Name: determination of vaccine immunogenicity using bovine monocyte-derived dendritic cells
Uploaded: 2023-05-19T12:30:00
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我们感谢Eveline Wodak博士和Angelika Loistch博士（AGES）在确定动物健康状况和提供BTV方面的支持，感谢Bernhard Reinelt博士提供牛血，感谢原子能机构的Bharani Settypalli博士和William Dudon博士分别就实时聚合酶链反应实验和语言编辑提供有用的建议。

采血由经过认证的兽医服务机构根据奥地利卫生和食品安全局（AGES）的道德准则进行，并符合公认的动物福利标准32。该研究获得了奥地利农业部的伦理批准。 MoDCs生成的实验设计及其后续应用如图1所示。
1. 生产幼稚的MoDC
注意：全血样本是通过颈静脉穿刺和肝素化真空管从单个无病原体的小牛获得的?...

本研究展示了一种用于生成和分型牛 MoDC 的标准化体 外 方法，以及随后用于测量商业疫苗（例如 RV）的疫苗免疫原性。牛MoDC可用作筛选针对牛病的潜在疫苗抗原的工具，并在进行 体内 动物试验之前根据免疫反应预测其潜在的临床影响。生成的MoDC是根据其形态，表型和功能特征来鉴定的。我们发现，源自牛CD14 + 单核细胞的MoDC表现出DC中可见的特征，例如延伸的树突，用于?...

