Name: the chick chorioallantoic membrane (cam) model as a tool to study ovarian tissue transplantation
Uploaded: 2023-06-23T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Chick Chorioallantoic Membrane CAM Model as a Tool to Study Ovarian Tissue Transplantation at JoVE.com

Los autores agradecen a Mira Hryniuk, BA, por revisar el idioma inglés del artículo.

El uso de tejido humano fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad Católica de Lovaina. Las pacientes dieron su consentimiento informado por escrito para el uso de su tejido ovárico con fines de investigación.
1. Pedir óvulos del día 0 que tienen una alta probabilidad de estar embrionados
<ol><li>Encuentre un proveedor certificado de huevos blancos de Leghorn seleccionados por Lohman de grado de laboratorio que informe altas tasas de huevos e...

La parte más desafiante del protocolo descrito aquí es hacer el pequeño orificio necesario para aspirar la albúmina con el fin de separar el CAM de la cáscara del huevo antes de crear una ventana. La aplicación de demasiada presión puede provocar una sobrepenetración o incluso puede agrietar y destruir el óvulo, causando daños irrevocables a la CAM y su vasculatura. Para mantener los errores al mínimo durante los intentos iniciales de separar el CAM, se recomienda encarecidamente practicar haciendo pequeños a...

La demanda de preservación de la fertilidad por indicaciones oncológicas y benignas, así como por razones sociales, ha aumentado drásticamente en las últimas décadas. Sin embargo, varios tratamientos utilizados para curar enfermedades malignas y no malignas son altamente tóxicos para las gónadas y pueden resultar en insuficiencia ovárica prematura iatrogénica, lo que en última instancia conduce a la infertilidad1. Las técnicas establecidas para la preservación de la fertilidad incluyen la criopreservación de embriones, la vitrificación de ovocitos inmaduros o maduros y la criopreservación de tejido ovárico 2,3,4. La congelación de tejido ovárico es la única opción disponible para preservar la fertilidad en niñas o mujeres prepúberes que requieren tratamiento inmediato contra el cáncer. La restauración de la función endocrina tras el trasplante de tejido ovárico se produce en más del 95% de los sujetos, con tasas de nacidos vivos que oscilan entre el 18% y el 42%5,6,7,8,9.
Aunque el trasplante de tejido ovárico congelado-descongelado ha demostrado ser exitoso, todavía hay margen de mejora. De hecho, como los fragmentos corticales ováricos son trasplantados sin anastomosis vascular, experimentan un período de hipoxia durante el cual se produce la revascularización del injerto 10,11,12. La gran mayoría de los estudios que investigan el trasplante de tejido ovárico humano han utilizado un modelo de xenoinjerto, en el que el tejido ovárico se trasplanta a ratones inmunodeficientes. La revascularización completa de los xenoinjertos tarda alrededor de 10 días, y tanto el huésped como los vasos del injerto contribuyen a la formación de vasos funcionales 12,13,14. Alrededor del 50-90% de la reserva folicular se pierde durante esta ventana hipóxica antes de la finalización de la revascularización del injerto 10,15,16. Se ha sugerido fuertemente que esta pérdida masiva de folículos ocurre tanto a través de la muerte directa del folículo, como lo demuestra una disminución en el número absoluto de folículos que quedan después del injerto, como la activación del crecimiento del folículo primordial, como lo indican los cambios en las proporciones de los folículos hacia mayores tasas de crecimiento de folículos17,18.
Curiosamente, trabajos de investigación anteriores que utilizaron varios tejidos ováricos animales injertados en la membrana corioalantoidea de pollo (CAM), que tiene una constitución que imita el sitio de injerto típico del peritoneo, han reportado la inhibición de la activación espontánea del folículo, con la reserva folicular primordial que permanece intacta hasta por 10 días 19,20,21,22. Nuestro equipo demostró previamente que el injerto de tejido ovárico humano congelado-descongelado a MCA constituía un enfoque fiable para investigar el trasplante de tejido ovárico humano en sus primeros estadios isquémicos23 y recientemente demostró que este método de injerto era capaz de contrarrestar la activación del folículo24.
El modelo CAM es especialmente atractivo no solo porque los óvulos son mucho más baratos que los ratones, sino también por la naturaleza altamente vascularizada de la CAM, lo que permite examinar la asociación entre la activación del folículo y la revascularización del injerto ovárico. El sistema aviar es, de hecho, una de las formas más comunes y versátiles de estudiar la angiogénesis25. El desarrollo embrionario de pollito (DE) tarda 21 días hasta la eclosión, y la CAM se forma dentro de los primeros 4-5 días a través de la fusión del alantois y el corion26. Cabe destacar que el embrión de pollo es un huésped naturalmente inmunodeficiente hasta el día 17 de la disfunción eréctil, por lo que se pueden realizar experimentos de xenoinjerto sin ningún riesgo de rechazo del injerto27,28. Además, el enfoque del modelo CAM no plantea ninguna preocupación ética o legal en términos de la legislación europea29, lo que lo convierte en una alternativa atractiva a otros modelos animales. Con respecto a las condiciones de cría, los embriones de pollo solo necesitan una incubadora ajustada a 37 °C con una humedad relativa del aire del 40%-60%. Estos requisitos limitados de experimentación reducen significativamente los costos de investigación en comparación con el uso de ratones inmunodeficientes.
