Name: amebas: automatic midline extraction and background subtraction of ratiometric fluorescence time-lapses of polarized single cells
Uploaded: 2023-06-23T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about AMEBaS: Automatic Midline Extraction and Background Subtraction of Ratiometric Fluorescence Time-Lapses of Polarized Single Cells at JoVE.com

Yazarlar, FAPESP hibeleri 2015/22308-2, 2019/23343-7, 2019/26129-6, 2020/06744-5, 2021/05363-0, CNPq, NIH R01 hibe GM131043 ve NSF hibeleri MCB1714993, MCB1930165 mali destek için minnettardır. Kök saç verileri Prof. Andrea Bassi ve Prof. Alex Costa'nın süpervizörlüğünde ve altyapısında üretildi.

1. Etkileşimli not defteri protokolü
Jupyter not defteri, aşağıdaki talimatların temel alındığı https://colab.research.google.com/github/badain/amebas/blob/main/AMEBAS_Colab.ipynb'de Google Colab kullanılarak doğrudan web'de kullanılabilir. Alternatif olarak, Jupyter not defteri https://github.com/badain/amebas'da kullanılabilir ve burada Jupyter'da yerel olarak çalışacak şekilde indirilebilir ve yapılandırılabilir (Anaconda kolay ve platformlar arası yükl...

