Name: the chick chorioallantoic membrane (cam) model as a tool to study ovarian tissue transplantation
Uploaded: 2023-06-23T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Chick Chorioallantoic Membrane CAM Model as a Tool to Study Ovarian Tissue Transplantation at JoVE.com

يشكر المؤلفون ميرا هرينيوك ، بكالوريوس ، لمراجعة اللغة الإنجليزية للمقال.

تمت الموافقة على استخدام الأنسجة البشرية من قبل مجلس المراجعة المؤسسية للجامعة الكاثوليكية في لوفان. أعطى المرضى موافقتهم الخطية المستنيرة على استخدام أنسجة المبيض لأغراض البحث.
1. طلب يوم 0 بويضات من المحتمل جدا أن تكون جنينية
<ol><li>ابحث عن مورد بيض Leghorn أبيض معتمد...

الجزء الأكثر تحديا في البروتوكول الموصوف هنا هو عمل الثقب الصغير المطلوب لاستنشاق الزلال من أجل فصل CAM عن قشر البيض قبل إنشاء نافذة. يمكن أن يؤدي الضغط المفرط إلى الإفراط في الاختراق أو قد يؤدي إلى تكسير البويضة وتدميرها ، مما يتسبب في تلف لا رجعة فيه للطب التكميلي والبديل والأوعية الدموية...

