Name: the chick chorioallantoic membrane (cam) model as a tool to study ovarian tissue transplantation
Uploaded: 2023-06-23T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Chick Chorioallantoic Membrane CAM Model as a Tool to Study Ovarian Tissue Transplantation at JoVE.com

저자는 논문의 영어를 검토해 준 Mira Hryniuk, BA에게 감사를 표합니다.

인체 조직의 사용은 루뱅 가톨릭 대학교의 기관 검토 위원회의 승인을 받았습니다. 환자들은 연구 목적으로 난소 조직을 사용하는 것에 대해 서면 동의서를 제출했습니다.
1. 배아 가능성이 높은 0일 계란 주문
<ol><li>주로 병아리의 나이에 따라 달라지는 배아 계란의 비율이 높다고 보고하는 인증된 실험실 등급 Lohman이 선택한 흰색 Leghorn 계란 공급업체를 찾으십...

여기에 설명된 프로토콜에서 가장 어려운 부분은 창을 만들기 전에 달걀 껍질에서 CAM을 분리하기 위해 알부민을 흡인하는 데 필요한 작은 구멍을 만드는 것입니다. 너무 많은 압력을 가하면 과침투가 발생하거나 난자가 깨져 파괴되어 CAM과 혈관 조직에 돌이킬 수 없는 손상을 줄 수 있습니다. CAM을 분리하려는 초기 시도 중에 실수를 최소화하려면 직선 핀을 사용하여 수정되지 않은 식료품 구입 ?...