<ol>
	<li>Drubin, D. G., Nelson, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+of+cell+polarity.">Origins of cell polarity.</a> Cell. 84 (3), 335-344 (1996).</li><li>Wodarz, A., N&#228;thke, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+polarity+in+development+and+cancer.">Cell polarity in development and cancer.</a> Nature Cell Biology. 9 (9), 1016-1024 (2007).</li><li>Palanivelu, R., Preuss, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pollen+tube+targeting+and+axon+guidance:+parallels+in+tip+growth+mechanisms.">Pollen tube targeting and axon guidance: parallels in tip growth mechanisms.</a> Trends in Cell Biology. 10 (12), 517-524 (2000).</li><li>Portes, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Pollen Tube Oscillator: Integrating Biophysics and Biochemistry into Cellular Growth and Morphogenesis. Rhythms in Plants: Dynamic Responses in a Dynamic Environment. , (2015).</li><li>Wudick, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CORNICHON+sorting+and+regulation+of+GLR+channels+underlie+pollen+tube+Ca2++homeostasis.">CORNICHON sorting and regulation of GLR channels underlie pollen tube Ca2+ homeostasis.</a> Science. 360 (6388), 533-536 (2018).</li><li>Hoffmann, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+H+-ATPases+sustain+pollen+tube+growth+and+fertilization.">Plasma membrane H+-ATPases sustain pollen tube growth and fertilization.</a> Nature Communications. 11 (1), 1-15 (2020).</li><li>Michard, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+receptor-like+genes+form+Ca2++channels+in+pollen+tubes+and+are+regulated+by+pistil+D-serine.">Glutamate receptor-like genes form Ca2+ channels in pollen tubes and are regulated by pistil D-serine.</a> Science. 332 (6028), 434-437 (2011).</li><li>Damineli, D. S., Portes, M. T., Feij&#243;, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oscillatory+signatures+underlie+growth+regimes+in+Arabidopsis+pollen+tubes:+computational+methods+to+estimate+tip+location,+periodicity,+and+synchronization+in+growing+cells.">Oscillatory signatures underlie growth regimes in Arabidopsis pollen tubes: computational methods to estimate tip location, periodicity, and synchronization in growing cells.</a> Journal of Experimental Botany. 68 (12), 3267-3281 (2017).</li><li>Li, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+genetically+encoded+dual+reporter+for+simultaneous+ratio+imaging+of+Ca2++and+H++reveals+new+insights+into+ion+signaling+in+plants.">An optimized genetically encoded dual reporter for simultaneous ratio imaging of Ca2+ and H+ reveals new insights into ion signaling in plants.</a> New Phytologist. 230 (6), 2292-2310 (2021).</li><li>Sadoine, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designs,+applications,+and+limitations+of+genetically+encoded+fluorescent+sensors+to+explore+plant+biology.">Designs, applications, and limitations of genetically encoded fluorescent sensors to explore plant biology.</a> Plant Physiology. 187 (2), 485-503 (2021).</li><li>Grenzi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+the+hidden+world+of+calcium+ions+in+plants+with+a+universe+of+indicators.">Illuminating the hidden world of calcium ions in plants with a universe of indicators.</a> Plant Physiology. 187 (2), 550-571 (2021).</li><li>Munglani, G., Vogler, H., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+flexible+processing+of+large+FRET+image+stacks+using+the+FRET-IBRA+toolkit.">Fast and flexible processing of large FRET image stacks using the FRET-IBRA toolkit.</a> PLoS Computational Biology. 18 (4), 1009242 (2022).</li><li>Ridler, T., Calvard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Picture+thresholding+using+an+iterative+selection+method.">Picture thresholding using an iterative selection method.</a> IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 8 (8), 630-632 (1978).</li><li>Portes, M. T., Feij&#243;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Growing Arabidopsis pollen tubes expressing genetically encoded reporters for calcium and pH. , (2023).</li><li>Candeo, A., Doccula, F. G., Valentini, G., Bassi, A., Costa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet+fluorescence+microscopy+quantifies+calcium+oscillations+in+root+hairs+of+Arabidopsis+thaliana.">Light sheet fluorescence microscopy quantifies calcium oscillations in root hairs of Arabidopsis thaliana.</a> Plant &amp; Cell Physiology. 58 (7), 1161-1172 (2017).</li><li>Romano Armada, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+light+sheet+fluorescence+microscopy+of+calcium+oscillations+in+Arabidopsis+thaliana.">In vivo light sheet fluorescence microscopy of calcium oscillations in Arabidopsis thaliana.</a> Methods in Molecular Biology. 1925, 87-101 (2019).</li><li>Krebs, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRET-based+genetically+encoded+sensors+allow+high-resolution+live+cell+imaging+of+Ca2++dynamics.">FRET-based genetically encoded sensors allow high-resolution live cell imaging of Ca2+ dynamics.</a> The Plant Journal. 69 (1), 181-192 (2012).</li><li>Lee, T. -. C., Kashyap, R. L., Chu, C. -. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+skeleton+models+via+3-D+medial+surface+axis+thinning+algorithms.">Building skeleton models via 3-D medial surface axis thinning algorithms.</a> CVGIP: Graphical Models and Image Processing. 56 (6), 462-478 (1994).</li><li>Nunez-Iglesias, J., Blanch, A. J., Looker, O., Dixon, M. W., Tilley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+Python+library+to+analyse+skeleton+images+confirms+malaria+parasite+remodelling+of+the+red+blood+cell+membrane+skeleton.">A new Python library to analyse skeleton images confirms malaria parasite remodelling of the red blood cell membrane skeleton.</a> PeerJ. 6, 4312 (2018).</li></ol>

Burada sunulan yeni yöntem, polarize hücrelerin floresan mikroskobu görüntü yığınlarının analizini kolaylaştırmak ve otomatikleştirmek için güçlü bir araçtır. ImageJ Kymograph eklentileri gibi literatürde açıklanan mevcut yöntemler, ilgilenilen polarize hücrenin orta hattının manuel olarak izlenmesini gerektirir, bu sadece zaman alıcı değil, aynı zamanda insan hatalarına da eğilimli bir görevdir. Bu boru hattındaki orta hattın tanımı, iskeletleştirmeyi gerçekleştiren sayısal bir y...