ازداد الطلب على الحفاظ على الخصوبة لمؤشرات الأورام والحميدة ، وكذلك الأسباب الاجتماعية ، بشكل كبير خلال العقود الأخيرة. ومع ذلك ، فإن العلاجات المختلفة المستخدمة لعلاج الأمراض الخبيثة وغير الخبيثة شديدة السمية للغدد التناسلية ويمكن أن تؤدي إلى قصور المبيض المبكر علاجي المنشأ ، مما يؤدي في النهاية إلى العقم1. تشمل التقنيات الراسخة للحفاظ على الخصوبة حفظ الأجنة بالتبريد ، وتزجيج البويضات غير الناضجة أو الناضجة ، والحفظ بالتبريد لأنسجة المبيض2،3،4. تجميد أنسجة المبيض هو الخيار الوحيد المتاح للحفاظ على الخصوبة لدى الفتيات قبل سن البلوغ أو النساء اللائي يحتجن إلى علاج فوري للسرطان. تحدث استعادة وظيفة الغدد الصماء بعد زرع أنسجة المبيض في أكثر من 95٪ من الأشخاص ، مع معدلات ولادة حية تتراوح من 18٪ إلى 42٪ 5،6،7،8،9.
على الرغم من أن زرع أنسجة المبيض المجمدة المذابة قد أثبت نجاحه ، لا يزال هناك مجال للتحسين. في الواقع ، عندما يتم زرع شظايا المبيض القشرية دون مفاغرة الأوعية الدموية ، فإنها تعاني من فترة نقص الأكسجة التي تحدث خلالها إعادة التوعيالكسب غير المشروع 10،11،12. استخدمت الغالبية العظمى من الدراسات التي تبحث في زراعة أنسجة المبيض البشري نموذج التطعيم بالخارج ، حيث يتم زرع أنسجة المبيض للفئران التي تعاني من نقص المناعة. تستغرق إعادة التوعي الكاملة للطعوم الخارجية حوالي 10 أيام ، حيث تساهم كل من الأوعية المضيفة وأوعية الكسب غير المشروع في تكوين الأوعية الوظيفية12،13،14. يتم فقدان حوالي 50٪ -90٪ من احتياطي الجريب خلال نافذة نقص الأكسجين هذه قبل الانتهاء من إعادة توعية الكسب غير المشروع10،15،16. وقد اقترح بقوة أن هذا الفقدان الهائل للجريب يحدث من خلال كل من موت الجريب المباشر ، كما يتضح من انخفاض أعداد البصيلات المطلقة المتبقية بعد التطعيم ، وتنشيط نمو الجريب البدائي ، كما يتضح من التغيرات في نسب الجريب نحو زيادة معدلات نمو البصيلات17,18.
ومن المثير للاهتمام ، أن الأعمال البحثية السابقة باستخدام أنسجة المبيض الحيوانية المختلفة المطعمة بغشاء المشيمية الذكورية (CAM) ، والتي لها دستور يحاكي موقع التطعيم النموذجي للبريتوني ، قد أبلغت عن تثبيط تنشيط الجريب التلقائي ، مع بقاء احتياطي الجريب البدائي سليما لمدة تصل إلى 10 أيام19،20،21،22. أثبت فريقنا سابقا أن تطعيم أنسجة المبيض البشري المذابة المجمدة بالطب التكميلي والبديل يشكل نهجا موثوقا به للتحقيق في زراعة أنسجة المبيض البشري في مراحلها الإقفاريةالأولى 23 وأظهر مؤخرا أن طريقة التطعيم هذه كانت قادرة على مواجهة تنشيط الجريب24.
نموذج الطب التكميلي والبديل جذاب بشكل خاص ليس فقط لأن البيض أرخص بكثير من الفئران ولكن أيضا بسبب الطبيعة الوعائية للغاية للطب التكميلي والبديل ، مما يسمح بالتدقيق في العلاقة بين تنشيط الجريب وإعادة توعية طعم المبيض. يعد نظام الطيور ، في الواقع ، أحد أكثر الطرق شيوعا وتنوعا لدراسة تكوين الأوعيةالدموية 25. يستغرق تطور جنين الفرخ (ED) 21 يوما حتى الفقس ، ويتم تشكيل الطب التكميلي والبديل خلال أول 4-5 أيام من خلال اندماج الألانتوا والمشيمية26. والجدير بالذكر أن جنين الفرخ هو مضيف يعاني من نقص المناعة بشكل طبيعي حتى اليوم 17 من الضعف الجنسي ، لذلك يمكن إجراء تجارب التطعيم بالأجانب دون أي خطر من رفض الكسب غير المشروع27,28. علاوة على ذلك ، لا يثير نهج نموذج الطب التكميلي والبديل أي مخاوف أخلاقية أو قانونية فيما يتعلق بالقانون الأوروبي29 ، مما يجعله بديلا جذابا للنماذج الحيوانية الأخرى. فيما يتعلق بظروف التكاثر ، تحتاج أجنة الكتاكيت فقط إلى حاضنة عند 37 درجة مئوية مع رطوبة هواء نسبية تتراوح بين 40٪ و 60٪. تقلل متطلبات التجارب المحدودة هذه بشكل كبير من تكاليف البحث مقارنة باستخدام الفئران التي تعاني من نقص المناعة.
يهدف البروتوكول المقدم هنا إلى وصف تطوير نموذج التطعيم الخارجي للطب التكميلي والبديل لأنسجة المبيض البشري وتقديم رؤى محددة حول فعالية التقنية ، والإطار الزمني لإعادة توعية الكسب غير المشروع ، وصلاحية الأنسجة على مدى فترة تطعيم مدتها 6 أيام. يمكن أن يكون هذا البروتوكول ذا أهمية كبيرة للتحقيق في الآليات الكامنة وراء فقدان الجريب المبكر بعد التطعيم ودراسة تأثير العديد من العوامل (عوامل النمو ، الهرمونات ، إلخ) على هذه الظاهرة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agani hypodermic needle, 19 G</td>
			<td>Terumo Europe</td>
			<td>AN*1950R1</td>
			<td>19 G needle to aspirate albumen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terumo syringe, 5 mL concentric Luer lock</td>
			<td>Terumo Europe</td>
			<td>SS*05LE1</td>
			<td>5-mL sterile syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caseviewer v2.2</td>
			<td>3DHISTECH</td>
			<td></td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether</td>
			<td>Merck Chemicals</td>
			<td>603-022-00-4</td>
			<td>Sterile ether to traumatize the CAM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y aqueous solution 0.5%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1098441000</td>
			<td>Staining solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde 4% aqueous solution buffered (Formalin 10%)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97139010</td>
			<td>Formaldehyde used for tissue fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fridge</td>
			<td>Liebherr</td>
			<td>7081260</td>
			<td>Fridge at 4 &#176;C used for paraffin-embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating plate</td>
			<td>Schott</td>
			<td>SLK2</td>
			<td>Hot plate used to dry the slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Forma Scientific 3111</td>
			<td>10365156</td>
			<td>Oven used for slide incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica CLS 150 XE microscope cold light source</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CLS 150 XE</td>
			<td>Focal cold light source to candle the eggs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens cleaning tissue, grade 541</td>
			<td>VWR</td>
			<td>111-5003</td>
			<td>Tissue to soak in sterile ether to traumatize the CAM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayer&#39;s hematoxylin</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1092491000</td>
			<td>Staining solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20847307</td>
			<td>Methanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>ThermoScientific-MICROM</td>
			<td>HM325-2</td>
			<td>Microtome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pannoramic P250 Flash III</td>
			<td>3DHISTECH</td>
			<td>/</td>
			<td>Slide scanner at 20x magnification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1,04,00,51,000</td>
			<td>Paraffin-embedding solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraplast Plus R</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3683-1KG</td>
			<td>Paraffin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 60x15 mm, sterile</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>628161</td>
			<td>Sterile petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pin holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26016-12</td>
			<td>Pin holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyhatch</td>
			<td>Brinsea</td>
			<td>CP01F</td>
			<td>Egg incubator with automatic rotator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scroll saw blade, 132 mm</td>
			<td>Sencys</td>
			<td>/</td>
			<td>Saw blade to create a window in the eggshell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel insert pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26007-02</td>
			<td>Straight pin to make a hole in the eggshell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steril-Helios&#160;</td>
			<td>Angelantoni Industrie</td>
			<td>ST-00275400000</td>
			<td>Laminar flow hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus bords rod&#233;s 90&#176;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-9483</td>
			<td>Glass slides&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek VIP 6Al</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>60320417-0711 VID6E3-1</td>
			<td>Automatic embedding device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11602-16</td>
			<td>Forceps for eggshell removal and ovarian tissue manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene, pa</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28701364</td>
			<td>Paraffin-embedding solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the chick chorioallantoic membrane (cam) model as a tool to study ovarian tissue transplantation

