Name: determination of vaccine immunogenicity using bovine monocyte-derived dendritic cells
Uploaded: 2023-05-19T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells at JoVE.com

ونشكر الدكتورة إيفلين ووداك والدكتورة أنجيليكا لويستش (AGES) على دعمهما في تحديد الحالة الصحية للحيوانات وعلى توفير لقاح BTV، والدكتور برنارد رينيلت على توفير دم الأبقار، والدكتور بهاراني سيتيبالي والدكتور ويليام دندون من الوكالة على المشورة المفيدة بشأن تجارب تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي وتحرير اللغة، على التوالي.

يتم جمع الدم من قبل خدمة بيطرية معتمدة وفقا للمبادئ التوجيهية الأخلاقية للوكالة النمساوية للصحة وسلامة الأغذية (AGES) وبما يتوافق مع معايير رعاية الحيوان المقبولة32. حصلت الدراسة على موافقة أخلاقية من وزارة الزراعة النمساوية. يوضح الشكل 1 التصميم التجريبي لتولي...

توضح هذه الدراسة طريقة موحدة في المختبر لتوليد وتنميط MoDCs البقري واستخدامها لاحقا في قياس مناعة اللقاح للقاح تجاري (على سبيل المثال ، RV). يمكن استخدام MoDCs البقرية كأداة لفحص مستضدات اللقاح المحتملة ضد أمراض الماشية والتنبؤ بتأثيرها السريري المحتمل بناء على الاستجابات المناعية قبل ال?...