종양학적 및 양성 적응증과 사회적 이유에 대한 가임력 보존에 대한 요구는 최근 수십 년 동안 급격히 증가했습니다. 그러나 악성질환 및 비악성질환을 치료하기 위해 사용되는 다양한 치료법은 생식선에 독성이 강하여 의인성 조기 난소기능부전을 유발하여 궁극적으로 불임으로 이어질 수 있다1. 가임력 보존을 위한 확립된 기술에는 배아 동결 보존, 미성숙 또는 성숙 난모세포 유리화, 난소 조직 동결 보존이 포함됩니다 2,3,4. 난소 조직 동결은 즉각적인 암 치료가 필요한 사춘기 이전 소녀 또는 여성의 가임력을 보존하기 위해 사용할 수 있는 유일한 옵션입니다. 난소 조직 이식 후 내분비 기능의 회복은 피험자의 95% 이상에서 발생하며, 출생률은 18%에서 42%에 이릅니다5,6,7,8,9.
냉동 해동된 난소 조직의 이식이 성공적인 것으로 입증되었지만 여전히 개선의 여지가 있습니다. 실제로, 난소 피질 조각은 혈관 문합 없이 이식될 때, 이식편 혈관재생술이 일어나는 저산소증 기간을 경험한다 10,11,12. 인간 난소 조직 이식을 조사한 대부분의 연구는 난소 조직을 면역 결핍 마우스에 이식하는 이종 이식 모델을 사용했습니다. 이종이식의 완전한 혈관재생은 약 10일이 소요되며, 숙주 혈관과 이식편 혈관 모두 기능적 혈관 형성에 기여한다 12,13,14. 모낭 예비력의 약 50%-90%는 이식편 혈관재생술이 완료되기 전에 이 저산소 기간 동안 손실됩니다 10,15,16. 이러한 대규모 난포 손실은 이식 후 남는 절대 난포 수의 감소에 의해 입증되는 직접적인 난포 사멸과 모낭 성장 속도 증가에 대한 난포 비율의 변화로 나타나는 원시 난포 성장의 활성화를 통해 발생한다는 것이 강력하게 제안되었습니다17,18.
흥미롭게도, 복막의 전형적인 이식 부위를 모방한 구조를 가진 병아리 융모막(CAM)에 이식된 다양한 동물 난소 조직을 사용한 이전 연구 결과, 원시 난포 예비군이 최대 10일 동안 손상되지 않은 상태로 자연 난포 활성화가 억제되는 것으로 보고되었습니다 19,20,21,22. 우리 팀은 이전에 동결-해동된 인간 난소 조직을 CAM에 이식하는 것이 첫 번째 허혈성 단계에서 인간 난소 조직 이식을 조사하기 위한 신뢰할 수 있는 접근 방식을 구성한다는 것을 입증했으며(23), 최근에는 이 이식 방법이 난포 활성화를 상쇄할 수 있음을 보여주었습니다(24).
CAM 모델은 난자가 생쥐보다 훨씬 저렴할 뿐만 아니라 CAM의 혈관 특성이 높아 난포 활성화와 난소 이식편 혈관 재생술 사이의 연관성을 면밀히 조사할 수 있기 때문에 특히 매력적입니다. 조류 시스템은 실제로 혈관신생을 연구하는 가장 일반적이고 다재다능한 방법 중 하나이다25. 병아리 배아 발달(ED)은 부화까지 21일이 걸리며, CAM은 알란토아와 융모막26의 융합을 통해 처음 4-5일 이내에 형성됩니다. 특히, 병아리 배아는 ED의 17일째까지 자연적으로 면역 결핍 숙주이기 때문에, 이식 거부 반응의 위험 없이 이종이식 실험을 수행할 수 있다27,28. 더욱이, CAM 모델 접근법은 유럽법29 측면에서 윤리적 또는 법적 문제를 제기하지 않기 때문에 다른 동물 모델에 대한 매력적인 대안이 될 수 있습니다. 번식 조건과 관련하여 병아리 배아는 상대 습도가 37%-40%인 60°C로 설정된 인큐베이터만 있으면 됩니다. 이러한 제한된 실험 요구 사항은 면역 결핍 마우스를 사용하는 것에 비해 연구 비용을 크게 줄입니다.
여기에 제시된 프로토콜은 인간 난소 조직에 대한 CAM 이종 이식 모델의 개발을 설명하고 기술의 효과, 이식편 혈관 재생술의 시간 프레임 및 6일 이식 기간 동안의 조직 생존력에 대한 구체적인 통찰력을 제공하는 것을 목표로 합니다. 이 프로토콜은 이식 후 초기 난포 손실의 메커니즘을 조사하고 이 현상에 대한 여러 물질(성장 인자, 호르몬 등)의 영향을 연구하는 데 큰 관심을 가질 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agani hypodermic needle, 19 G</td>
			<td>Terumo Europe</td>
			<td>AN*1950R1</td>
			<td>19 G needle to aspirate albumen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terumo syringe, 5 mL concentric Luer lock</td>
			<td>Terumo Europe</td>
			<td>SS*05LE1</td>
			<td>5-mL sterile syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caseviewer v2.2</td>
			<td>3DHISTECH</td>
			<td></td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether</td>
			<td>Merck Chemicals</td>
			<td>603-022-00-4</td>
			<td>Sterile ether to traumatize the CAM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y aqueous solution 0.5%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1098441000</td>
			<td>Staining solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde 4% aqueous solution buffered (Formalin 10%)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97139010</td>
			<td>Formaldehyde used for tissue fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fridge</td>
			<td>Liebherr</td>
			<td>7081260</td>
			<td>Fridge at 4 &#176;C used for paraffin-embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating plate</td>
			<td>Schott</td>
			<td>SLK2</td>
			<td>Hot plate used to dry the slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Forma Scientific 3111</td>
			<td>10365156</td>
			<td>Oven used for slide incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica CLS 150 XE microscope cold light source</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CLS 150 XE</td>
			<td>Focal cold light source to candle the eggs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens cleaning tissue, grade 541</td>
			<td>VWR</td>
			<td>111-5003</td>
			<td>Tissue to soak in sterile ether to traumatize the CAM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayer&#39;s hematoxylin</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1092491000</td>
			<td>Staining solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20847307</td>
			<td>Methanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>ThermoScientific-MICROM</td>
			<td>HM325-2</td>
			<td>Microtome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pannoramic P250 Flash III</td>
			<td>3DHISTECH</td>
			<td>/</td>
			<td>Slide scanner at 20x magnification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1,04,00,51,000</td>
			<td>Paraffin-embedding solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraplast Plus R</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3683-1KG</td>
			<td>Paraffin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 60x15 mm, sterile</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>628161</td>
			<td>Sterile petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pin holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26016-12</td>
			<td>Pin holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyhatch</td>
			<td>Brinsea</td>
			<td>CP01F</td>
			<td>Egg incubator with automatic rotator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scroll saw blade, 132 mm</td>
			<td>Sencys</td>
			<td>/</td>
			<td>Saw blade to create a window in the eggshell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel insert pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26007-02</td>
			<td>Straight pin to make a hole in the eggshell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steril-Helios&#160;</td>
			<td>Angelantoni Industrie</td>
			<td>ST-00275400000</td>
			<td>Laminar flow hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus bords rod&#233;s 90&#176;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-9483</td>
			<td>Glass slides&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek VIP 6Al</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>60320417-0711 VID6E3-1</td>
			<td>Automatic embedding device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11602-16</td>
			<td>Forceps for eggshell removal and ovarian tissue manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene, pa</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28701364</td>
			<td>Paraffin-embedding solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the chick chorioallantoic membrane (cam) model as a tool to study ovarian tissue transplantation

