Name: determination of vaccine immunogenicity using bovine monocyte-derived dendritic cells
Uploaded: 2023-05-19T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells at JoVE.com

Vi takker Dr. Eveline Wodak og Dr. Angelika Loistch (AGES) for deres støtte til bestemmelse af dyrenes sundhedsstatus og for at levere BTV, Dr. Bernhard Reinelt for at levere kvægblod og Dr. Bharani Settypalli og Dr. William Dundon fra IAEA for nyttige råd om henholdsvis PCR-eksperimenter i realtid og sprogredigering.

Blodindsamling udføres af en certificeret dyrlægetjeneste i overensstemmelse med de etiske retningslinjer fra det østrigske agentur for sundhed og fødevaresikkerhed (AGES) og i overensstemmelse med de accepterede dyrevelfærdsstandarder32. Undersøgelsen modtog etisk godkendelse fra det østrigske landbrugsministerium. Det eksperimentelle design for MoDC-generering og dens efterfølgende anvendelse er illustreret i figur 1.
1. Pro...

Denne undersøgelse demonstrerer en standardiseret in vitro-metode til generering og fænotypebestemmelse af bovin MoDC'er og deres efterfølgende anvendelse til måling af vaccineimmunogeniciteten af en kommerciel vaccine (f.eks. RV). Bovin MoDC'er kan bruges som et værktøj til screening af potentielle vaccineantigener mod kvægsygdomme og forudsigelse af deres potentielle kliniske indvirkning baseret på immunresponser, inden de fortsætter mod in vivo-dyreforsøg . De genererede MoDC'er blev identi...