Hücre polaritesi, uzamsal olarak konsantre moleküller ve yapılardan oluşan bir koleksiyonun uyumlu eyleminin, özel morfolojik hücre altı alanlarınkurulmasıyla sonuçlandığı temel bir biyolojik süreçtir 1. Hücre bölünmesi, büyümesi ve göçü bu tür polarite bölgelerine dayanırken, kaybı epitel doku ile ilgili bozukluklarda kanserle ilişkilendirilmiştir2.
Apikal olarak büyüyen hücreler, uçtaki polarite bölgesinin tipik olarak hücre dışı ipuçlarına yeniden yöneldiğidramatik bir polarite örneğidir 3. Bunlar, çoklu hücresel süreçlerin hücrenin ucundan sapa doğru belirgin farklılıklar gösterdiği nöritler, mantar hifleri, kök kılları ve polen tüplerinin geliştirilmesini içerir. Polen tüplerinde, özellikle, aktin polimerizasyonu, vezikül kaçakçılığı ve iyonik konsantrasyonlar, uç odaklıgradyanlar 4 göstererek belirgin şekilde polarize olur. Polen tüpleri, çiçekli bitkilerin erkek gametofitleridir ve tek bir hücre için bilinen en hızlı büyüme oranlarından birinde yalnızca hücrenin tepesinde büyüyerek sperm hücrelerini ovüle iletmekten sorumludur. Kalsiyum 5 (Ca2+) ve protonlar 6 (H+) gibi iyonların uç odaklı gradyanları, çift döllenme 5,6 ile sonuçlanan ana biyolojik işlevini yerine getirmek için gerekli olan polen tüpü büyümesinin sürdürülmesinde önemli bir rol oynar. Bu nedenle, apikal olarak büyüyen hücrelerin orta hattı boyunca uzay-zamansal dinamikleri analiz etmek için kantitatif yöntemler, polarize büyümenin altında yatan hücresel ve moleküler mekanizmaları araştırmak için gereklidir 7,8,9. Araştırmacılar genellikle kimografileri, yani hücrenin orta hattının (örneğin sütunlar) zaman içinde (örneğin satırlar) piksel yoğunluklarını temsil eden ve diyagonalde hücre büyümesini ve göçünü görselleştirmeye izin veren bir matris kullanırlar (Şekil 1). Kullanışlılıklarına rağmen, kimografiler sıklıkla orta hattı manuel olarak izleyerek çıkarılır, önyargılara ve insan hatalarına eğilimlidir ve aynı zamanda oldukça zahmetlidir. Bu, burada tanıtılan AMEBaS adlı boru hattının ilk özelliği olan otomatik bir orta hat ekstraksiyon yöntemini gerektirir: Polarizetek hücrelerin oransal floresan zaman atlamalarının utomatik bir Midline Extraction ve Background Sgeri çekilmesi.
Deneysel prosedürler açısından, tek hücrelerde ilgilenilen iyonların/moleküllerin/türlerin kantitatif görüntülenmesi, genetik olarak kodlanmış floresan problar10 ile elde edilebilir. Sürekli genişleyen seçenekler arasında, oransal problar, ilgilenilen moleküllere bağlı/bağlanmamış olduklarında farklı floresan dalga boyları yaydıkları için en doğru olanlardan biridir11. Bu, probun hücre içi konsantrasyonundaki uzamsal heterojenliğin, kanala özgü arka planları çıkarılmış iki kanalın oranını kullanarak düzeltilmesine izin verir. Bununla birlikte, her kanal ve zaman noktası için arka plan eşiğini tahmin etmek karmaşık bir görev olabilir, çünkü görüntünün köşelerinin merkeze göre parlaklık değişimine sahip olduğu gölgeleme gibi efektler nedeniyle ve floroforun solması (foto ağartma) nedeniyle zaman içinde genellikle uzayda değişir12. Birden fazla olası yöntem olmasına rağmen, bu makale, Isodata algoritması13 ile elde edilen segmentasyon eşiğini kullanarak arka plan yoğunluğunun otomatik olarak belirlenmesini önermektedir ve bu daha sonra standart olarak polinom regresyon yoluyla çerçeveler arasında yumuşatılmaktadır. Bununla birlikte,12'de çıkarılan hedef hücre ile ilgisi olmayan floresan heterojenliğinden kaynaklanan uzamsal bileşenler bu yöntemle göz