兽医疫苗接种是畜牧业和健康的一个重要方面，因为它通过提供保护，防止影响全球畜牧业的疾病，有助于改善粮食安全和动物福利1。评估可能候选疫苗的免疫原性的有效体 外 方法将有助于加速疫苗的开发和生产过程。因此，有必要通过基于 体外 研究的创新方法来扩展免疫测定领域，因为这将有助于揭示与免疫和病原体感染相关的免疫过程的复杂性。目前，需要定期取样（例如血液和脾脏）的 体内 动物免疫和激发研究用于测量候选疫苗和佐剂的免疫原性。这些检测昂贵、耗时且具有伦理意义，因为在大多数情况下，动物安乐死是在试验结束时进行的。
作为体内测定的替代方法，外周血单核细胞（PBMC）已被用于评估疫苗诱导的体外免疫反应2。PBMC是由70%-90%的淋巴细胞，10%-20%的单核细胞和有限数量的树突状细胞（DC，1%-2%）组成的异质细胞群3。PBMC含有抗原呈递细胞（APC），例如B细胞，单核细胞和DC，它们不断巡逻生物体，寻找感染或组织损伤的迹象。局部分泌的趋化因子通过与细胞表面受体结合，促进APCs在这些位点的募集和激活。在单核细胞的情况下，趋化因子引导它们的命运分化成DC或巨噬细胞4。一旦DC遇到并捕获病原体，它们就会迁移到次级淋巴器官，在那里它们可以分别使用主要组织相容性复合体（MHC）I类或II类表面蛋白将加工过的病原体肽抗原呈递到CD8 + T细胞或CD4 + T细胞，从而触发免疫反应5，6。
DC在协调针对各种病原体的保护性免疫应答中发挥的关键作用使其成为了解细胞内免疫机制的有趣研究目标，特别是在设计针对感染因子的疫苗和佐剂时7。由于可以从PBMC获得的DC比例相当小（1%-2%），因此单核细胞已被用于体外产生DC。这些单核细胞衍生的DC（MoDC）最初是作为癌症免疫治疗中可能的治疗策略开发的9。最近，MoDC已被用于疫苗研究10，11，12，经典单核细胞是MoDC生产的主要亚型（89%）13。MoDCs的体外生产以前是通过添加粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）与其他细胞因子（如白细胞介素-4（IL-4）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）或IL-1314，15，16）联合给药来实现的。
体外MoDC测定的成功依赖于抗原刺激的成熟MoDC调节特定于检测到的抗原类型的免疫反应的程度和类型的能力17。MoDCs识别和呈递的病原体类型决定了CD4+ T辅助（Th）细胞分化为Th1，Th2或Th17效应细胞，并且以病原体特异性分泌细胞因子谱为特征。针对细胞内病原体引发Th1反应，并导致干扰素-γ（IFN-γ）和肿瘤坏死因子β（TNF-β）的分泌，后者调节吞噬细胞依赖性保护。针对寄生生物触发 Th2 反应，其特征在于 IL-4、IL-5、IL-10 和 IL-13 分泌，从而启动吞噬细胞非依赖性体液保护。Th17 提供中性粒细胞依赖性保护，防止由分泌 IL-17、IL-17F、IL-6、IL-22 和 TNF-α18、19、20、21 介导的细胞外细菌和真菌感染。根据以前的研究，已经注意到并非所有病原体都属于预期的细胞因子谱。例如，皮肤MoDCs响应利什曼原虫寄生虫感染，刺激CD4 + T细胞和CD8 + T细胞分泌IFN-γ，从而诱导保护性促炎Th1反应22。
研究还表明，在用沙门氏菌脂多糖（LPS）引发的鸡MoDC中，可以通过激活Th1和Th2反应来诱导对鼠伤寒沙门氏菌的可变反应，而加里纳鲁沙门氏菌单独诱导Th2反应，这可以解释后者对MoDC清除率的更高抵抗力23。在犬和人类MoDC中也报道了针对犬布鲁氏菌（B. canis）的MoDCs的激活，这意味着这可能代表人畜共患感染机制24。用犬双歧杆菌引发的人类MoDC诱导强烈的Th1反应，赋予对严重感染的抵抗力，而犬MoDC诱导显性Th17反应，Th1反应降低，随后导致慢性感染的建立25。与单独使用非结合的口蹄疫病毒相比，牛 MoDC 对与免疫球蛋白 G （IgG） 偶联的口蹄疫病毒 （FMDV） 的亲和力增强，因为 MoDC 形成病毒抗体复合物以响应前10 种病毒抗体复合物。综上所述，这些研究显示了MoDC如何用于分析病原体感染期间免疫反应的复杂性。适应性免疫应答可以通过量化与淋巴细胞增殖相关的特定标志物来评估。Ki-67是一种仅在分裂细胞中检测到的细胞内蛋白，被认为是增殖研究的可靠标志物26，同样，在活化后期在T细胞表面表达的CD25对应于淋巴细胞增殖27，28。
本研究展示了一种用于体外产生牛MoDC的标准化方法，然后将其应用于用于测试疫苗免疫原性的体外免疫测定中。市售狂犬病疫苗（RV）用于验证该测定的有效性。通过流式细胞术、实时定量聚合酶链反应（qPCR）和酶联免疫吸附测定法（ELISA）测定T淋巴细胞活化和增殖，分析成熟的细胞活化标志物（如Ki-67和CD25）以及IFN-γ28，29，30，31的分泌。在MoDC测定期间不进行动物或人体实验试验。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher</td>
			<td>A1049201</td>
			<td>Ammonium-Chloride-Potassium buffer for lysis of residual RBCs in harvested PBMC Fraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Heparin Tubes</td>
			<td>Becton, Dickinson (BD) and Company</td>
			<td>366480</td>
			<td>10 mL, additive sodium heparin 158 USP units, glass tube, 16 x 100 mm size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Dendritic Cell Growth Kit</td>
			<td>Bio-Rad, UK</td>
			<td>PBP015KZZ</td>
			<td>Cytokine cocktail composed of recombinant bovine IL-4 and GM-CSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine IFN-&#947; ELISA Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA5638KZZ</td>
			<td>Kit use for measuring IFN-&#947; expression in culture supernatant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA2678F</td>
			<td>Mouse anti-bovine CD14 monoclonal antibody, clone CC-G33, isotype IgG1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD25 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA2430PE</td>
			<td>Mouse anti bovine CD25 monoclonal antibody, clone IL-A11, isotype IgG1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA1653A647</td>
			<td>Mouse anti bovine CD4 monoclonal antibody, clone CC8, isotype IgG2a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD40 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA2431F</td>
			<td>Mouse anti-bovine CD40 monoclonal antibody, clone IL-A156, isotype IgG1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA837F</td>
			<td>Mouse anti bovine CD8 monoclonal antibody, clone CC63, isotype IgG2a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD86 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA2437PE</td>
			<td>Mouse anti-bovine CD86 monoclonal antibody, clone IL-A190, isotype IgG1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>-</td>
			<td>Thermal cycler PCR machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Centrifuge Tube</td>
			<td>Falcon Corning&#160;</td>
			<td>352096 &#38; 352070</td>
			<td>15 mL and 50 mL, high-clarity poypropylene conical bottom, graduated, sterial, seal screw cap, falcon tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix/Cytoperm Plus</td>
			<td>BD Bio Sciences</td>
			<td>555028</td>
			<td>Fixation/permeabilization kit with BD golgiPlug, use for flow cytometer cell staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1009832500</td>
			<td>Absolute for analysis EMSURE&#160;ACS,ISO, Reag. Ph Eur</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher</td>
			<td>10500064</td>
			<td>Qualified, heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll Plaque PLUS</td>
			<td>GE Health care Life Sciences, USA</td>
			<td>341691</td>
			<td>Lymphocyte-isolation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowClean Cleaning Agent</td>
			<td>Beckman Coulter, Life Sciences</td>
			<td>A64669</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>FlowJo, Becton, Dickinson (BD) and Company, LLC, USA</td>
			<td>-</td>
			<td>Flow cytometer Histogram software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowTubes/ FACS&#160; (Fluorescence-activated single-cell sorting) Tube</td>
			<td>Falcon Corning&#160;</td>
			<td>352235</td>
			<td>5 mL, sterial, round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap, use in flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresceinisothiocynat-Dextran</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>60842-46-8</td>
			<td>FITC-dextran MW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallios Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>-</td>