난소 조직 동결 보존 및 이식은 가임력을 보존하는 효과적인 전략이지만 비정상적인 난포 활성화 및 사망으로 인해 재착상 직후 발생하는 대규모 난포 손실이라는 한 가지 주요 단점이 있습니다. 설치류는 난포 활성화를 조사하기 위한 벤치마크 모델이지만 비용, 시간 및 윤리적 고려 사항이 점점 더 엄격해지고 있으므로 대안 개발을 주도하고 있습니다. 병아리 융모막 형성막(CAM) 모델은 특히 매력적이며, 저렴하고 수정 후 17일까지 자연 면역 결핍을 유지하므로 인간 난소 조직의 단기 이종 이식을 연구하는 데 이상적입니다. CAM은 또한 혈관이 매우 풍부하며 혈관 신생을 탐구하기 위한 모델로 널리 사용되었습니다. 이것은 in vitro 모델에 비해 놀라운 이점을 제공하며 초기 이식 후 난포 손실 과정에 영향을 미치는 메커니즘을 조사할 수 있습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 기술의 효과, 이식편 혈관 재생술 기간 및 6일 이식 기간 동안의 조직 생존력에 대한 구체적인 통찰력과 함께 인간 난소 조직을 위한 CAM 이종 이식 모델의 개발을 설명하는 것을 목표로 합니다.

병아리 배아 생존율 창구(발기부전 3일차)부터 난소 조직 이식(발기부전 7일차)까지의 배아 생존율은 79%(33/42)였다. 배아 0일 달걀의 비율은 알려져 있지 않기 때문에, 이식에 충분한 배아 달걀을 확보하기 위해 로먼이 선택한 흰 레그혼 닭의 0일 달걀을 과도하게 주문했습니다. 총 23개의 생존 가능한 7일차 난자가 이식에 사용되었으며, 그 중 하나는 처음 24시간 동안 죽었고, 그 결과 ...

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The Chick Chorioallantoic Membrane CAM Model as a Tool to Study Ovarian Tissue Transplantation

여기에서는 인간 난소 조직을 위한 병아리 융모막 이식(CAM) 이종 이식 모델을 개발하기 위한 프로토콜을 설명하고 기술의 효과, 이식편 혈관 재생술 기간 및 6일 이식 기간 동안 조직 생존력을 입증합니다.

난소 조직 이식을 연구하기 위한 도구로서의 병아리 맥락막 막(CAM) 모델

Ovarian tissue cryopreservation and transplantation is an effective strategy for preserving fertility but has one major drawback, namely massive follicle ...