ardı edildi. Otomatik eşikleme birkaç yöntemle gerçekleştirilebilir, ancak Isodata algoritması ampirik olarak en iyi sonuçları verdi. Bu nedenle, otomatik arka plan değeri çıkarma ve oransal hesaplama, birlikte ele alındığında, çift kanallı floresan mikroskobu görüntülerinin bir yığınını girdi olarak alan, hücrenin orta hattını ve kanala özgü arka planı tahmin eden ve arka plan çıkarma, yumuşatma ve aykırı değer kaldırma işleminden sonra her iki kanalın ve oranlarının (ana çıkış #1) kymograflarını çıkaran AMEBaS'ın (Şekil 1) ikinci ana özelliğidir. bir yığın ratiometrik görüntü ile birlikte (ana çıktı #2).
AMEBaS, polene özgü LAT52 promotörü altında eksprese edilen Ca2+ (CaMeleon)8 veya pH (pHluorin)6 oranlı sensörler ile mikroskop altında elde edilen büyüyen Arabidopsis polen tüplerinin floresan zaman atlamaları ile test edildi. Her kanaldan alınan görüntüler, ters çevrilmiş bir mikroskop, önden aydınlatmalı bir kamera (2560 piksel × 2160 piksel, piksel boyutu 6.45 μm), bir floresan aydınlatıcı ve 63x, 1.2NA suya daldırma objektif lensi ile birlikte her 4 saniyede bir çekildi. CaMeleon için kullanılan filtre ayarları şunlardı: uyarma 426-450 nm (CFP) ve 505-515 nm (YFP), emisyon 458-487 nm (CFP) ve 520-550 nm (YFP), pHluorin için uyarma 318-390 nm (DAPI) ve 428-475 nm (FITC), emisyon 435-448 nm (DAPI) ve 523-536 nm (FITC). Zenodo'da test için eksiksiz bir veri seti eklendi (DOI: 10.5281/zenodo.7975350)14.
Ek olarak, boru hattı, daha önce tarif edildiği gibi bir ışık tabakası mikroskobu (SPIM) ile görüntülemenin yapıldığı kök kıl verileriyle test edildi 15,16 UBQ10 promotörü 17'nin kontrolü altında genetik olarak kodlanmış Ca 2+ raportör NES-YC3.6'yı eksprese eden Arabidopsiskök kılları ile. Işık tabakası mikroskobunun kamera alımını, örnek çevirisini ve deklanşörünü kontrol eden ev yapımı LabView yazılımı, iki cpVenus ve CFP kanalının gözlemlenmesine ve aynı zamanda oranlarının gerçek zamanlı olarak görselleştirilmesine izin verdi. Hızlandırılmış çekimin her oran görüntüsü, 3 μm aralıklı numunenin 15 diliminden elde edilen cpVenus ve CFP floresan kanalları görüntüleri arasında bir maksimum yoğunluk projeksiyonunu (MIP) temsil ediyordu. MIP'lerin hızlandırılmış cpVenüs/CFP oranı kaydedildi ve doğrudan AMEBaS analizi için kullanıldı.
Bu boru hattı, birden fazla büyüyen ve göç eden hücre türüyle çalışabilmesine rağmen, çerçeveler arasında büyümeyen sitoplazmik bölgelerin bir yazışmasının olduğu polen tüpleri, kök kılları ve mantar hifleri gibi yalnızca uçta büyüyen büyüyen hücreleri analiz etmek için özel olarak tasarlanmıştır. Böyle bir yazışma olmadığında, kullanıcı adım 1.3.1.1'deki complete_skeletonization seçeneğini seçmelidir (daha fazla ayrıntı için Tartışma bölümüne bakın).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64857/64857fig01.jpg"> Şekil 1: İşlem hattı iş akışına genel bakış. AMEBaS boru hattı, mikroskobik zaman atlamalarını üç ana adımda analiz eder ve işler: Tek Hücreli Segmentasyon, Orta Hat İzleme ve Kymograph Oluşturma. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64857/64857fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Github</td>
			<td>Github</td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/badain/amebas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Google Colab</td>
			<td>Google</td>
			<td></td>
			<td>https://colab.research.google.com/github/badain/amebas/blob/main/AMEBAS_Colab.ipynb</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