يعد حفظ أنسجة المبيض بالتبريد وزرعها استراتيجية فعالة للحفاظ على الخصوبة ولكن لها عيبا رئيسيا واحدا ، وهو فقدان البصيلات الهائل الذي يحدث بعد فترة وجيزة من إعادة الزرع بسبب تنشيط الجريب غير الطبيعي والموت. القوارض هي نماذج مرجعية للتحقيق في تنشيط الجريب ، لكن التكلفة والوقت والاعتبارات الأخلاقية أصبحت باهظة بشكل متزايد ، مما يدفع إلى تطوير البدائل. يعد نموذج الغشاء المشيمي المشيمي (CAM) جذابا بشكل خاص ، كونه غير مكلف ويحافظ على نقص المناعة الطبيعي حتى اليوم 17 بعد الإخصاب ، مما يجعله مثاليا لدراسة التطعيم الأجنبي قصير المدى لأنسجة المبيض البشري. كما أن الطب التكميلي والبديل شديد الأوعية الدموية وقد استخدم على نطاق واسع كنموذج لاستكشاف تكوين الأوعية. وهذا يمنحها ميزة ملحوظة على النماذج في المختبر ويسمح بالتحقيق في الآليات التي تؤثر على عملية فقدان الجريب المبكرة بعد التطعيم. يهدف البروتوكول الموضح هنا إلى وصف تطوير نموذج التطعيم بالأشعة السينية للطب التكميلي والبديل لأنسجة المبيض البشري ، مع رؤى محددة حول فعالية التقنية ، والإطار الزمني لإعادة توعية الكسب غير المشروع ، وصلاحية الأنسجة عبر فترة تطعيم مدتها 6 أيام.

معدلات بقاء جنين الفرخ كان معدل بقاء الجنين من النوافذ (اليوم 3 من الضعف الجنسي) إلى تطعيم أنسجة المبيض (اليوم 7 من الضعف الجنسي) 79٪ (33/42). نظرا لأن النسبة المئوية للبيض الجنيني في اليوم 0 غير معروفة ، فقد تم طلب عدد زائد من البيض في اليوم 0 من دجاج ليغورن الأبيض المختار من قبل لومان لض...

Watch this Scientific Journal Video about The Chick Chorioallantoic Membrane CAM Model as a Tool to Study Ovarian Tissue Transplantation at JoVE.com

The Chick Chorioallantoic Membrane CAM Model as a Tool to Study Ovarian Tissue Transplantation

هنا ، نصف بروتوكولا لتطوير نموذج تطعيم الأغشية المشيمية (CAM) لأنسجة المبيض البشرية ونوضح فعالية التقنية ، والإطار الزمني لإعادة التوعي بالكسب غير المشروع ، وصلاحية الأنسجة عبر فترة تطعيم مدتها 6 أيام.