يمثل التطعيم البيطري جانبا حاسما من جوانب تربية الحيوانات وصحتها ، حيث يساهم في تحسين الأمن الغذائي ورعاية الحيوان من خلال توفير الحماية ضد الأمراض التي تؤثر على قطاع الثروة الحيوانية على مستوىالعالم 1. ومن شأن وجود طريقة فعالة في المختبر لتقييم استمناع اللقاحات المرشحة المحتملة أن يساعد في تسريع عملية تطوير اللقاح وإنتاجه. لذلك ، من الضروري توسيع مجال المقايسات المناعية بمنهجيات مبتكرة تستند إلى الدراسات المختبرية ، لأن هذا من شأنه أن يساعد في الكشف عن تعقيد العمليات المناعية المتعلقة بالتحصين والعدوى الممرضة. وفي الوقت الراهن، تستخدم دراسات التمنيع والتحدي في الحيوانات في الجسم الحي ، التي تتطلب أخذ عينات دورية (مثل الدم والطحال)، لقياس استمناع اللقاحات المرشحة والمواد المساعدة. هذه المقايسات باهظة الثمن وتستغرق وقتا طويلا ولها آثار أخلاقية ، لأنه في معظم الحالات ، يتم تنفيذ القتل الرحيم للحيوانات بنهاية التجارب.
كبديل للمقايسات في الجسم الحي ، تم استخدام خلايا الدم أحادية النواة المحيطية (PBMCs) لتقييم الاستجابات المناعية التي يسببها اللقاح في المختبر2. PBMCs هي مجموعة غير متجانسة من الخلايا تتكون من 70٪ -90٪ خلايا ليمفاوية ، 10٪ -20٪ وحيدات ، وعدد محدود من الخلايا المتغصنة (DCs ، 1٪ -2٪) 3. تؤوي PBMCs خلايا مقدمة للمستضد (APCs) مثل الخلايا البائية ، والوحيدات ، و DCs ، والتي تقوم باستمرار بدوريات في الكائن الحي بحثا عن علامات العدوى أو تلف الأنسجة. تسهل الكيموكينات المفرزة محليا تجنيد وتفعيل ناقلات الجنود المدرعة في هذه المواقع عن طريق الارتباط بمستقبلات سطح الخلية. في حالة الوحيدات ، توجه chemokines مصيرها إما للتمايز إلى DCs أو الضامة4. بمجرد أن تواجه DCs مسببات الأمراض وتلتقطها ، فإنها تهاجر إلى الأعضاء اللمفاوية الثانوية ، حيث يمكنها تقديم مستضدات الببتيد الممرض المعالجة باستخدام البروتينات السطحية من الفئة الأولى أو الفئة الثانية من معقد التوافق النسيجي الرئيسي (MHC) إلى خلايا CD8 + T أو خلايا CD4 + T ، على التوالي ، مما يؤدي إلى استجابة مناعية 5,6.
إن الدور الرئيسي الذي تلعبه البلدان النامية في تنظيم استجابة مناعية وقائية ضد مسببات الأمراض المختلفة يجعلها هدفا بحثيا مثيرا للاهتمام لفهم آليات المناعة داخل الخلايا ، خاصة عند تصميم اللقاحات والمواد المساعدة ضد العوامل المعدية7. نظرا لأن جزء DCs الذي يمكن الحصول عليه من PBMCs صغير نوعا ما (1٪ -2٪) ، فقد تم استخدام الخلايا الوحيدة بدلا من ذلك لتوليد DCs في المختبر8. تم تطوير هذه الخلايا الأحادية المشتقة من الخلايا الأحادية (MoDCs) في البداية كاستراتيجية علاج محتملة في العلاج المناعي للسرطان9. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام MoDCs لأبحاث اللقاحات10،11،12 ، والوحيدات الكلاسيكية هي النوع الفرعي السائد (89٪) لإنتاج MoDC 13. تم تحقيق إنتاج MoDCs في المختبر سابقا من خلال إضافة عامل تحفيز مستعمرة الخلايا المحببة والبلاعم (GM-CSF) المعطى بالاشتراك مع السيتوكينات الأخرى مثل إنترلوكين -4 (IL-4) ، عامل نخر الورم α (TNF-α) ، أو IL-1314،15،16.
يعتمد نجاح مقايسة MoDC في المختبر على قدرة MoDCs الناضجة المحفزة بالمستضد على تعديل مدى ونوع الاستجابة المناعية الخاصة بنوع المستضد المكتشف17. يحدد نوع العامل الممرض الذي تتعرف عليه وتقدمه MoDCs تمايز الخلايا المساعدة CD4 + T (Th) إلى خلايا مستجيبة Th1 أو Th2 أو Th17 وتتميز بملف تعريف السيتوكين الإفرازي الخاص بمسببات الأمراض. يتم استنباط استجابة Th1 ضد مسببات الأمراض داخل الخلايا وتؤدي إلى إفراز إنترفيرون جاما (IFN-γ) وعامل نخر الورم بيتا (TNF-β) ، الذي يعدل الحماية المعتمدة على البلعمة. يتم تشغيل استجابة Th2 ضد الكائنات الطفيلية وتتميز بإفراز IL-4 و IL-5 و IL-10 و IL-13 ، والذي يبدأ الحماية الخلطية المستقلة عن البلعمة. يوفر Th17 حماية تعتمد على العدلات ضد الالتهابات البكتيرية والفطرية خارج الخلية بوساطة إفراز IL-17 و IL-17F و IL-6 و IL-22 و TNF-α18،19،20،21. بناء على الدراسات السابقة ، لوحظ أنه لا تقع جميع مسببات الأمراض ضمن ملف السيتوكين المتوقع. على سبيل المثال ، تحفز MoDCs الجلدية ، استجابة للعدوى الطفيلية الليشمانيا ، إفراز IFN-γ من الخلايا التائية CD4 + وخلايا CD8 + T ، مما يؤدي إلى استجابة Th1 وقائية للالتهابات22.
وقد تبين أيضا أنه في الدجاج MoDCs المحضرة بسكريد السالمونيلا الشحمي (LPS) ، يمكن أن تحفز استجابة متغيرة ضد السالمونيلا التيفية عن طريق تنشيط كل من استجابات Th1 و Th2 ، في حين أن السالمونيلا جاليناروم تحفز استجابة Th2 وحدها ، مما قد يفسر المقاومة العالية للأخيرة تجاه إزالة MoDC23. كما تم الإبلاغ عن تنشيط MoDCs ضد البروسيلا كانيس (B. canis) في كل من الكلاب و MoDCs البشرية ، مما يعني أن هذا يمكن أن يمثل آلية عدوى حيوانية المنشأ24. تحفز MoDCs البشرية المحضرة ب B. canis استجابة Th1 قوية تمنح مقاومة للعدوى الشديدة ، في حين أن MoDCs الكلاب تحفز استجابة Th17 المهيمنة مع استجابة Th1 منخفضة ، مما يؤدي لاحقا إلى إنشاء عدوى مزمنة25. تظهر MoDCs البقرية تقاربا معززا لفيروس مرض الحمى القلاعية (FMDV) المترافق مع الغلوبولين المناعي G (IgG) مقارنة ب FMDV غير المقترن وحده ، حيث تشكل MoDCs معقدا للأجسام المضادة الفيروسية استجابة ل10 السابقة. تظهر هذه الدراسات مجتمعة كيف تم استخدام MoDCs لتحليل تعقيد الاستجابات المناعية أثناء عدوى مسببات الأمراض. يمكن تقييم الاستجابات المناعية التكيفية عن طريق القياس الكمي لعلامات محددة مرتبطة بتكاثر الخلايا الليمفاوية. يعتبر Ki-67 ، وهو بروتين داخل الخلايا يتم اكتشافه فقط في الخلايا المنقسمة ، علامة موثوقة لدراسات الانتشار26 ، وبالمثل ، فإن CD25 المعبر عنه على سطح الخلايا التائية خلال المرحلة المتأخرة من التنشيط يتوافق مع انتشار الخلايا الليمفاوية27,28.
