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December 16th, 2022
DOI :
December 16th, 2022
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Introduction
0:50
Seeding of Cryopreserved Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes (hiPSC-CMs)
1:25
Dissociation and Counting of the Pre-Plated hiPSC-CMs
2:49
Flexible Hydrogel Substrates Preparation
4:35
Contraction Recording and Analysis
6:52
Results: Evaluation of CCM in 2D Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes
7:59
Conclusion
Transcript
एफडीए में विज्ञान और इंजीनियरिंग प्रयोगशालाओं का कार्यालय चिकित्सा उपकरण डेवलपर्स और एफडीए समीक्षकों की सहायता के लिए नियामक विज्ञान उपकरण विकसित कर रहा है। हमारा अंतिम लक्ष्य सर्वोत्तम उपलब्ध विज्ञान के माध्यम से अभिनव, सुरक्षित और प्रभावी चिकित्सा उपकरणों तक रोगी की पहुंच में तेजी लाना है। इस प्रोटोकॉल में, हम चिकित्सा उपकरणों के मूल्यांकन के लिए अत्याधुनिक प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल तकनीक लागू करते हैं जिनका उपयोग जीवन-धमकी देने वाली हृदय स्थितियों के इलाज के लिए किया जाता है।
यह सरल उपकरण मानक प्रयोगशाला उपकरणों का उपयोग करके डिश में कार्डियक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी उपकरणों के प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मूल्यांकन को सक्षम बनाता है। इसका उपयोग विभिन्न हृदय रोगों वाले दाताओं से प्राप्त रोगी-विशिष्ट कोशिकाओं के साथ भी किया जा सकता है। शुरू करने के लिए, लचीले हाइड्रोगेल सब्सट्रेट पर कार्डियोमायोसाइट्स को सीड करने से कम से कम दो दिन पहले 0.1% जिलेटिन लेपित बाँझ छह-वेल प्लेटों पर पिघले हुए मानव आईपीएससी व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स को प्लेट करें।
मानव आईपीएससी ने 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर दो से चार दिनों के लिए मानक कार्डियोमायोसाइट्स माध्यम में कार्डियोमायोसाइट्स प्राप्त किए ताकि उन्हें क्रायो-संरक्षण से उबरने की अनुमति मिल सके। हर 48 घंटे में 100% कार्डियोमायोसाइट माध्यम के साथ खर्च किए गए माध्यम को ताज़ा करें। कोशिकाओं के स्वास्थ्य का मूल्यांकन करके, व्यवहार्यता और स्थिर धड़कन सुनिश्चित करके पृथक्करण से पहले मानव आईपीएससी व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स की स्थिति की जांच करें।
कैल्शियम क्लोराइड या मैग्नीशियम क्लोराइड के बिना डीपीबीएस के चार मिलीलीटर प्रति कुएं के साथ कार्डियोमायोसाइट्स को धोएं। प्रत्येक कुएं में एक मिलीलीटर कमरे का तापमान पृथक्करण अभिकर्मक जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। इसके बाद, एक बाँझ 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 10 मिलीलीटर कार्डियोमायोसाइट्स माध्यम जोड़ें।
कार्डियोमायोसाइट्स को 1,000 माइक्रोलीटर पिपेट के साथ छह-वेल प्लेटों से अलग करें और शंक्वाकार ट्यूब में सेल निलंबन जोड़ें। किसी भी अवशिष्ट कार्डियोमायोसाइट्स को इकट्ठा करने और उन्हें शंक्वाकार ट्यूब में जोड़ने के लिए ताजा कार्डियोमायोसाइट्स माध्यम के एक मिलीलीटर के साथ कुओं को कुल्ला करें। फिर शंक्वाकार ट्यूब के अंतिम आयतन को माध्यम के साथ 15 मिलीलीटर तक लाएं।