نموذج غشاء المشيمية المشيمية (CAM) كأداة لدراسة زراعة أنسجة المبيض

Ovarian tissue cryopreservation and transplantation is an effective strategy for preserving fertility but has one major drawback, namely massive follicle ...

إن استخدام الطب التكميلي والبديل لمراقبة التغيرات المبكرة بعد زرع أنسجة المبيض له ميزة كبيرة على النماذج في المختبر ، لأنه يسمح بالتحقيق في الآلية التي تؤثر على عملية الأوعية الدموية المبكرة وفقدان الجريب. هذه التقنية غير مكلفة ، ويمكن إجراؤها دون أي خطر من رفض الكسب غير المشروع بسبب نقص المناعة الطبيعي للجنين خلال ال 17 يوما الأولى. علاوة على ذلك ، لا يثير هذا النهج أي مخاوف أخلاقية أو قانونية من حيث القانون الأوروبي.يمكن الوصول إلى أفضل استراتيجية لتطوير المهارات اليدوية اللازمة لمعالجة البيض من خلال التدريب على البويضات غير الجنينية قبل التجربة الفعلية. للبدء ، قم بتسمية اليوم الذي يتم فيه استلام صفر بيض من Louvain فراخ بيضاء مختارة باستخدام علامة. احتضان البيض في حاضنة محددة عند 37 درجة مئوية ، مع توجيه الأطراف المدببة لأسفل.قم بتدوير البيض بمقدار 180 درجة ، مرتين إلى ثلاث مرات يوميا يدويا. في الظلام ، ضع شمعة البيض على قشر البيض وحدد مركز الجيب الهوائي على قشر البيض باستخدام علامة. قم بتشغيل الأضواء وقم بتدوير دبوس مستقيم معقم في الموضع المحدد لعمل فتحة تبلغ حوالي ملليمتر واحد.حدد موقع كيس الصفار في الظلام باستخدام شمعة البيض. ثقب البيضة بإبرة معقمة قياس 19 ، بزاوية 45 درجة باتجاه قاع البويضة ، دون تعطيل كيس الصفار. نضح 1.5 إلى 2 ملليلتر من الألبومين لفصل CAM عن القشرة.ثم أغلق الفتحة بشريط لاصق. قم بتشغيل الأنوار وارسم نافذة مستطيلة بقياس واحد × 1.5 سم على البيضة الموضوعة أفقيا. امسك البيضة بيد واحدة ، وقم بقص نافذة برفق في قشر البيض ، باستخدام شفرة منشار التمرير ، دون تكسير القشرة.انفخ بانتظام لإزالة غبار القشرة والحطام. حرك ملقط معقم تحت قطعة الغلاف المستطيلة ، وقم بإزالته بشكل نظيف دون إتلاف CAM. ثم تخلص من غشاء الغلاف الخارجي الأبيض لرؤية الجنين و CAM.في البويضات الجنينية القابلة للحياة ، يظهر الألبومين الصافي ، وحلقة وعائية حول الجنين ، وأحيانا قلب ينبض ، في اليوم الثالث من تطور جنين الفرخ. تحت غطاء التدفق الصفحي ، ضع البيضة على رف البيض بحيث تكون النافذة متجهة لأعلى وتقشر الشريط. ضع برفق وأزل على الفور شريطا مربعا يبلغ طوله سنتيمترا واحدا من ورق العدسة المعقم المستخرج من الأثير على السطح الظهاري ، لصدمة منطقة صغيرة من CAM.ثم أمسك شريطا قشريا مذابا متجمدا باستخدام ملقط جراحي مجهري ، وضعه على الطب التكميلي والبديل المصاب بالصدمة مع الجانب النخاعي ضد CAM. قم بتقييم الكسب غير المشروع مجهريا ، وانتبه بشكل خاص إلى رد الفعل الوعائي للطب التكميلي والبديل تجاه الكسب غير المشروع قبل التقاط الصور الرقمية أو مقاطع الفيديو. بمجرد الانتهاء من ذلك ، قم بحصاد الكسب غير المشروع عن طريق إمساك الأنسجة أو الطب التكميلي والبديل المحيط بالملقط ، واستئصال الكسب غير المشروع بعناية من الطب التكميلي والبديل باستخدام المقص.كانت الطعوم قابلة للحياة في 100٪ من الحالات بعد اليوم الأول من التطعيم. كانوا بالفعل ملتزمين جزئيا ب CAM ، وأظهروا نمط تحدث العجلة للأوعية الدموية اللازمة لوعائهم. بعد ستة أيام من التطعيم ، تم لصق الغرسات ب CAM.في اليوم الثالث تقريبا بعد الزرع ، تمت تغطية الطعوم بطبقة ثانية من الطب التكميلي والبديل وأصبحت مغلفة. أظهر الكسب غير المشروع توعيا جيدا ، حيث اخترقت 80٪ من عمليات الزرع البويضة. لم يلتصق اثنان من الطعوم بالطب التكميلي والبديل واتخذا مظهرا نخريا ، مما أدى إلى معدل بقاء الأنسجة المطعمة بنسبة 83٪ بعد ستة أيام.في التقييم النسيجي لعملية الزرع ، لوحظت بصيلات صحية في جميع النقاط الزمنية. بعد عملية الزرع ، لوحظ انخفاض ضئيل في كثافة الجريب. تم الحفاظ على معدلات بقاء الجريب خلال فترة التطعيم عند 95٪ في اليوم الأول ، و 83٪ في اليوم السادس.الجزء الأكثر تحديا هو عمل الثقب الصغير المطلوب لاستنشاق الألبومين ، لفصل CAM عن قشر البيض ، قبل إنشاء نافذة تطبيق. يمكن أن يؤدي الضغط المفرط إلى الإفراط في التحفيز ، أو قد يؤدي إلى تكسير البويضة وتدميرها ، مما يتسبب في تلف لا رجعة فيه للطب التكميلي والبديل أو الأوعية الدموية. هذا النموذج مثالي لاختبار العديد من جوانب فترة ما بعد التطعيم المبكرة لأنسجة المبيض ، بما في ذلك تأثير العوامل المؤيدة لتولد الأوعية ، والعوامل المضادة للأكسدة الوقائية ، والسيتوكينات ، والهرمونات ، والعوامل الأخرى التي تتحكم في تنشيط الجريب والنمو المبكر.أشار هذا النموذج إلى العلاقة بين الأوعية الدموية المبكرة وتعديل تنشيط الجريب ، وهما الحدثان الرئيسيان اللذان يؤديان إلى انخفاض احتياطي المبيض بعد زراعة أنسجة المبيض.