Veterinærvaccination er et afgørende aspekt af husdyrhold og sundhed, da det bidrager til at forbedre fødevaresikkerheden og dyrevelfærden ved at yde beskyttelse mod sygdomme, der påvirker husdyrsektoren globalt1. En effektiv in vitro-metode til vurdering af mulige vaccinekandidaters immunogenicitet ville bidrage til at fremskynde processen med udvikling og produktion af vacciner. Det er derfor nødvendigt at udvide området for immunassays med innovative metoder baseret på in vitro-undersøgelser , da dette vil bidrage til at afsløre kompleksiteten af immunprocesserne i forbindelse med immunisering og patogeninfektion. I øjeblikket anvendes in vivo dyreimmuniserings- og provokationsundersøgelser, som kræver periodisk prøveudtagning (f.eks. blod og milt), til at måle immunogeniciteten af kandidatvacciner og adjuvanser. Disse analyser er dyre, tidskrævende og har etiske konsekvenser, fordi eutanasi af dyr i de fleste tilfælde udføres ved afslutningen af forsøgene.
Som et alternativ til in vivo-assays er mononukleære celler i perifert blod (PBMC'er) blevet anvendt til at evaluere vaccineinducerede immunresponser in vitro2. PBMC'er er en heterogen population af celler sammensat af 70% -90% lymfocytter, 10% -20% monocytter og et begrænset antal dendritiske celler (DC'er, 1% -2%)3. PBMC'er har antigenpræsenterende celler (APC'er) såsom B-celler, monocytter og DC'er, som konstant patruljerer organismen på udkig efter tegn på infektion eller vævsskade. Lokalt udskillede kemokiner letter rekruttering og aktivering af APC'er til disse steder ved at binde til celleoverfladereceptorer. I tilfælde af monocytter styrer kemokiner deres skæbne til enten at differentiere sig til DC'er eller makrofager4. Så snart DC'er støder på og fanger et patogen, migrerer de til sekundære lymfoide organer, hvor de kan præsentere de forarbejdede patogenpeptidantigener ved hjælp af større histokompatibilitetskompleks (MHC) klasse I eller klasse II overfladeproteiner til henholdsvis CD8 + T-celler eller CD4 + T-celler, hvilket udløser et immunrespons 5,6.
DC'ernes nøglerolle i orkestrering af et beskyttende immunrespons mod forskellige patogener gør dem til et interessant forskningsmål for forståelse af intracellulære immunmekanismer, især når man designer vacciner og adjuvanser mod infektiøse agenser7. Da fraktionen af DC'er, der kan opnås fra PBMC'er, er ret lille (1% -2%), er monocytter i stedet blevet brugt til at generere DC'er in vitro8. Disse monocytafledte DC'er (MoDC'er) blev oprindeligt udviklet som en mulig behandlingsstrategi i kræftimmunterapi9. For nylig er MoDC'er blevet brugt til vaccineforskning 10,11,12, og klassiske monocytter er den dominerende undertype (89%) til MoDC-produktion 13. Produktionen af MoDC'er in vitro er tidligere opnået ved tilsætning af granulocyt-makrofagkolonistimulerende faktor (GM-CSF) givet i kombination med andre cytokiner såsom interleukin-4 (IL-4), tumornekrosefaktor α (TNF-α) eller IL-1314,15,16.
Succesen med et in vitro MoDC-assay afhænger af antigenstimulerede modne MoDC'ers evne til at modulere omfanget og typen af immunresponset, der er specifikt for den type antigen, der detekteres17. Den type patogen, der genkendes og præsenteres af MoDC'er, bestemmer differentieringen af CD4 + T-hjælperceller (Th) i enten Th1-, Th2- eller Th17-effektorceller og er kendetegnet ved en patogenspecifik sekretorisk cytokinprofil. Et Th1-respons fremkaldes mod intracellulære patogener og resulterer i udskillelsen af interferon-gamma (IFN-γ) og tumornekrosefaktor beta (TNF-β), som modulerer fagocytisk afhængig beskyttelse. Et Th2-respons udløses mod parasitære organismer og er kendetegnet ved IL-4, IL-5, IL-10 og IL-13-sekretion, som initierer fagocytisk uafhængig humoral beskyttelse. Th17 tilbyder neutrofilafhængig beskyttelse mod ekstracellulære bakterie- og svampeinfektioner medieret af sekretionen af IL-17, IL-17F, IL-6, IL-22 og TNF-α 18,19,20,21. Baseret på tidligere undersøgelser er det blevet bemærket, at ikke alle patogener falder inden for den forventede cytokinprofil. For eksempel stimulerer dermale MoDC'er som reaktion på Leishmania parasitisk infektion IFN-γ sekretion fra CD4 + T-celler og CD8 + T-celler og inducerer således et beskyttende proinflammatorisk Th1-respons22.
Det har også vist sig, at MoDC'er fra kyllinger, der er primet med Salmonella lipopolysaccharid (LPS), kan fremkalde en variabel respons mod Salmonella typhimurium ved at aktivere både Th1- og Th2-responser, mens Salmonella gallinarum inducerer et Th2-respons alene, hvilket kan forklare sidstnævntes højere resistens over for MoDC-clearance23. Aktivering af MoDC'er mod Brucella canis (B. canis) er også blevet rapporteret hos både hunde og humane MoDC'er, hvilket betyder, at dette kan repræsentere en zoonotisk infektionsmekanisme24. Humane MoDC'er, der er primet med B. canis, inducerer et stærkt Th1-respons, der giver resistens over for alvorlig infektion, mens hunde-MoDC'er inducerer et dominerende Th17-respons med et reduceret Th1-respons, hvilket efterfølgende fører til etablering af kronisk infektion25. Bovin MoDC'er viser en øget affinitet for mund- og klovesygevirus (FMDV) konjugeret med immunoglobulin G (IgG) sammenlignet med ikke-konjugeret mund- og klovesyge alene, da MoDC'erne danner et viralt antistofkompleks som reaktion på de tidligere10. Samlet set viser disse undersøgelser, hvordan MoDC'er er blevet brugt til at analysere kompleksiteten af immunresponser under patogeninfektion. De adaptive immunresponser kan evalueres ved kvantificering af specifikke markører forbundet med lymfocytproliferation. Ki-67, et intracellulært protein, der kun påvises i delende celler, betragtes som en pålidelig markør for spredningsundersøgelser26, og tilsvarende svarer CD25 udtrykt på overfladen af T-celler i den sene aktiveringsfase til lymfocytproliferation27,28.