توضح هذه الدراسة طريقة موحدة لتوليد MoDCs في الماشية في المختبر متبوعة بتطبيقها في اختبار مناعي في المختبر يستخدم لاختبار مناعة اللقاحات. تم استخدام لقاح داء الكلب المتاح تجاريا (RV) للتحقق من فعالية هذا الفحص. تم قياس تنشيط الخلايا اللمفاوية التائية وانتشارها عن طريق قياس التدفق الخلوي ، وتفاعل البلمرة المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي (qPCR) ، ومقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) من خلال تحليل علامات تنشيط الخلايا الراسخة مثل Ki-67 و CD25 وإفراز IFN-γ28،29،30،31. لا يتم إجراء أي تجارب تجريبية على الحيوانات أو البشر أثناء فحص MoDC.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher</td>
			<td>A1049201</td>
			<td>Ammonium-Chloride-Potassium buffer for lysis of residual RBCs in harvested PBMC Fraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Heparin Tubes</td>
			<td>Becton, Dickinson (BD) and Company</td>
			<td>366480</td>
			<td>10 mL, additive sodium heparin 158 USP units, glass tube, 16 x 100 mm size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Dendritic Cell Growth Kit</td>
			<td>Bio-Rad, UK</td>
			<td>PBP015KZZ</td>
			<td>Cytokine cocktail composed of recombinant bovine IL-4 and GM-CSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine IFN-&#947; ELISA Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA5638KZZ</td>
			<td>Kit use for measuring IFN-&#947; expression in culture supernatant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA2678F</td>
			<td>Mouse anti-bovine CD14 monoclonal antibody, clone CC-G33, isotype IgG1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD25 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA2430PE</td>
			<td>Mouse anti bovine CD25 monoclonal antibody, clone IL-A11, isotype IgG1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA1653A647</td>
			<td>Mouse anti bovine CD4 monoclonal antibody, clone CC8, isotype IgG2a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD40 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA2431F</td>
			<td>Mouse anti-bovine CD40 monoclonal antibody, clone IL-A156, isotype IgG1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA837F</td>
			<td>Mouse anti bovine CD8 monoclonal antibody, clone CC63, isotype IgG2a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD86 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA2437PE</td>
			<td>Mouse anti-bovine CD86 monoclonal antibody, clone IL-A190, isotype IgG1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>-</td>
			<td>Thermal cycler PCR machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Centrifuge Tube</td>
			<td>Falcon Corning&#160;</td>
			<td>352096 &#38; 352070</td>
			<td>15 mL and 50 mL, high-clarity poypropylene conical bottom, graduated, sterial, seal screw cap, falcon tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix/Cytoperm Plus</td>
			<td>BD Bio Sciences</td>
			<td>555028</td>
			<td>Fixation/permeabilization kit with BD golgiPlug, use for flow cytometer cell staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1009832500</td>
			<td>Absolute for analysis EMSURE&#160;ACS,ISO, Reag. Ph Eur</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher</td>
			<td>10500064</td>
			<td>Qualified, heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll Plaque PLUS</td>
			<td>GE Health care Life Sciences, USA</td>
			<td>341691</td>
			<td>Lymphocyte-isolation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowClean Cleaning Agent</td>
			<td>Beckman Coulter, Life Sciences</td>
			<td>A64669</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>FlowJo, Becton, Dickinson (BD) and Company, LLC, USA</td>
			<td>-</td>
			<td>Flow cytometer Histogram software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowTubes/ FACS&#160; (Fluorescence-activated single-cell sorting) Tube</td>
			<td>Falcon Corning&#160;</td>
			<td>352235</td>
			<td>5 mL, sterial, round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap, use in flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresceinisothiocynat-Dextran</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>60842-46-8</td>
			<td>FITC-dextran MW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallios Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>-</td>
			<td>Flow cytometer machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard-Shell 96-Well PCR Plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSP9601</td>
			<td>96 well, low profile, thin wall, skirted, white/clear</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human CD14 MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi Bioteck, Germany</td>
			<td>130-050-201</td>
			<td>2 mL microbeads conjugated to monoclonal anti-human CD14 antibody isotype IgG2a, used for selection of bovine monocytes from PBMCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaluza</td>
			<td>Beckman Coulter, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>Flow cytometer multicolor data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Column</td>