El protocolo presentado en este documento tiene como objetivo describir el desarrollo de un modelo de xenoinjerto CAM para tejido ovárico humano y proporcionar información específica sobre la efectividad de la técnica, el marco temporal de revascularización del injerto y la viabilidad del tejido durante un período de injerto de 6 días. Este protocolo podría ser de gran interés para investigar los mecanismos que subyacen a la pérdida temprana de folículos post-injerto y estudiar el impacto de varios agentes (factores de crecimiento, hormonas, etc.) en este fenómeno.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agani hypodermic needle, 19 G</td>
			<td>Terumo Europe</td>
			<td>AN*1950R1</td>
			<td>19 G needle to aspirate albumen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terumo syringe, 5 mL concentric Luer lock</td>
			<td>Terumo Europe</td>
			<td>SS*05LE1</td>
			<td>5-mL sterile syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caseviewer v2.2</td>
			<td>3DHISTECH</td>
			<td></td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether</td>
			<td>Merck Chemicals</td>
			<td>603-022-00-4</td>
			<td>Sterile ether to traumatize the CAM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y aqueous solution 0.5%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1098441000</td>
			<td>Staining solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde 4% aqueous solution buffered (Formalin 10%)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97139010</td>
			<td>Formaldehyde used for tissue fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fridge</td>
			<td>Liebherr</td>
			<td>7081260</td>
			<td>Fridge at 4 &#176;C used for paraffin-embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating plate</td>
			<td>Schott</td>
			<td>SLK2</td>
			<td>Hot plate used to dry the slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Forma Scientific 3111</td>
			<td>10365156</td>
			<td>Oven used for slide incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica CLS 150 XE microscope cold light source</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CLS 150 XE</td>
			<td>Focal cold light source to candle the eggs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens cleaning tissue, grade 541</td>
			<td>VWR</td>
			<td>111-5003</td>
			<td>Tissue to soak in sterile ether to traumatize the CAM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayer&#39;s hematoxylin</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1092491000</td>
			<td>Staining solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20847307</td>
			<td>Methanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>ThermoScientific-MICROM</td>
			<td>HM325-2</td>
			<td>Microtome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pannoramic P250 Flash III</td>
			<td>3DHISTECH</td>
			<td>/</td>
			<td>Slide scanner at 20x magnification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1,04,00,51,000</td>
			<td>Paraffin-embedding solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraplast Plus R</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3683-1KG</td>
			<td>Paraffin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 60x15 mm, sterile</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>628161</td>
			<td>Sterile petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pin holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26016-12</td>
			<td>Pin holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyhatch</td>
			<td>Brinsea</td>
			<td>CP01F</td>
			<td>Egg incubator with automatic rotator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scroll saw blade, 132 mm</td>
			<td>Sencys</td>
			<td>/</td>
			<td>Saw blade to create a window in the eggshell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel insert pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26007-02</td>
			<td>Straight pin to make a hole in the eggshell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steril-Helios&#160;</td>
			<td>Angelantoni Industrie</td>
			<td>ST-00275400000</td>
			<td>Laminar flow hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus bords rod&#233;s 90&#176;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-9483</td>
			<td>Glass slides&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek VIP 6Al</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>60320417-0711 VID6E3-1</td>
			<td>Automatic embedding device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11602-16</td>
			<td>Forceps for eggshell removal and ovarian tissue manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene, pa</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28701364</td>
			<td>Paraffin-embedding solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the chick chorioallantoic membrane (cam) model as a tool to study ovarian tissue transplantation