Denne undersøgelse demonstrerer en standardiseret metode til in vitro-generering af kvæg-MoDC'er efterfulgt af deres anvendelse i et in vitro-immunassay, der anvendes til test af vacciners immunogenicitet. En kommercielt tilgængelig rabiesvaccine (RV) blev brugt til at validere effektiviteten af dette assay. T-lymfocytaktivering og proliferation blev målt ved flowcytometri, kvantitativ polymerasekædereaktion i realtid (qPCR) og enzymbundet immunosorbentassay (ELISA) gennem analyse af veletablerede celleaktiveringsmarkører såsom Ki-67 og CD25 og sekretion af IFN-γ 28,29,30,31. Der udføres ingen eksperimentelle dyre- eller humane forsøg under MoDC-assayet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher</td>
			<td>A1049201</td>
			<td>Ammonium-Chloride-Potassium buffer for lysis of residual RBCs in harvested PBMC Fraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Heparin Tubes</td>
			<td>Becton, Dickinson (BD) and Company</td>
			<td>366480</td>
			<td>10 mL, additive sodium heparin 158 USP units, glass tube, 16 x 100 mm size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Dendritic Cell Growth Kit</td>
			<td>Bio-Rad, UK</td>
			<td>PBP015KZZ</td>
			<td>Cytokine cocktail composed of recombinant bovine IL-4 and GM-CSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine IFN-&#947; ELISA Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA5638KZZ</td>
			<td>Kit use for measuring IFN-&#947; expression in culture supernatant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA2678F</td>
			<td>Mouse anti-bovine CD14 monoclonal antibody, clone CC-G33, isotype IgG1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD25 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA2430PE</td>
			<td>Mouse anti bovine CD25 monoclonal antibody, clone IL-A11, isotype IgG1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA1653A647</td>
			<td>Mouse anti bovine CD4 monoclonal antibody, clone CC8, isotype IgG2a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD40 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA2431F</td>
			<td>Mouse anti-bovine CD40 monoclonal antibody, clone IL-A156, isotype IgG1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA837F</td>
			<td>Mouse anti bovine CD8 monoclonal antibody, clone CC63, isotype IgG2a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD86 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA2437PE</td>
			<td>Mouse anti-bovine CD86 monoclonal antibody, clone IL-A190, isotype IgG1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>-</td>
			<td>Thermal cycler PCR machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Centrifuge Tube</td>
			<td>Falcon Corning&#160;</td>
			<td>352096 &#38; 352070</td>
			<td>15 mL and 50 mL, high-clarity poypropylene conical bottom, graduated, sterial, seal screw cap, falcon tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix/Cytoperm Plus</td>
			<td>BD Bio Sciences</td>
			<td>555028</td>
			<td>Fixation/permeabilization kit with BD golgiPlug, use for flow cytometer cell staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1009832500</td>
			<td>Absolute for analysis EMSURE&#160;ACS,ISO, Reag. Ph Eur</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher</td>
			<td>10500064</td>
			<td>Qualified, heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll Plaque PLUS</td>
			<td>GE Health care Life Sciences, USA</td>
			<td>341691</td>
			<td>Lymphocyte-isolation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowClean Cleaning Agent</td>
			<td>Beckman Coulter, Life Sciences</td>
			<td>A64669</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>FlowJo, Becton, Dickinson (BD) and Company, LLC, USA</td>
			<td>-</td>
			<td>Flow cytometer Histogram software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowTubes/ FACS&#160; (Fluorescence-activated single-cell sorting) Tube</td>
			<td>Falcon Corning&#160;</td>
			<td>352235</td>
			<td>5 mL, sterial, round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap, use in flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresceinisothiocynat-Dextran</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>60842-46-8</td>
			<td>FITC-dextran MW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallios Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>-</td>
			<td>Flow cytometer machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard-Shell 96-Well PCR Plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSP9601</td>
			<td>96 well, low profile, thin wall, skirted, white/clear</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human CD14 MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi Bioteck, Germany</td>
			<td>130-050-201</td>
			<td>2 mL microbeads conjugated to monoclonal anti-human CD14 antibody isotype IgG2a, used for selection of bovine monocytes from PBMCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaluza</td>