amebas: automatic midline extraction and background subtraction of ratiometric fluorescence time-lapses of polarized single cells

Hücre polaritesi, hücre altı düzeyde özel alanların ortaya çıkmasıyla sonuçlanan, uzamsal olarak konsantre moleküller ve yapılar topluluğu tarafından kurulan makroskopik bir fenomendir. Hücre bölünmesi, büyümesi ve göçü gibi temel biyolojik işlevlerin altında yatan asimetrik morfolojik yapıların geliştirilmesiyle ilişkilidir. Ek olarak, hücre polaritesinin bozulması, kanser ve mide displazisi gibi doku ile ilgili bozukluklarla ilişkilendirilmiştir.
Bireysel polarize hücrelerde floresan raportörlerin uzay-zamansal dinamiklerini değerlendirmek için mevcut yöntemler, genellikle hücrelerin ana ekseni boyunca bir orta hattı izlemek için manuel adımlar içerir, bu da zaman alıcıdır ve güçlü önyargılara eğilimlidir. Ayrıca, oransal analiz, iki floresan kanalı kullanarak raportör moleküllerin eşit olmayan dağılımını düzeltebilse de, arka plan çıkarma teknikleri genellikle keyfidir ve istatistiksel destekten yoksundur.
Bu makale, bir hücre polaritesi modeli kullanarak tek hücrelerin uzay-zamansal davranışını otomatikleştirmek ve ölçmek için yeni bir hesaplama hattı sunmaktadır: polen tüpü/kök kılı büyümesi ve sitozolik iyon dinamikleri. Oransal görüntüleri işlemek ve hücre içi dinamiklerin ve büyümenin nicel bir temsilini çıkarmak için üç aşamalı bir algoritma geliştirildi. İlk adım, hücreyi arka plandan bölümlere ayırır ve piksel yoğunluğu uzayında bir eşikleme tekniği aracılığıyla ikili bir maske üretir. İkinci adım, bir iskeletleştirme işlemi yoluyla hücrenin orta hattından geçen bir yolu izler. Son olarak, üçüncü adım, işlenen verileri bir oransal zaman atlamalı olarak sağlar ve bir oransal kimograf (yani, zaman içinde bir 1B uzamsal profil) verir. Büyüyen polen tüplerinden genetik olarak kodlanmış floresan raportörlerle elde edilen oransal görüntülerden elde edilen veriler, yöntemi karşılaştırmak için kullanıldı. Bu boru hattı, polarize hücrelerin orta hattı boyunca uzay-zamansal dinamiklerin daha hızlı, daha az önyargılı ve daha doğru bir şekilde temsil edilmesini sağlar, böylece hücre polaritesini araştırmak için mevcut nicel araç setini geliştirir. AMEBaS Python kaynak kodu şu adreste mevcuttur: https://github.com/badain/amebas.git

AMEBaS boru hattı, floresan mikroskobu görüntü yığınlarından polarize tek hücrelerin orta hat dinamiklerinin çıkarılmasını otomatikleştirerek daha az zaman alır ve insan hatalarına daha az eğilimli hale getirir. Yöntem, büyüyen tek hücrelerde kimograflar ve oransal görüntü yığınları (Şekil 1) oluşturarak bu zaman atlamalarını ölçer. Tek hücrelerin taşınması üzerinde çalışacak şekilde ayarlanabilir, ancak daha fazla deney gereklidir. AMEBaS, Python'...

Watch this Scientific Journal Video about AMEBaS: Automatic Midline Extraction and Background Subtraction of Ratiometric Fluorescence Time-Lapses of Polarized Single Cells at JoVE.com

AMEBaS: Automatic Midline Extraction and Background Subtraction of Ratiometric Fluorescence Time-Lapses of Polarized Single Cells

Polarize tek hücrelerin hücre içi dinamiklerini analiz etmek için mevcut yöntemler genellikle manueldir ve standardizasyondan yoksundur. Bu makale, tek polarize hücrelerin orta hat ekstraksiyonunu otomatikleştirmek ve kullanıcı dostu bir çevrimiçi arayüzde zaman atlamalarından uzay-zamansal davranışı ölçmek için yeni bir görüntü analizi boru hattı sunmaktadır.