			<td>Miltenyi Bioteck, Germany</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Magnetic activated cell sorting or immune magentic cell separation colum for separation of various CD14 cell population based on cell surface antigens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC Class II DQ DR Polymorphic Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA2228F</td>
			<td>Mouse anti-sheep MHC Class II DQ DR Polymorphic:FITC, clone 49.1, isotype IgG2a, cross reactive with bovine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>HS4325</td>
			<td>1.5 mL, conical bottom, graduated, sterial tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Power Point</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>-</td>
			<td>The graphical illustrations of experimental design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 Negative Control:FITC for CD14, CD40 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA928F</td>
			<td>Isotype control CD14 and CD40 monoclonal antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 Negative Control:PE for CD86 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA928PE</td>
			<td>Isotype control CD86 monoclonal antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 Negative Control:RPE for CD25 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA928PE</td>
			<td>Isotype control CD25 monoclonal antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG2a Negative Control:FITC for MHC Class II Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA929F</td>
			<td>Isotype control for MHC class II monoclonal antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nobivac Rabies</td>
			<td>MSD Animal Health, UK</td>
			<td>-</td>
			<td>1 &#181;L/mL of cell cultured inactivated vaccine containing &#62; 2 I.U./mL Rabies virus strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical seals</td>
			<td>Bi0-Rad</td>
			<td>TCS0803</td>
			<td>0.2 mL flat PCR tube 8-cap strips, optical, ultraclear, compatible for qPCR machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td>pH 7.4, 1x concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism - GraphPad 5 Software&#160;</td>
			<td>Dotmatics</td>
			<td>-</td>
			<td>Statistical software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Anti-human Ki-67 antibody</td>
			<td>Biolegend, USA</td>
			<td>350501</td>
			<td>Monoclonal antibody, cross reactive with cow, clone ki-67</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Mouse IgG1 k Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>400101</td>
			<td>Isotype control for Ki-67 monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>READIDROP Propidium Iodide</td>
			<td>BD Bio Sciences</td>
			<td>1351101</td>
			<td>Live/dead cell marker used for flow cytometry, amine reactive dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-2 Protein</td>
			<td>R&#38;D System, USA</td>
			<td>202-IL-010/CF</td>
			<td>Interleukin-2, 20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74106</td>
			<td>Kit use for extraction of total RNA; RLT buffer = lysis buffer; RW1 buffer = stringent guanidine-containing washing buffer; RDD buffer = DNase buffer; RPE buffer = mild wash buffer; RNaseOUT = RNase inhibitor.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td>Cell culture media with L-glutamine and sodium bicarbonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMART-servier medical art&#160;</td>
			<td>Les Laboratories Servier</td>
			<td>-</td>
			<td>Licensed under a creative commons attribution 3.0 unported license</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>172-5270</td>
			<td>2x qPCR mix conatins dNTPs, Ss07d fusion polymerase, MgCl2, SYBR Green I supermix = supermix, ROX normalization dyes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III First-Strand Synthesis System</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher</td>
			<td>18080051</td>
			<td>Kit for cDNA synthsis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Test plate 24</td>
			<td>TPP, Switzerland</td>
			<td>92024</td>
			<td>24 well plate, sterilized by radiation , growth enhanced treated, volume 3.18 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher</td>
			<td>15250061</td>
			<td>0.4%, 100 mL, dye to assess cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher</td>
			<td>10977023</td>
			<td>0.1 &#181;m membrane filtered distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15206067</td>
			<td>VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes have a green top and contain spray-dried lithium, sodium or ammonium heparin on the inner walls and are usedin clinical chemistry, immunology and serology. The anticoagulant heparin activates antithrombin, which blocks the clotting cascade and thus produces a whole blood/plasma sample.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W3500-1L</td>
			<td>Sterile-filtered, bioReagent suitable for cell culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of vaccine immunogenicity using bovine monocyte-derived dendritic cells

