이 방법은 비교적 간단하며 붉은털 원숭이 B 세포의 효율적인 유전자 편집을 가능하게 합니다. 이 방법을 사용하면 붉은털 원숭이의 치료 목적으로 유전자 편집 B 세포를 테스트할 수 있습니다. 전임상 B 세포 치료 연구에도 적합합니다.
일반적인 방법은 다른 세포 유형에 적합할 수 있다. 절차를 올바르게 수행하면 어려움을 기대해서는 안됩니다. 그러나, gRNA 절단 효율 및 재조합 AAV6 제공 주형의 양질의 배치가 중요하기 때문이다.
시작하려면 섭씨 37도의 수조에서 B 세포 배양 배지를 예열합니다. 얼음에서 B 세포 각성제를 해동하십시오. 예열된 해동 매체가 들어 있는 적절한 크기의 튜브를 준비합니다.
1차 붉은털 원숭이 비장세포 또는 PBMC의 1-2개 바이알을 섭씨 37도의 수조에서 해동합니다. 미리 예열된 해동 배지가 들어 있는 준비된 튜브에 비장세포를 디캔팅합니다. cryotube를 헹구어 모든 세포를 수집합니다.
실온에서 10분 동안 200G에서 세포를 원심분리합니다. 상청액을 버리고 세척을 위해 10 밀리리터의 해동 배지에 세포를 재현탁하십시오. 원심분리를 세 번 반복하여 동결 매체를 제거합니다.
마지막 원심분리 후, 세포를 B 세포 배양 배지에서 밀리리터당 10 내지 6개의 세포로 추정 5배로 재현탁시킨다. 10 마이크로리터의 세포 현탁액과 10 마이크로리터의 0.4% 트리판 블루를 결합하고 혈구계에서 세포 수를 세십시오. 세포 수에 따라 B 세포 배양 배지로 밀리리터당 6개의 세포를 10배로 3회 조절한다.
그런 다음 B 세포 각성제를 최종 농도에 첨가하고 혼합합니다. 세포를 세포 배양 접시에 옮기고 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소로 48시간 동안 배양합니다. 침전 후, 세포는 조밀 한 단층을 형성해야하며 작은 세포 클러스터가 이미 보일 수 있습니다.
약 이틀 후, 세포는 건강하고 불규칙하며 눈에 띄게 더 큰 클러스터를 형성해야 합니다. B 세포를 활성화시킨 후, 전기천공 및 형질도입을 위한 시약을 준비한다. DMSO 뉴클레아제가 없는 듀플렉스 버퍼, 버퍼 T 및 버퍼 E 또는 E2를 전기천공 키트에서 실온으로 예열합니다.
rAAV6 상동성 지향 복구 템플릿 또는 HDRT 및 B 세포 자극제를 얼음에서 해동합니다. CRISPR Cas9 single-guide RNA 또는 sgRNA를 듀플렉스 버퍼에서 100마이크로몰로 재현탁합니다. 실온에서 10분간 재구성하고 볼텍싱과 플릭으로 혼합한다.
재구성된 sgRNA를 사용할 때까지 얼음 위에 놓습니다. 10마이크로리터 전기천공의 경우 각성제 및 1% DMSO가 포함된 550마이크로리터의 B 세포 배양 배지를 준비합니다. 항생제를 사용하거나 사용하지 않고 이 배지 50마이크로리터를 48웰 세포 배양 플레이트에 추가합니다.
그런 다음 rAAV6 HDRT를 웰 부피의 최대 20%까지 웰의 매체에 추가합니다. 준비된 접시와 남은 배지를 섭씨 37도의 인큐베이터에서 5% 이산화탄소로 예열합니다. 다음으로, 10 마이크로리터 전기천공을 위해, 듀플렉스 완충액에서 0.4 마이크로리터의 61 마이크로몰 Cas9와 0.75 마이크로리터의 100 마이크로몰 sgRNA를 혼합하여 1.15 마이크로리터의 리보핵단백질 또는 RNP를 준비한다.
RNP를 세포와 혼합하기 전에 실온에서 15분 동안 배양합니다. 배양 후, 하나 이상의 유전자좌가 동시에 표적화되는 경우 여러 RNP를 결합할 수 있습니다. 다음으로, 전기 천공을 위해 셀을 준비합니다.
온도 충격을 피하기 위해 셀을 실온에 두십시오. 배양 후, 세포를 적절한 용기로 수확한다. DPBS로 접시를 헹구어 최대 세포 수를 수집하십시오.
