O método é relativamente simples e permite a edição gênica eficiente de células B de macaco rhesus. O método permite o teste de células B editadas por genes para fins terapêuticos em macacos rhesus. Também é adequado para pesquisa pré-clínica de terapia com células B.
O método geral pode ser adaptado para outros tipos celulares. Se o procedimento for seguido corretamente, não se deve esperar dificuldades. No entanto, como a eficiência de corte de gRNA e um lote de boa qualidade de molde AAV6 recombinante são críticos.
Para começar, pré-aqueça o meio de cultura de células B em banho-maria de 37 graus Celsius. Descongelar os estimulantes de células B no gelo. Preparar um tubo de tamanho adequado contendo um meio de descongelamento pré-aquecido.
Descongelar um a dois frascos de esplenócitos primários de macaco rhesus ou PBMCs em banho-maria de 37 graus Celsius. Decantar os esplenócitos no tubo preparado contendo um meio de descongelamento pré-aquecido. Enxágue os criotubos para coletar todas as células.
Centrifugar as células a 200 G durante 10 minutos à temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em 10 mililitros de meio de descongelamento para lavagem. Repita as centrifugações três vezes para remover o meio de congelamento.
Após a última centrifugação, ressuspender as células em uma estimativa de cinco vezes 10 a seis células por mililitro em meio de cultura de células B. Combinar 10 microlitros de suspensão celular com 10 microlitros de azul de tripano a 0,4% e contar as células em um hemocitômetro. Ajustar a concentração celular para três vezes 10 a seis células por mililitro com meio de cultura de células B de acordo com a contagem de células.
Em seguida, adicione os estimulantes de células B às suas concentrações finais e misture. Transfira as células para uma placa de cultura celular e incube-as a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 48 horas. Após a colonização, as células devem formar uma monocamada densa e pequenos aglomerados de células podem já estar visíveis.
Após cerca de dois dias, as células devem estar saudáveis, irregulares e ter formado aglomerados visivelmente maiores. Após ativar as células B, preparar os reagentes para eletroporação e transdução. Pré-aqueça o tampão duplex livre de nuclease DMSO, o tampão T e o tampão E ou E2 do kit de eletroporação à temperatura ambiente.
Descongele o modelo de reparo dirigido por homologia rAAV6, ou HDRT, e os estimulantes de células B no gelo. Ressuspenda o RNA de guia único CRISPR Cas9, ou sgRNA, em 100 micromolares em tampão duplex. Reconstituir por 10 minutos à temperatura ambiente e misturar por vórtice e agitação.
Coloque o sgRNA reconstituído no gelo até ser utilizado. Para eletroporação de 10 microlitros, preparar 550 microlitros de meio de cultura de células B com estimulantes e DMSO 1%. Adicionar 50 microlitros deste meio com ou sem antibióticos em uma placa de cultura celular de 48 poços.
Em seguida, adicione rAAV6 HDRT ao meio nos poços, até 20% do volume do poço. Pré-aqueça o prato preparado e o meio restante em uma incubadora a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Em seguida, para eletroporação de 10 microlitros, prepare 1,15 microlitros de ribonucleoproteína, ou RNP, misturando 0,4 microlitros de Cas9 61 micromolares com 0,75 microlitros de sgRNA 100 micromolares em tampão duplex.
Incubar o RNP por 15 minutos à temperatura ambiente antes de misturá-lo com as células. Após a incubação, várias RNPs podem ser combinadas se mais de um locus for alvo simultaneamente. Em seguida, prepare as células para eletroporação.
Deixe as células à temperatura ambiente para evitar choques de temperatura. Após a incubação, colher as células em um recipiente apropriado. Lave a placa com DPBS para coletar o número máximo de células.
Centrifugar as células a 200 G durante 10 minutos. Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em DPBS em aproximadamente duas vezes 10 a seis células por mililitro, com base no número de células colocadas na cultura. Combinar volumes iguais de suspensão celular e azul de tripano a 0,4% e contar usando um hemocitômetro.
Após centrifugar e descartar o sobrenadante, ressuspender as células em tampão T pré-aquecido a 5,55 vezes 10 a sete células por mililitro, com base na contagem celular. Configure o sistema de transfecção ligando a máquina e configurando-a para 1.350 volts, 15 milissegundos e um pulso. Coloque a estação de pipetas dentro da capela de fluxo laminar.
Para cada conjunto de 10 eletroporações, prepare um tubo de transfecção com três mililitros de tampão E.Insira o tubo na estação de pipeta. Combinar 1,15 microlitros de RNP com nove microlitros de células por eletroporação. Preparar pelo menos 20% mais para evitar bolhas e incubar à temperatura ambiente por um minuto antes da eletroporação.
Aspirar 10 microlitros de RNP e mistura celular na ponta de eletroporação em uma pipeta de eletroporação. Insira a pipeta carregada na estação de pipetas e inicie a eletroporação. Certifique-se de que as pontas estejam completamente livres de bolhas de ar para evitar o arranque.
Ejetar imediatamente as células eletroporadas para o pequeno volume de meio pré-aquecido preparado, com ou sem rAAV6, dentro do poço 48. Adicionar amostras controle sem transfecção aos poços de cultura. Incubar as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono durante quatro a seis horas.
Ao final da incubação, adicionar 450 microlitros de meio de cultura de células B pré-aquecido contendo estimulantes, DMSO e com ou sem antibióticos na placa. Realizar análise de DNA genômico após 24 horas. Quantifique a eficiência de edição com a reação em cadeia da polimerase digital por gotícula, ou PCR, usando um primer fora do braço de homologia e um primer dentro da inserção.
Execute PCR para amplificar o local de inserção e sequenciamento de Sanger para verificar a edição correta. Para análise dos níveis de proteína, cultivar as células por 40 a 48 horas após a eletroporação para permitir alterações na expressão proteica e realizar análise por citometria de fluxo. A produção de rAAV6 usando o auxiliar adenoviral autosilenciante habilitado para tetraciclina resultou na produção de quatro vezes 10 a 10 GC por mililitro de meio de cultura celular, superando a produção usando uma tripla transfecção livre de ajudantes em 30 a 40 vezes.
A purificação opcional resultou na eliminação da maioria das células T CD3+ e das células mieloides CD14+ e CD16+, com pureza de 80 a 95% de células B CD20+ sendo rotineiramente obtidas. A edição gênica de células B primárias de macaco rhesus é mostrada aqui. Este estudo manteve alta viabilidade celular, ao mesmo tempo em que excluiu a expressão de cadeias leves em células B a 80%.
A maioria das células B ainda expressou o isotipo IgM. A adição de rAAV6 que codifica o anticorpo 1485 HDRT resultou em edição gênica e expressão de superfície do anticorpo 1485 em 16 a 21% das células B, embora em uma intensidade de fluorescência menor para cadeias de anticorpos do que em células B não editadas. A adição de 1% de DMSO e incubações concentradas estendidas com o rAAV6 HDRT geralmente aumentaram a eficiência de edição.
Usando este método, tipicamente cinco a 20% e até 40% de eficiência de edição foi alcançada, dependendo do macaco rhesus individual e da qualidade do lote rAAV6 HDRT. Ao realizar a eletroporação, certifique-se de ter mistura suficiente para transfecção e não haja bolhas na ponta. As células podem ser analisadas por qualquer método desejado ou uma transferência autóloga para o macaco rhesus doador pode ser realizada.