الخلايا المتغصنة (DCs) هي أقوى الخلايا المقدمة للمستضد (APCs) داخل الجهاز المناعي. وهي تقوم بدوريات في الكائن الحي بحثا عن مسببات الأمراض، وتلعب دورا فريدا داخل الجهاز المناعي من خلال الربط بين الاستجابات المناعية الفطرية والتكيفية. يمكن لهذه الخلايا أن تبتلع ثم تقدم مولدات الضد الملتقطة إلى الخلايا المناعية المستجيبة، مما يؤدي إلى مجموعة متنوعة من الاستجابات المناعية. توضح هذه الورقة طريقة موحدة للتوليد في المختبر للخلايا المتغصنة المشتقة من الخلايا الأحادية البقرية (MoDCs) المعزولة من الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي للماشية (PBMCs) وتطبيقها في تقييم مناعة اللقاح.
تم استخدام فرز الخلايا القائم على المغناطيسية لعزل الخلايا الوحيدة CD14 + من PBMCs ، وتم استخدام مكملات وسط الاستزراع الكامل مع الإنترلوكين (IL) -4 وعامل تحفيز مستعمرة الخلايا المحببة والبلاعم (GM-CSF) للحث على تمايز الخلايا الوحيدة CD14 + إلى MoDCs ساذجة. تم تأكيد جيل MoDCs غير الناضجة من خلال الكشف عن التعبير عن علامات سطح الخلية الرئيسية II (MHC II) ، CD86 ، و CD40. تم استخدام لقاح داء الكلب المتاح تجاريا لنبض MoDCs غير الناضجة ، والتي تم استزراعها لاحقا مع الخلايا الليمفاوية الساذجة.
كشف تحليل قياس التدفق الخلوي ل MoDCs النبضية للمستضد والثقافة المشتركة للخلايا الليمفاوية عن تحفيز تكاثر الخلايا الليمفاوية التائية من خلال التعبير عن علامات Ki-67 و CD25 و CD4 و CD8. أظهر تحليل تعبير mRNA ل IFN-γ و Ki-67 ، باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي ، أن MoDCs يمكن أن تحفز التحضير الخاص بالمستضد للخلايا الليمفاوية في نظام الاستزراع المشترك في المختبر . علاوة على ذلك ، أظهر إفراز IFN-γ الذي تم تقييمه باستخدام ELISA عيارا أعلى بكثير (** p < 0.01) في الثقافة المشتركة للخلايا اللمفاوية النابضة بلقاح داء الكلب مقارنة بالثقافة المشتركة MoDC-lymphocyte غير النابضة بالمستضد. تظهر هذه النتائج صحة اختبار MoDC في المختبر لقياس مناعة اللقاح ، مما يعني أنه يمكن استخدام هذا الاختبار لتحديد اللقاحات المرشحة المحتملة للماشية قبل الشروع في التجارب في الجسم الحي ، وكذلك في تقييمات مناعة اللقاح للقاحات التجارية.