			<td>Flow cytometer machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard-Shell 96-Well PCR Plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSP9601</td>
			<td>96 well, low profile, thin wall, skirted, white/clear</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human CD14 MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi Bioteck, Germany</td>
			<td>130-050-201</td>
			<td>2 mL microbeads conjugated to monoclonal anti-human CD14 antibody isotype IgG2a, used for selection of bovine monocytes from PBMCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaluza</td>
			<td>Beckman Coulter, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>Flow cytometer multicolor data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Column</td>
			<td>Miltenyi Bioteck, Germany</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Magnetic activated cell sorting or immune magentic cell separation colum for separation of various CD14 cell population based on cell surface antigens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC Class II DQ DR Polymorphic Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA2228F</td>
			<td>Mouse anti-sheep MHC Class II DQ DR Polymorphic:FITC, clone 49.1, isotype IgG2a, cross reactive with bovine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>HS4325</td>
			<td>1.5 mL, conical bottom, graduated, sterial tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Power Point</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>-</td>
			<td>The graphical illustrations of experimental design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 Negative Control:FITC for CD14, CD40 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA928F</td>
			<td>Isotype control CD14 and CD40 monoclonal antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 Negative Control:PE for CD86 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA928PE</td>
			<td>Isotype control CD86 monoclonal antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 Negative Control:RPE for CD25 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA928PE</td>
			<td>Isotype control CD25 monoclonal antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG2a Negative Control:FITC for MHC Class II Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA929F</td>
			<td>Isotype control for MHC class II monoclonal antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nobivac Rabies</td>
			<td>MSD Animal Health, UK</td>
			<td>-</td>
			<td>1 &#181;L/mL of cell cultured inactivated vaccine containing &#62; 2 I.U./mL Rabies virus strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical seals</td>
			<td>Bi0-Rad</td>
			<td>TCS0803</td>
			<td>0.2 mL flat PCR tube 8-cap strips, optical, ultraclear, compatible for qPCR machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td>pH 7.4, 1x concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism - GraphPad 5 Software&#160;</td>
			<td>Dotmatics</td>
			<td>-</td>
			<td>Statistical software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Anti-human Ki-67 antibody</td>
			<td>Biolegend, USA</td>
			<td>350501</td>
			<td>Monoclonal antibody, cross reactive with cow, clone ki-67</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Mouse IgG1 k Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>400101</td>
			<td>Isotype control for Ki-67 monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>READIDROP Propidium Iodide</td>
			<td>BD Bio Sciences</td>
			<td>1351101</td>
			<td>Live/dead cell marker used for flow cytometry, amine reactive dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-2 Protein</td>
			<td>R&#38;D System, USA</td>
			<td>202-IL-010/CF</td>
			<td>Interleukin-2, 20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74106</td>
			<td>Kit use for extraction of total RNA; RLT buffer = lysis buffer; RW1 buffer = stringent guanidine-containing washing buffer; RDD buffer = DNase buffer; RPE buffer = mild wash buffer; RNaseOUT = RNase inhibitor.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td>Cell culture media with L-glutamine and sodium bicarbonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMART-servier medical art&#160;</td>
			<td>Les Laboratories Servier</td>
			<td>-</td>
			<td>Licensed under a creative commons attribution 3.0 unported license</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>172-5270</td>
			<td>2x qPCR mix conatins dNTPs, Ss07d fusion polymerase, MgCl2, SYBR Green I supermix = supermix, ROX normalization dyes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III First-Strand Synthesis System</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher</td>
			<td>18080051</td>
			<td>Kit for cDNA synthsis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Test plate 24</td>
			<td>TPP, Switzerland</td>
			<td>92024</td>
			<td>24 well plate, sterilized by radiation , growth enhanced treated, volume 3.18 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher</td>
			<td>15250061</td>
			<td>0.4%, 100 mL, dye to assess cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher</td>
			<td>10977023</td>
			<td>0.1 &#181;m membrane filtered distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15206067</td>
			<td>VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes have a green top and contain spray-dried lithium, sodium or ammonium heparin on the inner walls and are usedin clinical chemistry, immunology and serology. The anticoagulant heparin activates antithrombin, which blocks the clotting cascade and thus produces a whole blood/plasma sample.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W3500-1L</td>
			<td>Sterile-filtered, bioReagent suitable for cell culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of vaccine immunogenicity using bovine monocyte-derived dendritic cells

