Denne protokollen presenterer SPH CRISPR Activation System som en alternativ strategi til konvensjonelle virale vektorer for å utføre forsterkningsfunksjonsanalyser i adipocytter. Det tillater overekspresjon av enkle eller flere adipocytter endogene gener i det komplekse cellulære miljøet av fettvev ved å levere et tilpasset enkelt guide-RNA ved hjelp av et adenoassosiert virus. De utfordrende trinnene i denne protokollen er relatert til kloning av RNA med én guide og produksjon og injeksjon av adenoassosiert virus i fettvevet.
For å begynne, design enkeltguide RNA eller sgRNA for CRISPR-aktivering ved hjelp av chopchop eller et annet egnet verktøy. Design sgRNA rettet mot PRDM16-genet ved å bruke følgende parametere: Mål som PRDM16 i en Mus-muskulus ved hjelp av en CRISPR / Cas9 og for som aktivering. Legg overheng til sgRNA for å matche Sac1-begrensningsstedet i vektorryggraden PAAVU6GRNACBHM-kirsebær.
Inkluder 5'AGCT 3'hvor n tilsvarer nukleotider. Oppnå 3'sgRNA omvendt komplementsekvens ved hjelp av det angitte verktøyet. Deretter, for glødning av enkeltstrengede komplementære oligonukleotider, tilsett en mikroliter av hvert 5'og 3'enkeltstrenget oligonukleotid, en mikroliter T4-ligasebuffer, 0,5 mikroliter T4 polynukleotidkinase og 6,5 mikroliter vann for et endelig reaksjonsvolum på 10 mikroliter.
Anneal de komplementære enkeltstrengede oligonukleotidene ved hjelp av en termosyklist ved 37 grader Celsius i 30 minutter og 95 grader Celsius i fem minutter, etterfulgt av en nedtrappingshastighet på fem grader Celsius per minutt. Deretter tilsettes for ligering av glødet sgRNA-oligonukleotider 25 nanogram plasmid PAAVU6GRNACBHM-kirsebær til to mikroliter glødet sgRNA-oligonukleotider, en mikroliter Sac1-enzym, to mikroliter 10X T4 DNA-ligasebuffer, en mikroliter T4 DNA-ligase og vann til et endelig reaksjonsvolum på 10 mikroliter. Bruk en termosyklist, utfør ligering ved å inkubere reaksjonsblandingen i 15 sykluser ved 37 grader Celsius i fem minutter og 25 grader Celsius i fem minutter etterfulgt av å holde ved fire grader Celsius.
Deretter transformerer du de kompetente Escherichia coli DH10B-cellene med fire mikroliter av ligeringsproduktet ved varmesjokk ved 42 grader Celsius i 45 sekunder og spres på en agarplate inneholdende 10 mikrogram per milliliter Ampicillin. Bekreft transformerte kolonier ved Colony Polymerase Chain Reaction eller PCR ved hjelp av PCR Master Mix, velg kolonien og bland den med fem mikroliter Master Mix, 0,1 mikroliter universell primer, 0,1 mikroliter sgRNA omvendt primer og fem mikroliter vann. Kjør PCR ved hjelp av innledende denaturering ved 94 grader Celsius i to minutter, etterfulgt av 35 sykluser med denaturering ved 94 grader Celsius i 20 sekunder, glødning i 30 sekunder ved 60 grader Celsius, forlengelse ved 72 grader Celsius i 30 sekunder, og et siste forlengelsestrinn ved 72 grader Celsius i fem minutter.
Etter PCR, oppløs DNA ved hjelp av agarosegelelektroforese i 0,5X TAE-buffer ved 90 volt i 30 minutter. Send inn positive prøver for Sanger-sekvensering ved hjelp av universell primer. Deretter renser du plasmidet fra en positiv klon ved hjelp av et plasmidrensesett i henhold til produsentens instruksjoner.
Plasser den bedøvede musen i liggende stilling og barber et lite område på flankene proksimalt til hofteleddene for inguinal hvitt fettvev eller IWAT-injeksjoner med barbermaskin. Tilsett hårfjerningskrem i fem minutter. Fjern gjenværende krem med vann for å unngå hudforbrenninger.