تصف هذه المنهجية الجيل المختبري من MoDCs الماشية لتقييم مستضدات اللقاح المرشحة قبل إجراء الدراسات في الجسم الحي. يوضح الشكل 1 المخطط التجريبي لتوليد MoDC البقري وتطبيق MoDCs للفحص في المختبر. باستخدام تقنية فرز الخلايا القائمة على المغناطيسية ، كان من الممكن جمع م?...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells at JoVE.com

Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells

تصف المنهجية توليد الخلايا المتغصنة المشتقة من الخلايا الأحادية البقرية (MoDCs) وتطبيقها للتقييم في المختبر للمرشحين المستضديين أثناء تطوير اللقاحات البيطرية المحتملة في الماشية.

تحديد مناعة اللقاح باستخدام الخلايا المتغصنة المشتقة من وحيدات الأبقار

Dendritic cells (DCs) are the most potent antigen-presenting cells (APCs) within the immune system. They patrol the organism looking for pathogens and ...

يمثل هذا البروتوكول مقايسة وظيفية في المختبر باستخدام الخلايا المتغصنة المشتقة من الخلايا الأحادية البقرية لقياس مناعة اللقاح قبل الدراسات في الجسم الحي. لذلك ، سد الفجوة الموجودة في تطعيم الماشية. إنه توليد وتطبيق الخلايا المتغصنة.باعتبارها أقوى الخلايا المقدمة للمستضد ، أصبحت الخلايا المتغصنة هدفا بحثيا رئيسيا لفهم آليات المناعة داخل الخلايا بما في ذلك فعالية اللقاح. يمكن تنفيذ هذا الاختبار كأداة لفحص اللقاحات المرشحة ، كحالة لمراقبة الجودة لإنتاج اللقاح ، ولاختيار المستضد والمواد المساعدة. سيوضح الإجراء ريتشارد كانجيث ، العالم في مختبر الإنتاج الحيواني والصحة.ابدأ بقلب وخلط الدم الذي تم الحصول عليه من ثقب الوريد الوداجي في ربلة الساق مع vacutainers الهيبارين. ثم نقل 20 ملليلتر من الدم الهيبارين إلى أنبوب معقم 50 ملليلتر وتخفيفه مع 10 ملليلتر من محلول ملحي مخزن الفوسفات أو برنامج تلفزيوني. ماصة 15 ملليلتر من الخلايا اللمفاوية عزل المتوسطة إلى أنبوب معقم 50 ملليلتر وإمالة الأنبوب إلى وضع 45 درجة.ضع بعناية 30 ملليلترا من وسط PBS في الدم فوق عزل الخلايا الليمفاوية باستخدام ماصة 25 ملليلتر وأعد الأنبوب ببطء إلى وضع عمودي قبل الطرد المركزي. ثم اجمع الطبقة البيضاء الرقيقة من خلايا الدم أحادية النواة المحيطية أو طبقة PBMC باستخدام ماصة باستور وانقلها إلى أنبوب جديد سعة 50 ملليلتر. اغسل PBMCs المحصودة مرتين باستخدام 40 ملليلترا من PBS لكل غسلة واخلطها جيدا.بعد الطرد المركزي ، أعد تعليق الحبيبات في 15 ملليلتر من محلول البوتاسيوم كلوريد الأمونيوم أو المخزن المؤقت ACK. بعد 10 إلى 15 دقيقة من الحضانة في درجة حرارة الغرفة ، أضف ما يصل إلى 40 ملليلتر من PBS وأجهزة الطرد المركزي للأنبوب بأقصى قدر من التسارع والتباطؤ. أعد تعليق الحبيبات في 10 ملليلتر من وسط الاستزراع الكامل.ثم أضف خمسة ميكرولترات من المخزن المؤقت CD14 MicroBead لكل 10 ملايين خلية واخلطها جيدا باستخدام ماصة. لتحليل قياس التدفق الخلوي ، أضف 10 ميكرولتر من CD14 fluorescein isothiocyanate أو الجسم المضاد للتلطيخ FITC إلى PBMCs واحتضانه لمدة 15 دقيقة عند أربع إلى ثماني درجات مئوية قبل الشروع في قياس التدفق الخلوي. إلى PBMCs غير الملوثة ، أضف ملليلترا واحدا من المخزن المؤقت للفاكس وطرده لمدة سبع دقائق عند 500 جرام وأربع درجات مئوية.ثم أعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفاكس لكل 100 مليون خلية. بعد ذلك ، أدخل عمود فصل الخلايا المغناطيسية المناعية في الفاصل وضع أنبوب تجميع سعة 50 ملليلترا أسفل مخرج العمود لتجميع التدفق من خلاله. بعد غسل العمود بمخزن فاكس واحد ملليلتر منزوع الغاز ، استبدل الأنبوب المستخدم سعة 15 ملليلتر بآخر جديد.ماصة مائة مليون خلية في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت في وقت واحد مما يسمح لتعليق الخلية بالمرور عبر العمود. ثم اشطف العمود ثلاث مرات بثلاثة ملليلتر من المخزن المؤقت للفاكس الذي تم تفريغه في كل مرة. بعد جمع التدفق ، قم بتسمية أول جزء من الخلايا الليمفاوية الساذجة المستخلصة على أنه جزء الخلية السالبة CD14.قم بإزالة العمود من الفاصل وضع أنبوبا معقما جديدا سعة 15 ملليلتر أسفل العمود لجمع النفايات السائلة. أضف خمسة ملليلتر من المخزن المؤقت للفاكس إلى العمود وادفعه على الفور باستخدام المكبس. اجمع وسمي التدفق الثاني أو جزء الخلية الوحيدة الساذج على أنه جزء الخلية الموجب CD14.أضف وسط استزراع كامل إلى الخلايا الوحيدة الإيجابية CD14 المحصودة لتحقيق 1 مليون خلية لكل ملليلتر. بعد ذلك ، أضف معلقا واحدا من خلية ملليلتر إلى كل بئر من صفيحة معقمة من 24 بئرا قبل استكمال كل بئر ب 40 ميكرولترا من كوكتيل السيتوكين الموجود في المجموعة. في اليوم الثاني ، انقل نصف محتوى كل بئر إلى أنابيب فردية سعة 1.5 ملليلتر باستخدام ماصة.بعد الطرد المركزي للأنابيب سعة 1.5 ملليلتر عند 500 جرام لمدة سبع دقائق ، تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من وسط الاستزراع الكامل الجديد. انقل 500 ميكرولتر من تعليق الخلية المعاد تعليقه مرة أخرى إلى الآبار المقابلة بحيث يصبح الحجم النهائي في البئر ملليلتر واحد. إثراء كل بئر مع 20 ميكرولتر من كوكتيل السيتوكين.