			<td>Beckman Coulter, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>Flow cytometer multicolor data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Column</td>
			<td>Miltenyi Bioteck, Germany</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Magnetic activated cell sorting or immune magentic cell separation colum for separation of various CD14 cell population based on cell surface antigens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC Class II DQ DR Polymorphic Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA2228F</td>
			<td>Mouse anti-sheep MHC Class II DQ DR Polymorphic:FITC, clone 49.1, isotype IgG2a, cross reactive with bovine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>HS4325</td>
			<td>1.5 mL, conical bottom, graduated, sterial tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Power Point</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>-</td>
			<td>The graphical illustrations of experimental design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 Negative Control:FITC for CD14, CD40 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA928F</td>
			<td>Isotype control CD14 and CD40 monoclonal antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 Negative Control:PE for CD86 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA928PE</td>
			<td>Isotype control CD86 monoclonal antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 Negative Control:RPE for CD25 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA928PE</td>
			<td>Isotype control CD25 monoclonal antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG2a Negative Control:FITC for MHC Class II Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA929F</td>
			<td>Isotype control for MHC class II monoclonal antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nobivac Rabies</td>
			<td>MSD Animal Health, UK</td>
			<td>-</td>
			<td>1 &#181;L/mL of cell cultured inactivated vaccine containing &#62; 2 I.U./mL Rabies virus strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical seals</td>
			<td>Bi0-Rad</td>
			<td>TCS0803</td>
			<td>0.2 mL flat PCR tube 8-cap strips, optical, ultraclear, compatible for qPCR machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td>pH 7.4, 1x concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism - GraphPad 5 Software&#160;</td>
			<td>Dotmatics</td>
			<td>-</td>
			<td>Statistical software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Anti-human Ki-67 antibody</td>
			<td>Biolegend, USA</td>
			<td>350501</td>
			<td>Monoclonal antibody, cross reactive with cow, clone ki-67</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Mouse IgG1 k Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>400101</td>
			<td>Isotype control for Ki-67 monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>READIDROP Propidium Iodide</td>
			<td>BD Bio Sciences</td>
			<td>1351101</td>
			<td>Live/dead cell marker used for flow cytometry, amine reactive dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-2 Protein</td>
			<td>R&#38;D System, USA</td>
			<td>202-IL-010/CF</td>
			<td>Interleukin-2, 20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74106</td>
			<td>Kit use for extraction of total RNA; RLT buffer = lysis buffer; RW1 buffer = stringent guanidine-containing washing buffer; RDD buffer = DNase buffer; RPE buffer = mild wash buffer; RNaseOUT = RNase inhibitor.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td>Cell culture media with L-glutamine and sodium bicarbonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMART-servier medical art&#160;</td>
			<td>Les Laboratories Servier</td>
			<td>-</td>
			<td>Licensed under a creative commons attribution 3.0 unported license</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>172-5270</td>
			<td>2x qPCR mix conatins dNTPs, Ss07d fusion polymerase, MgCl2, SYBR Green I supermix = supermix, ROX normalization dyes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III First-Strand Synthesis System</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher</td>
			<td>18080051</td>
			<td>Kit for cDNA synthsis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Test plate 24</td>
			<td>TPP, Switzerland</td>
			<td>92024</td>
			<td>24 well plate, sterilized by radiation , growth enhanced treated, volume 3.18 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher</td>
			<td>15250061</td>
			<td>0.4%, 100 mL, dye to assess cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher</td>
			<td>10977023</td>
			<td>0.1 &#181;m membrane filtered distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15206067</td>
			<td>VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes have a green top and contain spray-dried lithium, sodium or ammonium heparin on the inner walls and are usedin clinical chemistry, immunology and serology. The anticoagulant heparin activates antithrombin, which blocks the clotting cascade and thus produces a whole blood/plasma sample.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W3500-1L</td>
			<td>Sterile-filtered, bioReagent suitable for cell culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of vaccine immunogenicity using bovine monocyte-derived dendritic cells

Dendritiske celler (DC'er) er de mest potente antigenpræsenterende celler (APC'er) i immunsystemet. De patruljerer organismen på udkig efter patogener og spiller en unik rolle i immunsystemet ved at forbinde de medfødte og adaptive immunresponser. Disse celler kan fagocytisere og derefter præsentere fangede antigener til effektorimmunceller, hvilket udløser en bred vifte af immunresponser. Dette papir demonstrerer en standardiseret metode til in vitro-generering af bovin monocytafledte dendritiske celler (MoDC'er) isoleret fra mononukleære celler i kvægperifert blod (PBMC'er) og deres anvendelse til evaluering af vaccineimmunogenicitet.
Magnetisk baseret cellesortering blev brugt til at isolere CD14+ monocytter fra PBMC'er, og tilskud af komplet dyrkningsmedium med interleukin (IL)-4 og granulocyt-makrofagkolonistimulerende faktor (GM-CSF) blev anvendt til at inducere differentieringen af CD14+ monocytter til naive MoDC'er. Genereringen af umodne MoDC'er blev bekræftet ved at detektere ekspressionen af større histokompatibilitetskompleks II (MHC II), CD86 og CD40 celleoverflademarkører. En kommercielt tilgængelig rabiesvaccine blev brugt til at pulsere de umodne MoDC'er, som efterfølgende blev dyrket sammen med naive lymfocytter.
Flowcytometrianalysen af de antigenpulserede MoDC'er og lymfocytcokulturen afslørede stimuleringen af T-lymfocytproliferation gennem ekspression af Ki-67-, CD25-, CD4- og CD8-markører. Analysen af mRNA-ekspressionen af IFN-γ og Ki-67 ved anvendelse af kvantitativ PCR viste, at MoDC'erne kunne inducere antigenspecifik priming af lymfocytter i dette in vitro-cokultursystem . Desuden viste IFN-γ-sekretion vurderet ved hjælp af ELISA en signifikant højere titer (**p < 0,01) i rabiesvaccine-pulseret MoDC-lymfocyt-cokultur end i den ikke-antigenpulserede MoDC-lymfocyt-cokultur. Disse resultater viser validiteten af dette in vitro MoDC-assay til måling af vaccineimmunogenicitet, hvilket betyder, at dette assay kan bruges til at identificere potentielle vaccinekandidater til kvæg, inden der fortsættes med in vivo-forsøg , samt i vaccineimmunogenicitetsvurderinger af kommercielle vacciner.