树突状细胞（DC）是免疫系统中最有效的抗原呈递细胞（APC）。它们在生物体中巡逻寻找病原体，并通过连接先天性和适应性免疫反应在免疫系统中发挥独特的作用。这些细胞可以吞噬细胞，然后将捕获的抗原呈递给效应免疫细胞，从而引发多种免疫反应。本文展示了从牛外周血单核细胞（PBMCs）中分离的牛单核细胞来源的树突状细胞（MoD）的体 外 生成标准化方法及其在疫苗免疫原性评估中的应用。
采用磁性细胞分选从PBMC中分离CD14+单核细胞，并用白细胞介素（IL）-4和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）补充完全培养基诱导CD14+单核细胞分化为幼稚MoDC。通过检测主要组织相容性复合物II（MHC II），CD86和CD40细胞表面标志物的表达来确认未成熟MoDC的产生。市售狂犬病疫苗用于冲击未成熟的MoDC，随后与幼稚淋巴细胞共培养。
抗原脉冲MoDC和淋巴细胞共培养的流式细胞术分析揭示了通过Ki-67，CD25，CD4和CD8标志物的表达刺激T淋巴细胞增殖。使用定量PCR分析 IFN-γ 和 Ki-67的mRNA表达表明，MoDCs可以在该 体外 共培养系统中诱导淋巴细胞的抗原特异性启动。此外，使用 ELISA 评估的 IFN-γ 分泌显示，狂犬病疫苗脉冲 MoDC 淋巴细胞共培养的滴度 （**p < 0.01） 显著高于非抗原脉冲 MoDC 淋巴细胞共培养。这些结果表明，这种 体外 MoDC测定法测量疫苗免疫原性的有效性，这意味着该测定可用于在进行 体内 试验之前确定牛的潜在候选疫苗，以及商业疫苗的疫苗免疫原性评估。