لتوليد MoDCs نبض المستضد ، أضف ميكرولتر واحد لكل ملليلتر من لقاح فيروس داء الكلب أو معلق RV إلى ملليلتر واحد من ثقافة MoDC الساذجة في لوحة 24 بئرا واحتضان اللوحة لمدة 48 ساعة عند 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 37 درجة مئوية. في اليوم السابع ، احتفظ باللوحة المكونة من 24 بئرا والتي تحتوي على MoDCs النبضية للمستضد على الجليد لمدة 10 دقائق قبل إضافة ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني بارد للثلج لكل بئر وخلطه جيدا. نقل التعليق إلى أنبوب 15 ملليلتر.اغسل الآبار بمليلتر من الثلج البارد PBS. اجمع الخلايا المتبقية داخل كل بئر وانقل المحتويات المغسولة إلى الأنابيب الخاصة بها. أجهزة الطرد المركزي تعليق الخلية في 500G لمدة سبع دقائق.بعد التخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق حبيبات خلايا MoDCs النبضية بالمستضد في وسط استزراع كامل لضبط التركيز النهائي البالغ 100،000 خلية لكل ملليلتر. بالنسبة للاستزراع المشترك للخلايا الليمفاوية MoDC ، قم بزرع آبار صفيحة معقمة من 24 بئرا مع ملليلتر واحد من معلق الخلايا الليمفاوية الساذجة وملليلتر واحد من معلق MoDC النبضي بالمستضد أو غير النبضي في اليوم السابع من نبضة المستضد. بعد يومين من الحضانة ، استكمل كل بئر ب 20 نانوجرام لكل مليلتر من الإنترلوكين -2 المؤتلف واستمر في الحضانة لمدة 120 ساعة أخرى.في اليوم 14 ، انقل ملليلترا واحدا من الثقافة المشتركة إلى أنبوب معقم سعة 1.5 ملليلتر وطرد مركزي للأنبوب. ثم أعد تعليق حبيبات الخلية بمليلتر واحد من MoDCs النبضية أو غير النبضية. تخلط جيدا ونقل تعليق الخلية إلى الآبار المقابلة لها.بعد تلطيخ سطح الخلية من PBMCs والخلايا الليمفاوية الساذجة والوحيدات ، انقل ملليلتر واحد من تعليق الخلية إلى أنبوب معقم سعة 1.5 ملليلتر باستخدام ماصة وأجهزة طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 500 جرام. ثم أعد تعليق الحبيبات في ملليلتر واحد من PBS وانقلها إلى أنبوب 15 ملليلتر. أيضا جمع الخلايا المتبقية والأنابيب المقابلة باستخدام ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني.ثم أضف 10 ملليلتر من PBS إلى أنبوب 15 ملليلتر الذي يحتوي على الخلايا واخلطه عن طريق الماصة. بعد طرد الأنبوب لمدة سبع دقائق عند 850 جم ، قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية بعناية مع ترك التعليق المتبقي بعد صب المادة الطافية. انقل تعليق الخلية إلى لوحة 96 بئرا ذات قاع V وأغلق الآبار لتجنب الانسكاب.بمجرد اكتمال التلوين ، قم بإجراء تحليل مقياس التدفق الخلوي. من المعاينة في الوقت الفعلي ، اضبط عتبة التألق بما في ذلك الجهد والكسب وحجم الخلية لرسم البوابات في النهاية حول مجموعة الخلايا المطلوبة مع استبعاد أي حطام خلوي. أظهر تلطيخ الخلايا CD14 وقياس التدفق الخلوي أن جزء الوحيدات الساذج يتألف من 98٪ من خلايا الخلايا الوحيدة الإيجابية CD14 وكان قادرا وظيفيا على امتصاص المستضد.إن MoDCs الساذجة التي تتميز ظاهريا بتقييم تعبير MHC Class 2 وعلامات سطح الخلية CD86 و CD40 المحفزة المشتركة قد تحققت من صحة الخلايا المتغصنة أو النمط الظاهري الشبيه بالتيار المستمر. خلال المزرعة المشتركة للخلايا الليمفاوية MoDC في اليوم التاسع ، لوحظ تغير مورفولوجي يظهر امتداد التغصنات في نبضة RV إلى MoDCs. بالمقارنة مع ثقافة الخلايا الليمفاوية MoDC غير النبضية ، تم إظهار زيادة كبيرة في انتشار الخلايا الليمفاوية من خلال تنظيم علامات تنشيط Ki67 و CD25 على الخلايا التائية الإيجابية CD4 و CD8 الإيجابية في اليوم 16 في الثقافة المشتركة للخلايا الليمفاوية MoDC النبضية.أظهرت الخلايا التائية الإيجابية CD8 من الثقافات المشتركة ل RV النبضية الناضجة MoDC تنظيما بمقدار ثمانية أضعاف ل Ki67 مقارنة بالمجموعة غير المحددة. أظهرت الخلايا الإيجابية CD4 في نفس الثقافة المشتركة زيادة بمقدار سبعة أضعاف في Ki67 مقارنة بالضوابط ، مما يدل على قدرة MoDCs المحضرة RV على تقديم مستضد RV إلى الخلايا الليمفاوية الساذجة وتنشيطها في حالة في المختبر. أظهر القياس الكمي qPCR للمزارع المشتركة زيادة بنسبة تزيد عن 30٪ في تعبير جاما الإنترفيرون وأكثر من 5٪ في تعبير Ki67 في جميع المزارع المشتركة باستخدام GAPDH كمعادل.لوحظ تركيز أعلى بكثير من غاما الإنترفيرون المفرزة في الثقافة المشتركة للخلايا الليمفاوية MoDC النبضية RV مقارنة بمجموعة العلاج غير المحددة. قم بإجراء خطوة الطبقات ببطء شديد وبعناية ، مع التأكد من وضع الدم فوق وسط عزل الخلايا الليمفاوية. كن حذرا للغاية لجمع كل PBMCs دون جمع الكثير من المواد من الطبقات الأخرى.يمكن تطبيق طرق أخرى مثل قياس التدفق الخلوي و ELISA و PCR الكمي ، من بين أمور أخرى ، بعد هذا الإجراء لتقييم تنشيط علامات المناعة.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