Desinfiser huden ved hjelp av tre alternerende runder med påføring av povidonjodoppløsningen på huden med rent gasbind og 70% alkohol. Deretter gjør du et snitt på en til to centimeter med sterilisert saks i det proksimale området av leddene og holder huden åpen ved hjelp av tang for å avsløre fettdepotet. WAT kan festes til huden på begge sider og strekker den fra begynnelsen fra baksiden og mot testiklene.
Bruk tang, trekk fettdepotet forsiktig oppover gjennom snittet for å sikre at injeksjonen er på riktig sted og dybde. Fyll mikrolitersprøyten med 2,5 mikroliter av adenoassosiert virus eller en AAV som inneholder sgRNA rettet mot det endogene PRDM16-genet. Sett kanylen forsiktig i en 30-45 graders vinkel inn i IWAT.
Gjenta injeksjonen fem ganger på forskjellige steder i vevet for å homogent infisere hele IWAT fettputen. Plasser musen på varmeputen til bevisstheten er gjenvunnet. Overvåk dyret hvert 10. til 15. minutt til det gjenoppretter helt.
Etter at dyret gjenvinner bevisstheten, observer lokomotivprofileringen, som skal være lineær og ikke ha tegn på nød eller smerte. Se de stromale vaskulære cellene eller SVF-ene avledet fra adipo PH-mus IWAT til en 6-brønnplate som inneholder komplett DMEM-medium i en til to timer, aspirer mediet, vask brønnen to ganger ved hjelp av PBS, og erstatt den med friskt, komplett medium. Inkuber cellene ved 37 grader Celsius, 5% karbondioksid og 95% fuktighet til cellene når 70-80% konfluens.
På dag 0 induserer du differensiering ved å behandle cellene med induksjonsmediet og etter to dager erstattes induksjonsmidlet med vedlikeholdsmediet. Igjen etter to dager, på dag fire, erstatt vedlikeholdsmediet med et nytt vedlikeholdsmedium i 2-3 dager. Bytt vedlikeholdsmedium hver 48. time til preadipocytter er fullstendig differensiert til adipocytter.
Observer de modne adipocytter ved hjelp av lysmikroskopi, da de differensierte cellene ser ut til å være lastet med lipiddråper. Etter å ha dyrket cellene på en 6-brønns kulturplate med hele mediet til cellene når 70-80% konfluens, bland 5,6 * 10 ^ 10 viralt genom per mikroliter AAV-bærende sgRNA PRDM16 med to milliliter komplett medium og heksadimetrinbromid. Transdusere cellene ved å erstatte hele mediet og tilsette hele mediet som inneholder AAV.
Inkuber de transduserte cellene i 12 timer ved 37 grader Celsius, 95% fuktighet og 5% karbondioksid. Splitt og se cellene som beskrevet for celleproliferasjon og differensiering til beige adipocytter. Immunfluorescensbildene fra IWAT av adipo PH-mus viste uttrykket av dCas9 i både kontroll- og PRDM16-gruppene.
SPH-indusert PRDM16-uttrykk induserte tydelig en utbredt akkumulering av multiokulære beige adipocytter i IWAT. Videre viste kvantitativ PCR økt ekspresjon av PRDM16 og det termogene genprogrammet i PRDM16-gruppen sammenlignet med kontrollgruppen. Tilsvarende bekreftet in vitro genekspresjonsanalyse det økte uttrykket av det endogene PRDM16-genet og termogene gener i PRDM16-overekspresjonsgruppen sammenlignet med kontrollen.
Det SPH-induserte PRDM16-uttrykket resulterte i høyere basalt og maksimalt oksygenforbruk enn i kontrollceller. Det er viktig at dataene indikerte forbedret ukoblet respirasjon i PRDM16-gruppen sammenlignet med kontrollgruppen. Adipo PH-modellen er egnet for å undersøke flere gener og regulatoriske elementer i adipocytter.
Denne metoden åpner muligheten for en dypere forståelse av beige fettbiologi.
