em hemácias devido à baixa abundância de proteínas em relação à hemoglobina, que responde por ~98% do conteúdo proteico nessas células12. Assim, a coloração de hemácias quimicamente preservadas com base em anticorpos tem sido o método de escolha na investigação de modificações agudas de importantes proteínas eritrocitárias, como a isoforma eritrocitária específica da óxido nítrico sintase (RBC-NOS)13,14. Demonstrou-se que as hemácias-NOS produzem enzimaticamente óxido nítrico (NO), o que parece indispensável para propriedades essenciais das hemácias, incluindo a deformabilidade das hemácias15,16,17. Modificações pós-traducionais de RBC-NOS regulam a atividade enzimática catalítica, com a fosforilação do resíduo de serina 1177 sendo descrita para aumentar a atividade enzimática, enquanto a fosforilação dos resíduos serina 114 ou treonina 495 tem sido associada à diminuição da atividade de RBC-NOS18,19.
Coletivamente, modificações temporárias de proteínas eritrocitárias contribuem para importante função celular, e protocolos padronizados que permitem a detecção dessas proteínas modificadas são de alto valor. Aqui, apresentamos dois protocolos distintos que exploram anticorpos específicos para facilitar a detecção da ativação da proteína eritrocitária-NOS, e discutimos recomendações para análise e interpretação dos dados.
O desempenho dos protocolos descritos foi avaliado medindo-se o aumento bem relatado na fosforilação de eritrócitos-NOS no resíduo de serina 1177 em resposta a forças mecânicas reflexivas daquelas que ocorrem dentro da vasculatura humana (5 Pa).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3,3&#8242;-Diaminobenzidin -tetrahydrochloride Hydrate</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>D5637</td>
			<td>DAB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammoniumchloride&#160;</td>
			<td>Merck /Millipore</td>
			<td>101145</td>
			<td>NH4Cl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5427 R&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5409000010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0147&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>di-sodium Hydrogen Phosphate Dihydrate&#160;</td>
			<td>Merck /Millipore</td>
			<td>106580</td>
			<td>Na2HPO4. 2 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable transfer pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-6803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Entellan</td>
			<td>Merck /Millipore</td>
			<td>107961</td>
			<td>rapid mounting medium for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol denaturated using 1 % methyl ethyl ketone (MEK)</td>
			<td>Hofmann</td>
			<td>642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose-Oxidase</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>G2133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grease pencil&#160;</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S 2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse-radish peroxidase/ExtrAvidin&#8722;Peroxidase</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>E-2886</td>
			<td>HRP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid&#160;</td>
			<td>Merck /Millipore</td>
			<td>109057</td>
			<td>HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide, 30%</td>
			<td>Merck /Millipore</td>
			<td>107203</td>
			<td>H2O2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>Freeware</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser-assisted optical rotational cell analyser (LORCA)</td>
			<td>RR Mechatronics</td>
			<td></td>
			<td>Ektacytometer instrument used for shearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Merck /Millipore</td>
			<td>106009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>630-1985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel(II)-sulfate Hexahydrate&#160;</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>N4882</td>
			<td>NiSO4.6H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat serum</td>
			<td>Agilent/DAKO</td>
			<td>X0907</td>
			<td>NGS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck /Millipore</td>
			<td>818715</td>
			<td>PFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes Eppendorf Reference 2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-5836/ 613-5839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-phospho eNOS Antibody (Ser1177)</td>
			<td>Merck/Millipore</td>
			<td>07-428-I</td>
			<td>Primary Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction tubes, 2ml</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary Antibody goat anti rabbit</td>
			<td>Agilent/DAKO</td>
			<td>E0432</td>
			<td>Secondary Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk powder</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-6404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride&#160;</td>
			<td>Merck /Millipore</td>
			<td>106404</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate</td>
			<td>Merck /Millipore</td>
			<td>106346</td>
			<td>NaH2PO4.H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide, 1 M</td>
			<td>Merck /Millipore</td>
			<td>150706</td>
			<td>NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)-aminomethane</td>
			<td>Merck /Millipore</td>
			<td>108382</td>
			<td>Tris</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>T7409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20&#160;</td>
			<td>Merck /Millipore</td>
			<td>822184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Glas microfiber filter, quality GF/F</td>
			<td>Merck /Millipore</td>
			<td>WHA1825047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylol</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>2,89,73,465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#223;-D-Glucose monohydrate</td>
			<td>Merck /Millipore</td>
			<td>14431-43-7</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunostaining-based detection of dynamic alterations in red blood cell proteins