عزل خلايا الرئة ماوس شجيرى

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells

جيل من لقاح جديد للخلايا التشجرية باستخدام الميلانوما والخلايا الجذعية السرطانية الحرشفية

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H ...

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â² in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

تفعيل وقياس NLRP3 Inflammasome آخر عن طريق IL-1β في الخلايا الجذعية المشتقة من الوحيدات الإنسان

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

ثقافة الضامة الوحيدات المستمدة-بلعم مستعمرة تحفيز عامل متباينة الإنسان

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

توصيف الخلايا الجذعية البشرية الوحيدات المستمدة من التصوير التدفق الخلوي: مقارنة بين اثنين من بروتوكولات الوحيدات عزل

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

جيل من الوحيدات المستمدة الخلايا الجذعية البشرية من الدم الكامل

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

التنمية والتحقق من جزيء واحد أولتراسينسيتيفي الصفيف الرقمي المرتبط بالانزيم مقايسة الممتز للبشرية انترفيرون-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

siRNA Electroporation to Modulate Autophagy in Herpes Simplex Virus Type 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells

سيرنا اليكتروبوريشن لتعدل اوتوهاغي في الهربس البسيط الفيروسات نوع 1-الخلايا الجذعية المصابة بالبويضات المشتقة

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) induces autophagy in both, immature dendritic cells (iDCs) as well as mature dendritic cells (mDCs), whereas ...

In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

في المختبر التحفيز والتصور من الإفراج عن فخ خارج الخلية في الضامة البشرية المتمايزة المشتقة

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic ...

Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages

تصور الكاسباز الالتهابي الناجم عن القرب في البلاعم المشتقة من الخلايا الأحادية البشرية

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct ...