Il metodo è relativamente semplice e consente un efficiente editing genetico delle cellule B del macaco rhesus. Il metodo consente di testare le cellule B geneticamente modificate per scopi terapeutici nei macachi rhesus. È adatto anche per la ricerca preclinica sulla terapia cellulare B.
Il metodo generale può essere adattato per altri tipi di cellule. Se la procedura viene seguita correttamente, non ci si dovrebbe aspettare lotte. Tuttavia, poiché l'efficienza di taglio del gRNA e un lotto di buona qualità di modello ricombinante che fornisce AAV6 sono fondamentali.
Per iniziare, preriscaldare il terreno di coltura delle cellule B in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Scongelare gli stimolanti delle cellule B sul ghiaccio. Preparare un tubo di dimensioni appropriate contenente un mezzo di scongelamento preriscaldato.
Scongelare una o due fiale di splenociti primari di macaco rhesus o PBMC in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Decantare gli splenociti nel tubo preparato contenente un mezzo di scongelamento preriscaldato. Risciacquare i criotubi per raccogliere tutte le cellule.
Centrifugare le celle a 200 G per 10 minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in 10 millilitri di mezzo di scongelamento per il lavaggio. Ripetere le centrifugazioni tre volte per rimuovere il mezzo di congelamento.
Dopo l'ultima centrifugazione, risospendere le cellule a circa cinque volte 10 alle sei cellule per millilitro in un mezzo di coltura di cellule B. Combinare 10 microlitri di sospensione cellulare con 10 microlitri di 0,4% di tripano blu e contare le cellule su un emocitometro. Regolare la concentrazione cellulare a tre volte 10 alle sei cellule per millilitro con terreno di coltura di cellule B in base al conteggio delle cellule.
Quindi, aggiungere gli stimolanti delle cellule B alle loro concentrazioni finali e mescolare. Trasferire le cellule in un piatto di coltura cellulare e incubarle a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per 48 ore. Dopo l'assestamento, le cellule dovrebbero formare un monostrato denso e piccoli gruppi di cellule potrebbero essere già visibili.
Dopo circa due giorni, le cellule dovrebbero essere sane, irregolari e aver formato gruppi visibilmente più grandi. Dopo aver attivato le cellule B, preparare i reagenti per l'elettroporazione e la trasduzione. Preriscaldare il tampone duplex privo di nucleasi DMSO, il buffer T e il tampone E o E2 dal kit di elettroporazione a temperatura ambiente.
Scongelare il modello di riparazione diretto dall'omologia rAAV6, o HDRT, e gli stimolanti delle cellule B sul ghiaccio. Risospendere l'RNA a guida singola Cas9 di CRISPR, o sgRNA, a 100 micromolari nel tampone duplex. Ricostituire per 10 minuti a temperatura ambiente e mescolare vorticando e sfarfallando.
Porre lo sgRNA ricostituito su ghiaccio fino all'uso. Per l'elettroporazione da 10 microlitri, preparare 550 microlitri di terreno di coltura cellulare B con stimolanti e 1% DMSO. Aggiungere 50 microlitri di questo mezzo con o senza antibiotici in una piastra di coltura cellulare a 48 pozzetti.
Quindi, aggiungere rAAV6 HDRT al mezzo nei pozzi, fino al 20% del volume del pozzo. Preriscaldare il piatto preparato e rimanendo il mezzo in un'incubatrice a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Successivamente, per l'elettroporazione da 10 microlitri, preparare 1,15 microlitri di ribonucleoproteina, o RNP, mescolando 0,4 microlitri di Cas9 61-micromolare con 0,75 microlitri di sgRNA 100-micromolare in tampone duplex.
Incubare l'RNP per 15 minuti a temperatura ambiente prima di mescolarlo con le cellule. Dopo l'incubazione, più RNP possono essere combinati se più di un locus deve essere preso di mira contemporaneamente. Quindi, preparare le cellule per l'elettroporazione.
Lasciare le celle a temperatura ambiente per evitare shock termici. Dopo l'incubazione, raccogliere le cellule in un recipiente appropriato. Risciacquare il piatto con DPBS per raccogliere il numero massimo di celle.