AMEBaS: Polarize Tek Hücrelerin Oransal Floresan Zaman Atlamalarının Otomatik Orta Hat Ekstraksiyonu ve Arka Plan Çıkarımı

Cell polarity is a macroscopic phenomenon established by a collection of spatially concentrated molecules and structures that culminate in the emergence ...

Bu yöntem, aktin, iyonlar veya vezikül dinamikleri gibi belirli bir varlık için floresan raportör veya boya eksprese eden orta hattı boyunca polarize hücrelerin uzay-zamansal dinamiklerini ölçer. Otomasyon sürümü, özellikle dijital olarak manuel olarak yapılan ve zaman alıcı ve öznel hale gelebilen görevler için önyargıları ortadan kaldırır ve ölçeklenebilirliğe izin verir. Başlamak için Jupyter Notebook'u açın ve Google CoLab etkileşimli not defteri ana sayfasına erişerek veya GitHub'dan AMEBaS_local IP YNB'yi indirip açarak hızlandırılmış dosyaları okuyun.Yerel sürümü kullanarak giriş ve çıkış verileri için dizin kurulumunu hazırlamak için, floresan hızlandırılmış çekimi bir TIF veya DV dosyası olarak programın kök klasöründe bulunan data adlı bir klasörün içine yerleştirin. Oluşturulan verileri almak için bir çıkış klasörü oluşturun, ardından kurulum kodu bloğunu çalıştırın. Not defterini Google CoLab'de kullanıyorsanız, otomatik olarak veri ve çıkış klasörleri oluşturmak için kurulum kodu bloğunu yürütün, ardından oynat düğmesine tıklayarak hızlandırılmış verileri okumak için dosya giriş kodu bloğunu çalıştırın.Google CoLab kullanıyorsanız, dosya seç düğmesini tıklayarak hızlandırılmış dosyayı veri klasörüne yükleyin. Ardından, ayrıntılı parametreyi true veya false olarak ayarlayarak her adım için ek çıkışlar oluşturmayı seçin. Ana hücreyi ve segmenti arka plandan algılamak için, ilgilenilen hücreyi arka plandan otomatik olarak ayırmak için oynat düğmesine tıklayarak tek hücre segmentasyon kod bloğunu çalıştırın.Segmentasyon maskesinin düzgünlüğüne ince ayar yapmak için sigma değişkenindeki sigma değerini ayarlayın. Varsayılan değer 2.0'dır. Şimdi, doğrudan ISO verilerinden tahmin edilen eşiği depolamak için estimate değişkenini false olarak veya yerel polinom regresyonunu kullanarak komşu çerçeveler arasında yumuşatmak için true olarak ayarlayın.Varsayılan değer 40 olacak şekilde işleve ince ayar yapmak için n_points değişkenini ayarlayın. Hücre uzantısı boyunca orta çizgiyi izlemek için, Lee'nin yöntemini kullanarak hücreyi iskeletleştirmek ve son iskeletin ucunu doğrusal ekstrapolasyon yoluyla uzatmak için oynat düğmesine tıklayarak hücre orta çizgisi izleme kod bloğunu çalıştırın. Ardından, complete_skeletonization bağımsız değişkenini son karede veya kare başına bir kez izlenecek şekilde ayarlayarak orta çizgi için izleme seçeneğini belirleyin.Ekstrapolasyon sırasında enterpolasyon için iskeletteki noktaların fraksiyonunu ayarlamak için interpolation_fraction değişkenini ayarlayın. Buradaki varsayılan değer 0,25'tir. Ardından, orta hat ekstrapolasyonunun uzunluğunu belirlemek için extrapolation_length değişkenini değiştirin.Varsayılan değer, iskeleti en yakın kenara kadar uzatan eksi birdir. Şimdi her iki kanal için de otomatik olarak kymograf oluşturmak üzere oynat düğmesine tıklayarak ilk veri görselleştirme kod bloğunu çalıştırın. kymograph_kernel değişkenini ayarlayarak yumuşatma için Gauss çekirdek boyutunu seçin.Uzatılmamış iskeletlerin yoğunluklarını düzgün bir şekilde görüntülemek için, kapaklı kymografları için özel bir renk haritası gereklidir. Arka plan rengi olarak belirlenecek yoğunlukların kesir yüzdesini (siyah) seçmek için shift_fraction değişkenini ayarlayın. Ardından, otomatik olarak bir oran metriği, kymograf ve hızlandırılmış çekim oluşturmak için oynat düğmesine tıklayarak ikinci veri görselleştirme kod bloğunu çalıştırın.Oran hesaplamaları sırasında pay ve payda olarak kullanılan kanalların sırasını değiştirmek için switch_ratio değişkenini varsayılan değer false olacak şekilde ayarlayın. smooth_ratio değişkenini ayarlayarak oran zaman atlamasının medyan filtre geçişiyle ek yumuşatma gerektirip gerektirmediğini kontrol edin. Varsayılan olarak, bu false olarak ayarlanmıştır.Ardından, reject_outliers değişkenini ayarlayarak payda kanalındaki düşük sinyalden kaynaklanan aykırı değerleri kaldırmayı veya tutmayı seçin. Aykırı değerler, üçüncü çeyreğin üzerindeki çeyrekler arası aralığın 1,5 katı değerler olarak işaretlenir. Son olarak, değişken background_ratio ayarlayarak arka planın ve oran metrik çıktısının dışa aktarılması gerekip gerekmediğini seçin.Arka planı sıfırlarla değiştirmek için varsayılan değer false değeridir. AMEBaS, kalsiyum raportörü kameleonunu ifade eden polen tüpleri, pH indikatörü florini ifade eden polen tüpleri, kalsiyum raportörü NESYC 3.6'yı ifade eden kök kılları gibi veri kümeleri üzerinde test edildi, büyüme yönündeki farklılıklara rağmen başarılı bir şekilde çalıştı, görüntüleme teknikleri, floresan raportörler ve hücre tipleri. Gerekli paketleri kurabilmeniz için blok kümesini çalıştırmayı unutmayın.Ek olarak, daha doğru sonuçlar alabilmeniz için sigma değerlerini resimleriniz için özel olarak ayarlamanız çok önemlidir. Elde edilen kimografiler daha sonra ilgilenilen çözümün uzay-zamansal dinamiklerini analiz etmek için kullanılabilir. Ek olarak, doğru çözümü analiz etmek için bulma yöntemini, büyümeyi ve zaman serisini hesaplayabilirsiniz.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