ट्यूब को पांच मिनट के लिए 200 जी पर सेंट्रीफ्यूज करें और एक मिलीलीटर के निशान तक सतह पर तैरने वाले को हटा दें। कार्डियोमायोसाइट्स माध्यम में कोशिकाओं को पांच मिलीलीटर की अंतिम मात्रा में पुन: निलंबित करें और कार्डियोमायोसाइट्स को मैन्युअल या स्वचालित सेल काउंटर के साथ गिनते हैं। इसके बाद, कार्डियोमायोसाइट सेल निलंबन को कमरे के तापमान पर लगभग 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, जबकि लचीले हाइड्रोगेल सब्सट्रेट तैयार किए जाते हैं।
एक माइक्रोलीटर पर 20 माइक्रोलीटर पिपेट सेट, पिपेट टिप्स, एक बाँझ 48-वेल ग्लास बॉटम प्लेट और टिशू कल्चर हुड में एक स्टॉपवॉच टाइमर तैयार करें। ट्यूब को धीरे से टैप करके और तुरंत बर्फ पर वापस रखकर बाह्य मैट्रिक्स या ईसीएम-आधारित हाइड्रोगेल सब्सट्रेट मिलाएं। पहले हाइड्रोगेल सब्सट्रेट को चढ़ाने से तुरंत पहले स्टॉपवॉच टाइमर शुरू करें और इसे समय शून्य के रूप में चिह्नित करें।
पिपेट टिप को ठंडा करने के लिए हाइड्रोगेल सब्सट्रेट के एक माइक्रोलीटर को लगभग तीन बार ऊपर और नीचे करें। फिर 48-वेल प्लेट में प्रत्येक कुएं के तल पर क्षैतिज रूप से अप्रकाशित हाइड्रोगेल सब्सट्रेट के लगभग एक माइक्रोलीटर को लागू करें, पिपेट को 45 डिग्री कोण पर पकड़ें। 40 एक्स आवर्धन पर प्रयोगों को करते समय सब्सट्रेट की पहचान करने में मदद करने के लिए प्रत्येक कुएं में एक ही अभिविन्यास में सभी हाइड्रोगेल सब्सट्रेट्स को प्लेट करें।
ढक्कन को 48-वेल प्लेट पर रखें और हाइड्रोगेल सब्सट्रेट्स को कोशिकाओं को जोड़ने से पहले टिशू कल्चर हुड में कमरे के तापमान पर आठ से 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करने की अनुमति दें। इनक्यूबेशन के बाद, कार्डियोमायोसाइट्स को तुरंत कार्डियोमायोसाइट्स माध्यम के लगभग 200 माइक्रोलीटर की कम मध्यम मात्रा में लगभग 30,000 व्यवहार्य कार्डियोमायोसाइट्स प्रति कुएं के साथ हाइड्रोगेल सब्सट्रेट्स पर सीधे बीज दें। ढक्कन बंद करने के बाद, कार्डियोमायोसाइट्स को हुड में कमरे के तापमान पर 10 से 15 मिनट के लिए निर्विवाद रूप से इनक्यूबेट करने की अनुमति दें ताकि कोशिकाएं हाइड्रोगेल सब्सट्रेट का पालन कर सकें।
धीरे से प्रत्येक कुएं में ताजा कार्डियोमायोसाइट्स माध्यम के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें। ढक्कन बंद प्लेट को इनक्यूबेटर पर 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर दो से चार दिनों के लिए रखें। 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड के बराबर होने के लिए माइक्रोस्कोप और पर्यावरण नियंत्रण कक्ष चालू करें।
कार्डियोमायोसाइट माध्यम को 48-वेल प्लेट से निकालें और धीरे-धीरे कार्डियक कॉन्ट्रैक्टिलिटी मॉड्यूलेशन या सीसीएम परख माध्यम के 600 माइक्रोलीटर के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से दो बार कुल्ला करें। फिर प्रति अच्छी तरह से सीसीएम परख माध्यम के 300 माइक्रोलीटर जोड़ें और पर्यावरण नियंत्रण कक्ष में माइक्रोस्कोप पर 48-वेल प्लेट रखें। इलेक्ट्रोड डालें और कोशिकाओं को पांच मिनट के लिए बराबर करें।
वीडियो-आधारित माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके संकुचन वीडियो रिकॉर्ड करने के लिए, वीडियो रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर खोलें और प्रति सेकंड 100 फ्रेम की फ्रेम दर सेट करें। फिर HIPSC-CM मोनोलेयर के केंद्र के पास रुचि या ROI के क्षेत्र का चयन करें। फिर क्षेत्र 2 डी कार्डियोमायोसाइट्स मोनोलेयर को विद्युत रूप से गति देने के लिए एक वाणिज्यिक पल्स जनरेटर के साथ कोशिकाओं को उत्तेजित करता है।