La criopreservación y el trasplante de tejido ovárico es una estrategia eficaz para preservar la fertilidad, pero tiene un inconveniente importante, a saber, la pérdida masiva de folículos que se produce poco después de la reimplantación debido a la activación anormal del folículo y la muerte. Los roedores son modelos de referencia para investigar la activación de los folículos, pero el costo, el tiempo y las consideraciones éticas son cada vez más prohibitivas, lo que impulsa el desarrollo de alternativas. El modelo de membrana corioalantoidea (CAM) de pollo es particularmente atractivo, ya que es económico y mantiene la inmunodeficiencia natural hasta el día 17 después de la fertilización, lo que lo hace ideal para estudiar el xenoinjerto a corto plazo de tejido ovárico humano. La MCA también está altamente vascularizada y se ha utilizado ampliamente como modelo para explorar la angiogénesis. Esto le da una ventaja notable sobre los modelos in vitro y permite la investigación de los mecanismos que afectan el proceso temprano de pérdida de folículos posterior al injerto. El protocolo descrito en este documento tiene como objetivo describir el desarrollo de un modelo de xenoinjerto CAM para tejido ovárico humano, con información específica sobre la efectividad de la técnica, el marco de tiempo de revascularización del injerto y la viabilidad del tejido durante un período de injerto de 6 días.

Tasas de supervivencia de embriones de pollo La tasa de supervivencia embrionaria desde la ventana (día 3 de la DE) hasta el injerto de tejido ovárico (día 7 de la DE) fue del 79% (33/42). Dado que se desconoce el porcentaje de huevos embrionados del día 0, se ordenaron huevos supernumerarios del día 0 de gallinas blancas de Livorno seleccionadas por Lohman para garantizar que hubiera suficientes huevos embrionados disponibles para el injerto. Se utilizaron un total de 23 óvulos viables de día ...

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The Chick Chorioallantoic Membrane CAM Model as a Tool to Study Ovarian Tissue Transplantation

Aquí, describimos un protocolo para desarrollar un modelo de xenoinjerto de membrana corioalantoidea (CAM) de pollo para tejido ovárico humano y demostramos la efectividad de la técnica, el marco de tiempo de revascularización del injerto y la viabilidad del tejido durante un período de injerto de 6 días.

El modelo de membrana corioalantoidea de pollo (CAM) como herramienta para estudiar el trasplante de tejido ovárico

Ovarian tissue cryopreservation and transplantation is an effective strategy for preserving fertility but has one major drawback, namely massive follicle ...