Centrifugare le cellule a 200 g per 10 minuti. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in DPBS a circa due volte 10 alle sei cellule per millilitro, in base al numero di cellule immesse nella coltura. Combinare volumi uguali di sospensione cellulare e 0,4% di blu di tripano e contare utilizzando un emocitometro.
Dopo aver centrifugato e scartato il surnatante, risospendere le cellule nel tampone T preriscaldato a 5,55 volte 10 alle sette cellule per millilitro, in base al conteggio delle cellule. Impostare il sistema di trasfezione accendendo la macchina e impostandola su 1.350 volt, 15 millisecondi e un impulso. Posizionare la stazione della pipetta all'interno del paraluce a flusso laminare.
Per ogni set di 10 elettroporazioni, preparare un tubo di trasfezione con tre millilitri di tampone E.Inserire il tubo nella stazione di pipetta. Combinare 1,15 microlitri di RNP con nove microlitri di cellule per elettroporazione. Preparare almeno il 20% in più per evitare bolle e incubare a temperatura ambiente per un minuto prima dell'elettroporazione.
Aspirare 10 microlitri di RNP e miscela cellulare nella punta dell'elettroporazione su una pipetta di elettroporazione. Inserire la pipetta caricata nella stazione di pipette e avviare l'elettroporazione. Assicurarsi che le punte siano completamente prive di bolle d'aria per evitare l'arco elettrico.
Espellere immediatamente le cellule elettroporate nel piccolo volume di mezzo preriscaldato preparato, con o senza rAAV6, all'interno del pozzetto 48. Aggiungi campioni di controllo senza trasfezione ai pozzetti di coltura. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per quattro-sei ore.
Alla fine dell'incubazione, aggiungere 450 microlitri di terreno di coltura di cellule B preriscaldato contenente stimolanti, DMSO e con o senza antibiotici nella piastra. Eseguire l'analisi del DNA genomico dopo 24 ore. Quantificare l'efficienza di editing con la reazione a catena della polimerasi a goccia digitale, o PCR, utilizzando un primer all'esterno del braccio di omologia e un primer all'interno dell'inserto.
Eseguire la PCR per amplificare il sito di inserimento e il sequenziamento Sanger per verificare il corretto editing. Per analizzare i livelli proteici, coltivare le cellule per 40-48 ore dopo l'elettroporazione per consentire cambiamenti di espressione proteica ed eseguire un'analisi mediante citometria a flusso. La produzione di rAAV6 utilizzando un helper adenovirale abilitato alla tetraciclina e autosilenziante ha portato alla produzione di quattro volte da 10 a 10 GC per millilitro di terreno di coltura cellulare, superando la produzione utilizzando una tripla trasfezione senza aiutanti da 30 a 40 volte.
La purificazione opzionale ha portato all'eliminazione della maggior parte delle cellule CD3 + T e delle cellule mieloidi CD14 + e CD16 +, con purezze dall'80 al 95% di cellule CD20 + B ottenute di routine. L'editing genetico delle cellule B del macaco rhesus primario è mostrato qui. Questo studio ha mantenuto un'elevata vitalità cellulare, eliminando contemporaneamente l'espressione della catena leggera nelle cellule dell'80% B.
La maggior parte delle cellule B esprimeva ancora l'isotipo IgM. L'aggiunta di rAAV6 che codifica per l'anticorpo 1485 HDRT ha portato all'editing genico e all'espressione superficiale dell'anticorpo 1485 nel 16-21% delle cellule B, sebbene a un'intensità di fluorescenza inferiore per le catene anticorpali rispetto alle cellule B non modificate. L'aggiunta dell'1% di DMSO e incubazioni estese e concentrate con l'HDRT rAAV6 ha generalmente aumentato l'efficienza di editing.
Utilizzando questo metodo, in genere è stata raggiunta un'efficienza di editing da cinque a 20% e fino al 40%, a seconda del singolo macaco rhesus e della qualità del lotto rAAV6 HDRT. Durante l'esecuzione dell'elettroporazione, assicurarsi di avere abbastanza miscela per la trasfezione e non ci siano bolle nella punta. Le cellule possono essere analizzate con qualsiasi metodo desiderato o può essere eseguito un trasferimento autologo nel macaco rhesus del donatore.