A marcação de anticorpos de proteínas eritrocitárias é um método semiquantitativo comumente usado para detectar mudanças no conteúdo global de proteínas ou alterações agudas em estados de ativação proteica. Facilita a avaliação de tratamentos eritrocitários, a caracterização de diferenças em determinados estados patológicos e a descrição de coerências celulares. A detecção de ativação proteica agudamente alterada (por exemplo, através de mecanotransdução) requer preparação adequada da amostra para preservar modificações proteicas temporárias. O princípio básico inclui a imobilização dos sítios de ligação alvo das proteínas eritrocitárias desejadas para permitir a ligação inicial de anticorpos primários específicos. A amostra é posteriormente processada para garantir condições ideais para a ligação do anticorpo secundário ao anticorpo primário correspondente. A seleção de anticorpos secundários não fluorescentes requer tratamento adicional, incluindo o acoplamento biotina-avidina e a aplicação de 3,3-diaminobenzidina-tetracloridrato (DAB) para desenvolver a coloração, que precisa ser controlada em tempo real sob um microscópio para interromper a oxidação e, assim, colorir a intensidade a tempo. Para a detecção da intensidade da coloração, as imagens são obtidas usando um microscópio de luz padrão. Em uma modificação deste protocolo, um anticorpo secundário conjugado à fluoresceína pode ser aplicado em seu lugar, o que tem a vantagem de que nenhuma etapa adicional de desenvolvimento é necessária. Este procedimento, no entanto, requer uma objetiva de fluorescência acoplada a um microscópio para detecção da coloração. Dada a natureza semiquantitativa desses métodos, é imperativo fornecer várias colorações de controle para explicar reações de anticorpos inespecíficos e sinais de fundo. Aqui, apresentamos os protocolos de coloração e os processos analíticos correspondentes para comparar e discutir os respectivos resultados e vantagens das diferentes técnicas de coloração.

O protocolo apresentado, descrevendo métodos que facilitam a detecção de alterações agudas em proteínas eritrocitárias, foi testado em uma conhecida alteração proteica mecanicamente sensível: a fosforilação de hemácias-NOS no resíduo de serina 1177. O sangue total foi obtido de voluntários saudáveis e posteriormente dividido em duas alíquotas separadas. Uma determinada amostra de sangue foi exposta a tensão de cisalhamento mecânica de magnitude fisiológica (5 Pa) por 300 s, que foi previamente demonst...

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Immunostaining-Based Detection of Dynamic Alterations in Red Blood Cell Proteins

A captação de mudanças dinâmicas na ativação proteica de hemácias enucleadas apresenta desafios metodológicos, como a preservação de alterações dinâmicas em estímulos agudos para posterior avaliação. O protocolo apresentado descreve técnicas de preparo e coloração de amostras que permitem a preservação e análise de alterações proteicas relevantes e posterior detecção.

Detecção de Alterações Dinâmicas em Proteínas Eritrocitárias Baseadas em Imunomarcação

Antibody labeling of red blood cell (RBC) proteins is a commonly used, semi-quantitative method to detect changes in overall protein content or acute ...