El uso de la MCA para observar cambios tempranos después del trasplante de tejido ovárico tiene una ventaja significativa sobre los modelos in vitro, ya que permite investigar los mecanismos que afectan el proceso de vascularización temprana y pérdida de folículos. Esta técnica es económica y se puede realizar sin riesgo de rechazo del injerto debido a la inmunodeficiencia embrionaria natural durante los primeros 17 días. Además, este enfoque no plantea ninguna preocupación ética o jurídica en términos de la legislación europea.La mejor estrategia para desarrollar las habilidades manuales necesarias para la manipulación de huevos puede alcanzarse mediante el entrenamiento con óvulos no embrionados antes del experimento real. Para comenzar, etiquete los huevos del día cero recibidos de pollitos de leghorn blanco seleccionados de Lovaina con un marcador. Incuba los huevos en una incubadora a 37 grados centígrados, con los extremos puntiagudos hacia abajo.Gire los huevos 180 grados, dos o tres veces al día manualmente. En la oscuridad, coloque un candelabro de huevos contra la cáscara del huevo y señale el centro de la bolsa de aire en la cáscara del huevo con un marcador. Encienda las luces y gire un pasador recto estéril en la posición marcada para hacer una abertura de alrededor de un milímetro.Localiza el saco vitelino en la oscuridad con el vela de huevos. Perfore el huevo con una aguja estéril de calibre 19, en un ángulo de 45 grados hacia el fondo del huevo, sin alterar el saco vitelino. Aspire de 1,5 a dos mililitros de albúmina para separar el CAM de la cáscara.A continuación, cierre el agujero con cinta adhesiva. Enciende las luces y dibuja una ventana rectangular de uno por 1,5 centímetros en el huevo colocado horizontalmente. Sostenga el huevo con una mano y corte suavemente una ventana en la cáscara del huevo, con una hoja de sierra de marquetería, sin romper la cáscara.Sople regularmente para eliminar el polvo y los escombros de la concha. Deslice las pinzas estériles debajo de la pieza rectangular de la carcasa y retírela limpiamente sin dañar el CAM. A continuación, deseche la membrana blanca de la capa externa para ver el embrión y la MCA.En los óvulos embrionados viables, la albúmina clara, un anillo vascular alrededor del embrión y, a veces, un corazón latiendo, se observan en el tercer día del desarrollo del embrión de pollo. Debajo de la campana de flujo laminar, coloque el huevo en la rejilla para huevos con la ventana hacia arriba y retire la cinta. Coloque suavemente y retire inmediatamente una tira cuadrada de un centímetro de papel estéril para lentes extraído con éter sobre la superficie epitelial, para traumatizar una pequeña área de la MCA.A continuación, agarre una tira cortical ovárica descongelada congelada con pinzas microquirúrgicas y colóquela sobre la MCA traumatizada con el lado medular contra la MCA. Evalúe el injerto macroscópicamente y preste especial atención a la reacción vascular de la MCA hacia el injerto antes de capturar fotografías o videos digitales. Una vez hecho esto, extraiga el injerto agarrando el tejido o el CAM circundante con fórceps y extirpando cuidadosamente el injerto del CAM con unas tijeras.Los injertos fueron viables en el 100% de los casos después del primer día del injerto. Ya estaban parcialmente adheridos a la MCA y mostraban el patrón de radios de rueda de los vasos sanguíneos necesarios para su vascularización. Después de seis días de injerto, los implantes se adhirieron a la CAM.Alrededor del tercer día después del trasplante, los injertos se cubrieron con una segunda capa de CAM y se encapsularon. El injerto mostró una buena vascularización, con un 80% de los trasplantes penetrando en el óvulo. Dos injertos no se adhirieron a la MCA y adquirieron un aspecto necrótico, lo que resultó en una tasa de supervivencia del tejido injertado del 83% después de seis días.En la evaluación histológica del trasplante se observaron folículos sanos en todos los puntos temporales. Después del trasplante, se observó una disminución insignificante en las densidades de los folículos. Las tasas de supervivencia de los folículos se mantuvieron durante el período de injerto en un 95% el primer día y un 83% en el sexto día.La parte más desafiante es hacer el pequeño orificio necesario para aspirar la albúmina, para separar el CAM de la cáscara del huevo, antes de crear una ventana de aplicación. Demasiada presión puede dar lugar a una sobreestimulación, o incluso puede agrietar y destruir el óvulo, causando daños irrevocables a la MCA o a su vasculatura. Este modelo es ideal para probar varios aspectos del período posterior al injerto temprano de tejido ovárico, incluido el impacto de los factores proangiogénicos, los agentes antioxidantes protectores, las citocinas, las hormonas y otros factores que controlan la activación del folículo y el crecimiento temprano.Este modelo indicó la relación entre la vascularización temprana y la modulación de la activación del folículo, que son los dos eventos principales que resultan en la disminución de la reserva ovárica después del trasplante de tejido ovárico.

Research

JoVE Journal

Biology

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