세포를 200G에서 10분 동안 원심분리합니다. 상청액을 버리고, 배양물에 투입된 세포의 수를 기준으로 약 2배 내지 밀리리터당 6개의 세포로 DPBS에 세포를 재현탁시킨다. 동일한 부피의 세포 현탁액과 0.4% 트리판 블루를 결합하고 혈구계를 사용하여 계산합니다.
원심분리하고 상청액을 버린 후, 세포 계수를 기준으로 5.55 x 10 내지 7개의 세포로 예열된 완충액 T에서 세포를 재현탁한다. 기계를 켜고 1, 350볼트, 15밀리초 및 1펄스로 설정하여 형질주입 시스템을 설정합니다. 층류 후드 안에 피펫 스테이션을 놓습니다.
10개의 전기천공법의 각 세트에 대해, 3밀리리터의 완충액 E.가 있는 형질주입 튜브를 준비하고, 튜브를 피펫 스테이션에 삽입한다. 전기천공당 1.15마이크로리터의 RNP와 9마이크로리터의 세포를 결합합니다. 기포를 피하기 위해 최소 20% 이상 준비하고 전기천공 전에 실온에서 1분 동안 배양합니다.
10마이크로리터의 RNP와 세포 혼합물을 전기천공 피펫의 전기천공 팁으로 흡인합니다. 로드된 피펫을 피펫 스테이션에 삽입하고 전기천공을 시작합니다. 아크를 방지하기 위해 팁에 기포가 완전히 없는지 확인하십시오.
전기 천공 된 셀을 48 웰 내부의 rAAV6 유무에 관계없이 준비된 예열 된 소량의 배지로 즉시 배출합니다. transfection하지 않고 대조군 샘플을 배양 웰에 추가합니다. 섭씨 37도에서 5 % 이산화탄소로 4-6 시간 동안 세포를 배양하십시오.
배양이 끝나면 각성제, DMSO 및 항생제를 포함하거나 포함하지 않는 예열 된 B 세포 배양 배지 450 마이크로 리터를 플레이트에 첨가하십시오. 24시간 후에 게놈 DNA 분석을 수행합니다. 상동성 암 외부의 프라이머와 삽입물 내부의 프라이머를 사용하여 디지털 액적 중합효소 연쇄 반응(PCR)으로 편집 효율을 정량화합니다.
PCR을 수행하여 삽입 부위를 증폭하고 Sanger 염기서열 분석을 수행하여 올바른 편집을 확인합니다. 단백질 수준을 분석하기 위해, 단백질 발현 변화를 허용하도록 전기천공 후 40 내지 48시간 동안 세포를 배양하고 유세포 분석에 의한 분석을 수행한다. 테트라사이클린이 활성화된 자가 침묵 아데노바이러스 헬퍼를 사용한 rAAV6의 생산은 세포 배양 배지 밀리리터당 10 내지 10 GC의 4배를 생산하여 헬퍼가 없는 삼중 형질감염을 사용한 생산을 30배에서 40배 능가했습니다.
선택적 정제를 통해 대부분의 CD3+T 세포와 CD14+ 및 CD16+골수 세포가 제거되었으며, 순도 80 내지 95%의 CD20+B 세포가 일상적으로 얻어졌습니다. 일차 붉은털 원숭이 B 세포의 유전자 편집이 여기에 나와 있습니다. 이 연구는 높은 세포 생존율을 유지하면서 동시에 80%B 세포에서 경쇄 발현을 삭제했습니다.
대부분의 B 세포는 여전히 이소타입 IgM을 발현했습니다. 항체 1485 HDRT를 코딩하는 rAAV6의 첨가는 편집되지 않은 B 세포보다 항체 사슬에 대한 형광 강도가 낮았음에도 불구하고 B 세포의 16 내지 21%에서 유전자 편집 및 항체 1485 표면 발현을 초래했습니다. 1% DMSO를 추가하고 rAAV6 HDRT를 사용한 확장된 농축 배양은 일반적으로 편집 효율성을 높였습니다.
이 방법을 사용하면 일반적으로 5-20 % 및 최대 40 %의 편집 효율이 개별 붉은털 원숭이 및 rAAV6 HDRT 배치의 품질에 따라 달성되었습니다. 전기천공을 수행하는 동안 형질주입을 위한 충분한 혼합물이 있고 팁에 기포가 없는지 확인합니다. 세포는 임의의 원하는 방법에 의해 분석될 수 있거나, 또는 공여체 붉은털 원숭이 내로의 자가 이식이 수행될 수 있다.