İzolasyon ve Zebra balığı Embriyolar gelen Tek Hücre Karakterizasyonu

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Gelişim Biyolojisi

Identification of Critical Conditions for Immunostaining in the Pea Aphid Embryos: Increasing Tissue Permeability and Decreasing Background Staining

Bezelye Afit Embriyolar immün için kritik Koşulların Belirlenmesi: Doku geçirgenliğini arttırarak ve Arka Plan Boyama azaltılması

The pea aphid Acyrthosiphon pisum, with a sequenced genome and abundant phenotypic plasticity, has become an emerging model for genomic and developmental ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Yatay Dağ Dağı: Derinin kalın, üç boyutlu doku kesitleri için yeni bir İşleme ve Görüntüleme Protokolü

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Single-Cell Quantification of Protein Degradation Rates by Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Adherent Cell Culture

Tek hücreli miktar Protein yıkımı oranları hızlandırılmış Floresans mikroskobu yapisan hücre kültüründe tarafından

Proteins are in a dynamic state of synthesis and degradation and their half-lives can be adjusted under various circumstances. However, most commonly used ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Yaşam sağlam Zebra balığı tek hücreli Photoconversion

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Çekirdeklerin dağıtım, proteinler ve sitoiskeleti çalışmaya Caenorhabditis elegans Germline sayısal analizi

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

Fare pankreatik endokrin hücreleri tek hücre Transcriptomic analizleri

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Somite türevleri indüklenen insan nesil Vitro Pluripotent kök hücreler

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinin Tek Hücre Kültürünü Kullanarak Etkin Nöral Farklılaşma

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

Erken Fare Embriyolarından Sıralama için Küçük RNA Kütüphanelerinin Hazırlanması

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...