Nosso método possibilita investigações subcelulares mecanísticas no campo da mecanobiologia em rápida evolução, fixando modificações proteicas temporárias no local e detectando-as com anticorpos específicos. Este método é tecnicamente fácil de aplicar. Os resultados são altamente válidos e reprodutíveis.Além disso, em comparação com outras técnicas, nosso método poderia realmente ser usado efetivamente no campo emergente da sinalização pós-traducional de hemácias, que é dependente de modificações proteicas temporárias, especialmente mecanosinalização de hemácias. Para realizar a fixação da proteína eritrocitária, diluir o sangue total na proporção de um para dois em solução de paraformaldeído a 4% por 20 minutos à temperatura ambiente. Centrifugar a solução de sangue a 132 g durante três minutos à temperatura ambiente e remover cuidadosamente o sobrenadante.Ressuspender o pellet de hemácias em dois volumes de PBS 0,1 molar e incubar por cinco minutos à temperatura ambiente. Novamente, centrifugar a amostra e remover o sobrenadante antes de ressuspender o pellet de hemácias em um volume de PBS 0,1 molar. Rotular uma lâmina de microscópio com o ID da amostra e o anticorpo aplicado usando uma caneta resistente ao álcool.Adicione 10 microlitros da solução preparada de RBC. Coloque uma segunda lâmina sobre a amostra em um ângulo de 45 graus e disperse a amostra uniformemente ao longo da lâmina. Fixe a lâmina passando a amostra sobre o queimador de Bunsen com um movimento constante por cinco a sete segundos.Para a coloração imunoistoquímica, marcar a área 2/3 da lâmina como teste e 1/3 como controle com lápis graxa. Em seguida, lave as áreas de amostra duas vezes aplicando TBS por 30 segundos. Após a segunda lavagem, adicione 0,1% de tripsina e cubra a lâmina usando uma câmara de incubação construída especificamente com uma tampa.Incubar a amostra durante 30 minutos a 37 graus Celsius. Encha um copo com água da torneira e pare a reação enzimática adicionando a água da torneira do copo na lâmina. Despeje a solução e lave ambas as áreas três vezes com TBS.Após a lavagem final, adicionar solução bloqueadora de peroxidase e incubar por 30 minutos à temperatura ambiente. Após a incubação, despeje a solução e lave ambas as áreas três vezes com TBS. Em seguida, adicione 3% de solução de leite desnatado e incube por 30 minutos.Após a incubação, despeje a solução e adicione a solução de anticorpos primários à área de teste. Adicione a solução de controle de anticorpos à área de controle. Incubar as amostras a quatro graus Celsius durante a noite.No dia seguinte, despeje a solução de anticorpos e lave ambas as áreas três vezes com TBS. Em seguida, adicione solução de soro de cabra normal a 3% para evitar ligação inespecífica e incube por 30 minutos. Após a incubação, adicione uma solução de anticorpos secundários e incube por 30 minutos.Despeje a solução de anticorpos e lave as áreas três vezes com TBS antes de prosseguir para o desenvolvimento da coloração. Em seguida, para realizar uma reação de peroxidase de rábano acoplada à avidina, adicione solução diluída de peroxidase de avidina e incube por 30 minutos. Coloque a lâmina sob um microscópio com aumento de 200 vezes e adicione a solução DAB recém-preparada em ambas as áreas.Monitore a coloração das hemácias continuamente e pare a coloração removendo a solução DAB com uma pipeta descartável antes que o fundo comece a colorir. Para realizar a desidratação da amostra, coloque a lâmina em uma grade de vidro e mergulhe por cinco segundos cada em concentrações crescentes de etanol e, finalmente, em xilol. Após a desidratação, coloque a lâmina sobre papel higiênico com as hemácias na parte superior para absorver o excesso de líquido.Adicione duas ou três gotas de meio de montagem em uma folha de tampa e cubra a corrediça usando a folha de tampa. Para visualização e obtenção de imagens, coloque a lâmina em um microscópio de luz transmitida acoplado a uma câmera. Ligue a fonte de luz e a câmera e inicie o software.No Modo Campo Brilhante, concentre as hemácias girando os botões de ajuste de foco grosso e fino. Da mesma forma, concentre as hemácias no Modo Fluorescente. Para analisar o valor de cinza RBC, marque a borda de cada RBC usando a Oval Selection Tool dentro do software ImageJ.Usando o comando Measure, meça os valores de cinza de 50 RBCs do teste e 10 RBCs do controle. Para a coloração por imunofluorescência das proteínas eritrocitárias, incubar a amostra com um anticorpo secundário fluorescentemente conjugado por 30 minutos à temperatura ambiente, protegendo-a da luz. Após a incubação, despeje a solução de anticorpos e lave a lâmina três vezes com TBS.Deixe o TBS na amostra após a lavagem final. Desidratar a amostra e preparar a lâmina com uma lamínula para avaliação microscópica conforme demonstrado. Ligue o microscópio e a fonte de luz fluorescente e concentre as hemácias em um modo de campo brilhante.Capture imagens fluorescentes e de campo claro em pelo menos três áreas distintas da área de teste da lâmina selecionada aleatoriamente. Defina o tempo de exposição para um segundo para imagens fluorescentes e capture uma imagem. Em seguida, alterne para o Modo de Campo Brilhante, defina o tempo de exposição como Automático e capture a imagem de campo brilhante correspondente.Salve as imagens no formato TIFF. Capture imagens fluorescentes e de campo brilhante em pelo menos duas áreas distintas selecionadas aleatoriamente da área de controle da lâmina. Salve as imagens no formato TIFF para preservar os valores de cinza originais dos pixels, impedir a compactação e transportar metadados da aquisição.Para medir os valores de cinza das hemácias capturadas, abra o ImageJ. Marque cada célula com a Ferramenta de Seleção Oval e analise usando o comando Medir. Realce entre três e cinco áreas livres de hemácias e determine os valores de cinza para medir o sinal de fundo.Para executar a análise de dados alternativos de imagens capturadas, crie um comando de macro por meio da versão Fiji do ImageJ para seleção automatizada, correção de plano de fundo e análise de valor de cinza de uma determinada imagem. Abra a imagem em formato TIFF para análise em Fiji. Em seguida, abra a fluorescência RBC.ijm macro e clique em Executar. O sinal de anticorpos direcionados contra a eritrocitária óxido nítrico sintase, ou NOS, fosforilado no resíduo de serina 1177 em repouso e em resposta à exposição à força mecânica foi avaliado por imunohistoquímica e imunofluorescência. Um aumento de três vezes no sinal de anticorpos direcionados contra eritrócitos-NOS fosforilados no resíduo de serina 1177 foi detectado em resposta à exposição à força mecânica das hemácias em comparação com as respectivas células não cisalhadas, quando avaliadas pelo método imunohistoquímico ou imunofluorescência.O usuário precisa se certificar de que o anticorpo é aplicado apenas na área de teste. Caso contrário, a amostra não poderá ser analisada, devido à falta de um controle. Dada a disponibilidade de uma ampla variedade de anticorpos, o direcionamento de muitas proteínas diferentes e processos de sinalização é possível usando este método.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