난소 조직 이식 후 초기 변화를 관찰하기 위해 CAM을 사용하면 초기 혈관 형성 및 난포 손실 과정에 영향을 미치는 메커니즘을 조사할 수 있기 때문에 체외 모델에 비해 상당한 이점이 있습니다. 이 기술은 비용이 저렴하며, 처음 17일 동안은 자연 배아 면역 결핍으로 인한 이식 거부 반응의 위험 없이 수행할 수 있습니다. 더욱이, 이 접근법은 유럽법 측면에서 윤리적 또는 법적 문제를 제기하지 않습니다.난자 조작에 필요한 수동 기술을 개발하기 위한 최선의 전략은 실제 실험 전에 배아가 아닌 난자로 훈련함으로써 도달할 수 있습니다. 먼저, 루뱅(Louvain)에서 엄선한 흰다리뿔 병아리로부터 받은 달걀 0개에 마커를 사용하여 라벨을 붙입니다. 뾰족한 끝이 아래를 향하도록 섭씨 37도로 설정된 인큐베이터에서 알을 품습니다.달걀을 180도 회전시키며, 하루에 2-3회 수작업으로 돌린다. 어둠 속에서 달걀 껍질에 달걀 캔들러를 놓고 마커를 사용하여 달걀 껍질의 에어 포켓 중앙을 정확히 가리킵니다. 조명을 켜고 표시된 위치에서 멸균 직선 핀을 돌려 약 1mm의 구멍을 만듭니다.달걀 촛대를 사용하여 어둠 속에서 노른자 자루를 찾으십시오. 노른자 자루를 방해하지 않고 달걀 바닥을 향해 45도 각도로 멸균된 19게이지 바늘로 달걀에 구멍을 뚫습니다. 1.5-2밀리리터의 알부민을 흡인하여 CAM을 쉘에서 분리합니다.그런 다음 접착 테이프로 구멍을 막습니다. 조명을 켜고 수평으로 놓인 달걀에 1x1.5cm 크기의 직사각형 창을 그립니다. 달걀을 한 손으로 잡고 껍질을 깨지 않고 스크롤 톱날을 사용하여 달걀 껍질에 창을 부드럽게 자릅니다.정기적으로 바람을 불어 껍질 먼지와 부스러기를 제거하십시오. 멸균 집게를 직사각형 쉘 조각 아래로 밀어 넣고 CAM을 손상시키지 않고 깨끗하게 제거합니다. 그런 다음 흰색 외피막을 버리고 배아와 CAM을 확인합니다.생존 가능한 배아 난자에서는 투명한 알부민, 배아 주위의 혈관 고리, 때로는 박동하는 심장이 병아리 배아 발달 3일째에 관찰됩니다. 층류 후드 아래에서 창이 위를 향하도록 계란 선반에 계란을 놓고 테이프를 떼어냅니다. 멸균 에테르 추출 렌즈 종이의 1cm 정사각형 스트립을 상피 표면에 부드럽게 놓고 즉시 제거하여 CAM의 작은 영역에 외상을 입힙니다.그런 다음 미세 수술 겸자로 얼어붙은 해동된 난소 피질 스트립 하나를 잡고 수질이 CAM에 닿도록 외상을 입은 CAM에 놓습니다. 이식편을 거시적으로 평가하고 디지털 사진이나 비디오를 캡처하기 전에 이식편에 대한 CAM의 혈관 반응에 특히 주의를 기울이십시오. 작업이 끝나면 집게로 조직이나 주변 CAM을 잡고 가위를 사용하여 CAM에서 이식편을 조심스럽게 절제하여 이식편을 수확합니다.이식편은 이식 첫날 이후 100%의 사례에서 생존할 수 있었습니다. 그들은 이미 CAM에 부분적으로 부착되어 있었고 혈관화에 필요한 혈관의 바퀴 스포크 패턴을 보여주었습니다. 이식 6일 후, 임플란트는 CAM에 부착되었습니다.이식 후 3일째 되는 날쯤, 이식편은 CAM의 두 번째 층으로 덮여 캡슐화되었습니다. 이식편은 양호한 혈관 형성을 보였으며 이식의 80%가 난자를 관통했습니다. 두 개의 이식편이 CAM에 부착되지 않고 괴사한 모양으로 나타났으며, 그 결과 6일 후 이식된 조직 생존율이 83%에 달했습니다.이식의 조직학적 평가에서 모든 시점에서 건강한 모낭이 관찰되었습니다. 이식 후 난포 밀도에서 미미한 감소가 관찰되었습니다. 이식 기간 동안 모낭 생존율은 1일째 95%, 6일째 83%로 유지되었습니다.가장 어려운 부분은 창을 만들기 전에 알부민을 흡인하고 달걀 껍질에서 CAM을 분리하는 데 필요한 작은 구멍을 만드는 것입니다. 너무 많은 압력을 가하면 과도한 자극이 발생하거나 난자가 깨져 파괴되어 CAM 또는 혈관 조직에 돌이킬 수 없는 손상을 줄 수 있습니다. 이 모델은 혈관 신생 유발 인자, 보호 항산화제, 사이토카인, 호르몬 및 난포 활성화 및 조기 성장을 제어하는 기타 인자의 영향을 포함하여 이식 후 초기 난소 조직의 여러 측면을 테스트하는 데 이상적입니다.이 모델은 난소 조직 이식 후 난소 예비력 감소를 초래하는 두 가지 주요 사건인 초기 혈관 형성과 난포 활성화 조절 사이의 연관성을 나타냅니다.

Research

JoVE Journal

Biology

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