Y así, aprovechando Z-REX, los investigadores pueden interrogar cómo se alteran las respuestas de señalización individuales en respuesta a un ligando reactivo específico que se involucra con una proteína específica de interés en condiciones casi fisiológicas en larvas de pez cebra. Los métodos convencionales como la dosis masiva de moléculas pequeñas reactivas causan objetivos y toxicidad y no dan control sobre la especificidad del ligando objetivo. Z-REX puede vincular un compromiso objetivo de ligando específico con un fenotipo específico con alta precisión espaciotemporal.
Recientemente hemos demostrado cómo un metabolito reactivo HNE, un objetivo asociado y una vía descubierta por Z-REX, permite el desarrollo de inhibidores de quinasa específicos de isoformas de precisión contra cánceres de mama triple negativos. Comience alineando los embriones en las ranuras de una placa de inyección llena con solución salina balanceada de Hank al 10% o HBSS. Sumerja la punta de la aguja en el medio y, si es necesario, aplique pulsos de inyección para eliminar las burbujas de aire en la punta Para inyectar el embrión, penetre el corion y el saco vitelino en un solo movimiento y aplique un pulso de inyección.
Después de inyectar los otros embriones, enjuáguelos en una nueva placa de Petri que contenga medios HBSS frescos con una botella de chorro. Agrupe los embriones no inyectados en otra placa. Para realizar el análisis del tratamiento Z-REX, comience distribuyendo los embriones inyectados en platos de 10 centímetros.
En una habitación oscura con luz roja, reemplace el mediano con 30 mililitros de HBSS al 10% con o sin un micromolar de la sonda REX. Incubar los embriones a 28,5 grados centígrados en la oscuridad. A las 30 horas después de la fertilización, reemplace el medio en la oscuridad.
Después de repetir la incubación y el reemplazo de medios dos veces, exponga los embriones a la luz de una lámpara UV precalentada que gira cada 30 segundos. Para realizar un ensayo fenotípico, retire los embriones no fertilizados o muertos de la placa que contiene los embriones anestesiados. Usando fórceps afilados, retire el corion de los embriones.
Monte los embriones en una placa de agarosa al 2% preparada con medio HBSS al 10% y observe bajo un microscopio estereoscópico. Utilice ImageJ para contar el número de neutrófilos y macrófagos de cada pez. Seleccione la selección a mano alzada y encierre en un círculo el pez entero, luego elija la opción Buscar máximos para contar las células fluorescentes En el presente estudio, los embriones tratados con Z-REX demostraron una pérdida de neutrófilos y macrófagos.
Este efecto estuvo ausente en los grupos no tratados. La vía de señalización de la apoptosis no se activó en el grupo Halo-P2A-Keap1, lo que resultó en niveles inalterados de macrófagos y neutrófilos. También se observaron resultados similares en el mutante Halo-TEV-Keap1 que no respondió al HNE.
Los análisis de PCR transcripcionales y cuantitativos en tiempo real mostraron una regulación negativa de los genes relacionados con el sistema inmunitario y una regulación positiva de los genes antioxidantes después de Z-REX. La tinción por inmunofluorescencia mostró que la construcción dividida P2A tenía dos veces más etiquetas HA que la construcción de fusión TeV, lo que indica niveles de expresión similares. Los niveles de expresión del tipo salvaje y el tipo mutante Halo-TeV-Keap1 también fueron similares.
En la línea reportera de neutrófilos transgénicos tratados con Z-REX, también se observó colocalización de neutrófilos y caspasa 3 activa. Lo más importante es tener sus documentos configurados correctamente. Limitar realmente mejorará sus resultados.
Hemos adoptado Z-REX, una idea para una plataforma de detección de drogas conocida como Localis-REX. Ninguna otra técnica hasta ahora ha sido capaz de lograr un mapeo de ligando u objetivo tan específico y reactivo local. Nos ha ayudado a desarrollar candidatos a fármacos electrofílicos para el tratamiento del cáncer de mama.
Dada la creciente importancia de la señalización localizada en muchos campos, cáncer, inmunología, envejecimiento, etc., Z-Rex, la única herramienta capaz de mapear los eventos dirigidos al ligando reactivo localizado, promete ayudar a numerosos campos.