Deteção de detergente sensíveis interações entre proteínas de membrana

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

Bioquímica

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolamento de glomérulos e In Vivo de rotulagem das proteínas de superfície celular Glomerular

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

Estudo sobre o metabolismo de seis inseticidas sistêmicas em uma cultura de suspensão celular recém-estabelecida derivada do chá (Camellia sinensis L.) Folhas

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Traduzindo a purificação de afinidade Ribossome (TRAP) para isolamento de RNA de células endoteliais in vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Induction of Eryptosis in Red Blood Cells Using a Calcium Ionophore

Indução de eryptose em glóbulos vermelhos usando um ionóforo de cálcio

Eryptosis, erythrocyte programmed cell death, occurs in a number of hematological diseases and during injury to erythrocytes. A hallmark of eryptotic ...

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

Caracterização de proteínas celulares com oxidação fotoquímica rápida de proteínas

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Secção Transversa de Arroz Maduro (Oryza sativa L.) Kernels para digitalização de imagens de microscopia eletrônica usando dicas de pipeta como suporte à imobilização

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry

Incorporação otimizada de Análogos de Ácido Graxo Alkynyl para a detecção de proteínas aciclantes gordurosas usando a Química do Clique

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in ...

Myosin-Specific Adaptations of In vitro Fluorescence Microscopy-Based Motility Assays

Adaptações específicas de miose de ensaios de motilidade baseados em microscopia de fluorescência in vitro

Myosin proteins bind and interact with filamentous actin (F-actin) and are found in organisms across the phylogenetic tree. Their structure and enzymatic ...

F&#246;rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

Medidas de transferência de energia de ressonância förster em células vegetais vivas

Sensitized emission-based F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) experiments are easily done but depend on the microscopic setup. Confocal laser ...