该方法描述了牛MoDC的体外生成，用于在进行体内研究之前评估候选疫苗抗原。图1说明了牛MoDC生成的实验方案以及MoDC在体外测定中的应用。使用基于磁性的细胞分选技术，可以从收获的PBMC中收集约2600万个CD14 +肌细胞，这些PBMC以前是从50 mL牛血中分离出来的。不含CD14+单核细胞的洗脱细胞组分富含淋巴细胞，可用作幼稚CD4+和CD8+ T?...

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Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells

该方法描述了牛单核细胞来源的树突状细胞（MoDC）的产生及其在牛潜在兽用疫苗开发过程中抗原候选物体 外评估中的 应用。

使用牛单核细胞来源的树突状细胞测定疫苗免疫原性

Dendritic cells (DCs) are the most potent antigen-presenting cells (APCs) within the immune system. They patrol the organism looking for pathogens and ...

该协议代表了一种功能性体外测定，使用牛单核细胞来源的树突状细胞在体内研究之前测量疫苗免疫原性。因此，填补了畜禽疫苗学的现有空白。它是树突状细胞的产生和应用。树突状细胞作为最有效的抗原呈递细胞，已成为了解包括疫苗功效在内的细胞内免疫机制的关键研究靶点。该测定可以作为筛选候选疫苗的工具，作为疫苗生产的质量控制状态以及抗原和佐剂选择的工具。展示该程序的将是动物生产和健康实验室的科学家Richard Kangethe。首先将从小腿颈静脉穿刺获得的血液与肝素化真空管倒置和混合。然后将20毫升肝素化血液转移到无菌的50毫升管中，并用10毫升磷酸盐缓冲盐水或PBS稀释。将15毫升淋巴细胞分离培养基移液到无菌的50毫升管中，并将管倾斜至45度位置。使用25毫升移液管小心地将30毫升血液PBS培养基分层在淋巴细胞分离的顶部，并在离心前将管子缓慢返回到垂直位置。然后使用巴斯德移液管收集外周血单核细胞或PBMC层的薄白色层，并将其转移到新的50毫升管中。每次洗涤使用40毫升PBS洗涤收获的PBMC两次，并充分混合。离心后，将沉淀重悬于15毫升氯化铵钾缓冲液或ACK缓冲液中。在室温下孵育10至15分钟后，加入多达40毫升PBS并以最大加速和减速离心管。将沉淀重悬于10毫升完全培养基中。然后每1000万个细胞加入5微升CD14微珠缓冲液，并使用移液管充分混合。对于流式细胞术分析，向PBMC中加入10微升CD14异硫氰酸荧光素或FITC染色抗体，并在4至8摄氏度下孵育15分钟，然后再进行流式细胞术。向未染色的PBMC中加入一毫升传真缓冲液，并在500g和4摄氏度下离心7分钟。然后将沉淀重悬于每1亿个细胞的500微升传真缓冲液中。接下来，将免疫磁性细胞分离柱插入分离器中，并在色谱柱出口下方放置50毫升收集管以收集流出物。用一毫升脱气传真缓冲液清洗色谱柱后，用新的管更换用过的15毫升管。一次在500微升缓冲液中移取一亿个细胞，使细胞悬液通过色谱柱。然后每次用三毫升脱气传真缓冲液冲洗色谱柱三次。收集流出物后，将第一个洗脱的幼稚淋巴细胞部分标记为CD14阴性细胞部分。从分离器中取出色谱柱，并在色谱柱下方放置一个新的无菌15毫升管，用于收集废水。将五毫升传真缓冲液加入色谱柱中，并立即使用柱塞将其推入。收集并将第二个流通或幼稚单核细胞部分标记为CD14阳性细胞部分。将完全培养基添加到收获的CD14阳性单核细胞中，以达到每毫升100万个细胞。接下来，向无菌24孔板的每个孔中加入一毫升细胞悬液，然后在每个孔中补充试剂盒中提供的40微升细胞因子混合物。在第二天，使用移液管将每个孔内容物的一半转移到单独的1.5毫升管中。将1.5毫升管以500g离心7分钟后，弃去上清液并将沉淀重悬于500微升新鲜完全培养基中。将500微升这种重悬的细胞悬液转移回相应的孔中，使孔中的最终体积变为一毫升。用20微升细胞因子混合物丰富每个孔。为了产生抗原脉冲MoDC，将每毫升狂犬病病毒疫苗或RV悬浮液加入24孔板中的1毫升幼稚MoDC培养物中，并将板在5%二氧化碳和37摄氏度下孵育48小时。在第 7 天，将含有抗原脉冲 MoDC 的 24 孔板在冰上保持 10 分钟，然后每孔加入一毫升冰冷的 PBS 并充分混合。将悬浮液转移到15毫升管中。用两毫升冰冷的PBS清洗井。收集每个孔内的残留细胞并将洗涤的内容物转移到各自的管中。将细胞悬液以500g离心7分钟。弃去上清液后，将抗原脉冲的MoDCs细胞沉淀重悬于完整的培养基中，以调节每毫升100， 000个细胞的最终浓度。对于 MoDC-淋巴细胞共培养，在抗原脉冲的第 7 天用 1 毫升幼稚淋巴细胞悬液和 1 毫升抗原脉冲或非抗原脉冲 MoDC 悬浮液播种无菌 24 孔板的孔。孵育两天后，用每毫升20纳克重组白细胞介素-2补充每个孔，并继续孵育120小时。在第14天，将一毫升共培养物转移到无菌的1.5毫升管中并离心管。然后用一毫升抗原脉冲或非脉冲MoDC重悬细胞沉淀。充分混合并将细胞悬浮液转移到相应的孔中。在PBMC和幼稚淋巴细胞和单核细胞的细胞表面染色后，使用移液管将一毫升细胞悬液转移到无菌的1.5毫升管中，并以500g离心10分钟。然后将沉淀重悬于一毫升PBS中，并将其转移到15毫升管中。同时使用一毫升PBS收集残留细胞和相应的管。然后将10毫升PBS加入含有细胞的15毫升管中，并通过移液混合。将试管以850g离心7分钟后，除去上清液，小心地重悬细胞沉淀，倾析上清液后留下残留的悬浮液。将细胞悬液转移到V底部96孔板上并密封孔以避免溢出。染色完成后，进行流式细胞仪分析。从实时预览中，调整荧光阈值，包括电压和增益以及细胞大小，以最终在所需细胞群周围绘制门，同时排除任何细胞碎片。CD14细胞染色和流式细胞术显示，幼稚单核细胞组分由98%CD14阳性单核细胞组成，并且在功能上具有抗原摄取能力。通过评估MHC Class 2和共刺激CD86和CD40细胞表面标志物的表达来表征的幼稚MoDC表型验证了树突状细胞或DC样表型。在第九天的MoDC淋巴细胞共培养期间，在向MoDC的RV脉冲中观察到显示树突延伸的形态变化。与非脉冲MoDC淋巴细胞培养相比，在脉冲MoDC淋巴细胞共培养的第16天，CD4阳性和CD8阳性T细胞上的Ki67和CD25活化标志物上调，证明了淋巴细胞增殖的显着增加。与非特异性组相比，来自成熟RV脉冲MoDC共培养的CD8阳性T细胞表现出Ki67的八倍上调。与对照组相比，同一共培养物中的CD4阳性细胞的Ki67增加了7倍，这表明RV引发的MoDC能够将RV抗原呈递给幼稚淋巴细胞并在体外条件下激活它们。共培养物的qPCR定量显示，在使用GAPDH作为校准品的所有共培养物中，干扰素γ表达增加30%以上，Ki67表达增加5%以上。与非特异性治疗组相比，在RV脉冲MoDC淋巴细胞共培养中观察到分泌干扰素γ浓度显着更高。非常缓慢和小心地执行分层步骤，确保血液放在淋巴细胞分离培养基的顶部。要格外小心地收集所有PBMC，不要从其他层收集太多材料。其他方法，如流式细胞术，ELISA和定量PCR等，可以在此程序之后应用来评估免疫标志物的活化。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