कार्डियोमायोसाइट्स को बेसलाइन पल्स पैरामीटर के साथ एक हर्ट्ज पर 1.5 गुना दहलीज पर रखें। उदाहरण के लिए, मोनोफैसिक स्क्वायर वेव पेसिंग पल्स पांच वोल्ट की दो मिलीसेकंड उत्तेजना पल्स अवधि के साथ। सीसीएम से पहले बेसलाइन पेसिंग केवल संकुचन वीडियो को कम से कम पांच बीट्स के लिए रिकॉर्ड करें।
फिर कार्डियोमायोसाइट्स मोनोलेयर को 30 मिलीसेकंड की देरी के प्रयोगात्मक विद्युत संकेत के साथ उत्तेजित करें, 5.14 मिलीसेकंड चरण अवधि के दो सममित बाइफैसिक पल्स, 20.56 मिलीसेकंड कुल अवधि, 10 वोल्ट चरण आयाम और शून्य इंटरफेज अंतराल के साथ। सीसीएम-प्रेरित संकुचन वीडियो को कम से कम पांच बीट्स के लिए रिकॉर्ड करें। सीसीएम सिग्नल को बंद करें, बेसलाइन पेसिंग पल्स के साथ उत्तेजित करें और सीसीएम के बाद रिकवरी अवधि का संकुचन वीडियो कम से कम पांच बीट के लिए रिकॉर्ड करें।
संकुचन वीडियो का स्वचालित रूप से विश्लेषण करने के लिए एक मानक संकुचन सॉफ्टवेयर का उपयोग करें और संकुचन आयाम, संकुचन ढलान, विश्राम ढलान, समय से शिखर, बेसलाइन 90% और संकुचन अवधि 50% जैसे प्रमुख सिकुड़ा हुआ गुणों को निर्धारित करें। मानक सीसीएम उत्तेजना मापदंडों के आवेदन के परिणामस्वरूप विट्रो में सिकुड़ा हुआ गुण बढ़ गया। सीसीएम उत्तेजना के साथ और बिना मानव सिकुड़ा हुआ गुणों पर बाह्य कैल्शियम सांद्रता मॉड्यूलेशन के प्रभावों का मूल्यांकन किया गया था।
संकुचन की अपेक्षित आधारभूत कैल्शियम निर्भरता देखी गई, साथ ही कार्डियोमायोसाइट्स मोनोलेयर के स्तर पर कैल्शियम संवेदनशीलता में सीसीएम-प्रेरित वृद्धि हुई। इसके अलावा, बीटा एंड्रोजेनिक सिग्नलिंग मार्ग की औषधीय पूछताछ से पता चला कि सीसीएम-प्रेरित इनोट्रोपिक प्रभाव बीटा एड्रीनर्जिक सिग्नलिंग द्वारा मध्यस्थ थे। इसके अलावा, इस उपकरण को रोगी-विशिष्ट रोग कार्डियोमायोसाइट्स तक विस्तारित किया जा सकता है, जिसमें रोग राज्यों के संदर्भ में सीसीएम के प्रभाव को समझने के लिए पतला कार्डियोमायोपैथी शामिल है।
यहां, हम मुख्य रूप से मानव सिकुड़ा हुआ गुणों का मूल्यांकन करने पर ध्यान केंद्रित करते हैं। हालांकि, इस उपकरण का उपयोग करके, कोई अन्य कार्डियक उत्तेजना संकुचन युग्मन रीडआउट का भी मूल्यांकन कर सकता है जिसमें एक्शन पोटेंशिअल और कैल्शियम हैंडलिंग शामिल हैं। यह हृदय उपकरणों के मूल्यांकन के साथ प्रौद्योगिकी द्वारा प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल को संयोजित करने वाला पहला नियामक विज्ञान उपकरण है।
यह वैकल्पिक विधि एक डिश में चिकित्सा उपकरणों का मूल्यांकन करने का मार्ग प्रशस्त करती है और इसमें पशु और मानव विषय परीक्षण की आवश्यकता को कम करने की क्षमता है।
यहां, हम 2 डी मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट (एचआईपीएससी-सीएम) मोनोलेयर का उपयोग करके एक गैर-इनवेसिव कार्डियक मेडिकल डिवाइस कॉन्ट्रैक्टिलिटी मूल्यांकन विधि का प्रदर्शन करते हैं, जिसे एक लचीले सब्सट्रेट पर चढ़ाया जाता है, वीडियो-आधारित माइक्रोस्कोपी के साथ युग्मित किया जाता है। यह उपकरण कार्डियक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी उपकरणों के सिकुड़ा हुआ गुणों के इन विट्रो मूल्यांकन के लिए उपयोगी होगा।
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