Research

JoVE Journal

Biology

The Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Model as a Tool to Study Ovarian Tissue Transplantation

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

اختبار الحساسية البصرية للسرعة واتجاه الحركة في السحالي

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Computer-Generated Animal Model Stimuli

الحاسوب خلق المحفزات الحيوان النموذجي

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Heterotopic and Orthotopic Tracheal Transplantation in Mice used as Models to Study the Development of  Obliterative Airway Disease

زرع القصبة الهوائية ومنتبذ مثلي في الفئران المستخدمة كنماذج لدراسة الأمراض تنمية إيرواي مسد

Obliterative airway disease (OAD) is the major complication after lung transplantations that limits long term survival (1-7).
To study the ...

Chick ex ovo Culture and ex ovo CAM Assay: How it Really Works

Chick ex ovo Culture and ex ovo CAM Assay: How it Really Works

كتكوت البيضة السابقين الثقافة و البيضة السابقين CAM الفحص : كيف يعمل حقا

Chicken eggs in the early phase of breeding are between in vitro and in vivo systems and provide a vascular test environment not only to study ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

نظام لخلايا الظهارية التثقيف صبغات قزحية عدسة لدراسة التجديد في نيوت

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Tracking Morphogenetic Tissue Deformations in the Early Chick Embryo

تتبع التشويهات الأنسجة التخلق في جنين الفرخ المبكر

Embryonic epithelia undergo complex deformations (e.g. bending, twisting, folding, and stretching) to form the primitive organs of the early embryo. ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

باستخدام SecM تسلسل توقيف كأداة لعزل البروتينية منضم ريبوسوم

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

رواية<em&gt; خارج الحي</em&gt; الطريقة الثقافة لالجنينية القلب

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

عزلة الجنينية البطيني الخلايا البطانية

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...