小鼠肺树突状细胞的分离

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

科研

免疫与感染

Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells

使用黑色素瘤和鳞状癌干细胞生成新型支气干细胞疫苗

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H ...

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

激活和NLRP3炎性活性的人单核细胞来源的树突状细胞用IL-1β测量

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

通过成像流式细胞仪人单核细胞来源的树突状细胞的特征：两个单核细胞分离方法的比较

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

从全血人单核细胞来源的树突状细胞的生成

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

人干扰素α超灵敏单分子阵列数字酶联免疫吸附试验的研制与验证

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

siRNA Electroporation to Modulate Autophagy in Herpes Simplex Virus Type 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells

siRNA 电穿孔以在单纯疱疹病毒类型 1-感染单细胞衍生的丹突细胞中调制自噬

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) induces autophagy in both, immature dendritic cells (iDCs) as well as mature dendritic cells (mDCs), whereas ...

In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

分化人类单细胞衍生巨噬细胞中细胞外陷阱释放的体外刺激与可视化

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic ...

Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages

炎症性半月酶诱导的人单核细胞来源巨噬细胞邻近性的可视化

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct ...

使用唾液酸酶处理从分离的 PBMC 中去除唾液酸化单核细胞衍生的 DC

Generation of Monocyte-Derived Dendritic Cells with Differing Sialylated Phenotypes

作者聚焦：使用基于唾液酶的细胞表面酶处理树突状细胞成熟 

具有不同唾液酸化表型的单核细胞来源的树突状细胞的生成

Sialic acids are negatively charged monosaccharides typically found at the termini of cell surface glycans. Due to their hydrophilicity and biophysical ...