Denne metode beskriver in vitro-generering af MoDC'er fra kvæg til evaluering af kandidatvaccineantigener forud for in vivo-undersøgelser. Figur 1 illustrerer forsøgsplanen for frembringelse af MoDC hos kvæg og anvendelsen af MoDC'erne til in vitro-assayet. Ved hjælp af den magnetisk baserede cellesorteringsteknik var det muligt at indsamle ca. 26 millioner CD14+ myocytter fra de høstede PBMC'er, som tidligere var isoleret fra 50 ml kvægblod. Den ...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells at JoVE.com

Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells

Metoden beskriver dannelsen af bovin monocytafledte dendritiske celler (MoDC'er) og deres anvendelse til in vitro-evaluering af antigenkandidater under udviklingen af potentielle veterinærvacciner hos kvæg.

Bestemmelse af vaccineimmunogenicitet under anvendelse af bovin monocytafledte dendritiske celler

Dendritic cells (DCs) are the most potent antigen-presenting cells (APCs) within the immune system. They patrol the organism looking for pathogens and ...

Denne protokol repræsenterer et funktionelt in vitro-assay, hvor bovin monocytafledte dendritiske celler anvendes til måling af vaccineimmunogenicitet forud for in vivo-undersøgelser. Derfor udfylder et eksisterende hul i husdyrvaccinologi. Det er generering og anvendelse af dendritiske celler.Som de mest potente antigenpræsenterende celler er dendritiske celler blevet et centralt forskningsmål for forståelse af intracellulære immunmekanismer, herunder vaccineeffektivitet. Dette assay kan implementeres som et værktøj til screening af vaccinekandidater, som en kvalitetskontroltilstand til vaccineproduktion og til valg af antigen og adjuvans. Demonstration af proceduren vil være Richard Kangethe, forsker i dyreproduktions- og sundhedslaboratoriet.Begynd med at invertere og blande blodet opnået fra kalvens jugular venepunktur med hepariniserede vacutainere. Overfør derefter 20 ml hepariniseret blod til et sterilt 50 ml rør og fortynd det med 10 ml fosfatbufret saltvand eller PBS. Pipette 15 ml lymfocytisoleringsmedium til et sterilt 50 ml rør og vip røret til en 45 graders position.Lag forsigtigt 30 ml PBS-medium i blodet oven på lymfocytisoleringen ved hjælp af en 25 ml pipette og returner langsomt røret til lodret position, før det centrifugeres. Derefter samles det tynde hvide lag af mononukleære celler i perifert blod eller PBMC-lag ved hjælp af en Pasteur-pipette og overføres til et nyt 50 ml rør. Vask de høstede PBMC'er to gange med 40 ml PBS pr. vask og bland det grundigt.Efter centrifugering resuspenderes pelleten i 15 ml ammoniumchloridkaliumbuffer eller ACK-buffer. Efter 10 til 15 minutters inkubation ved stuetemperatur tilsættes op til 40 ml PBS og centrifugeres røret med maksimal acceleration og deceleration. Resuspender pellet i 10 ml komplet dyrkningsmedium.Derefter tilsættes fem mikroliter CD14 MicroBead-buffer pr. 10 millioner celler og blandes grundigt ved hjælp af en pipette. Til flowcytometrianalyse tilsættes 10 mikroliter CD14-fluoresceinisothiocyanat eller FITC-farvningsantistof mod PBMC'erne og inkuberes i 15 minutter ved fire til otte grader Celsius, inden du fortsætter med flowcytometrien. Til de ubejdsede PBMC'er tilsættes en milliliter faxbuffer og centrifugeres i syv minutter ved 500 g og fire grader Celsius.Derefter resuspenderes pellet i 500 mikroliter faxbuffer pr. 100 millioner celler. Indsæt derefter den immunomagnetiske celleseparationskolonne i separatoren og anbring et 50 ml opsamlingsrør under søjleudløbet til opsamling af gennemstrømningen. Efter vask af kolonnen med en milliliter afgasset faxbuffer skal du udskifte det brugte 15 ml rør med et nyt.Pipette hundrede millioner celler i 500 mikroliter buffer ad gangen, så cellesuspensionen kan passere gennem søjlen. Skyl derefter kolonnen tre gange med tre ml afgasset faxbuffer hver gang. Efter opsamling af gennemstrømningen mærkes den første eluerede naive lymfocytfraktion som den CD14-negative cellefraktion.Fjern søjlen fra separatoren, og anbring et nyt sterilt 15 ml rør under søjlen til spildevandsopsamlingen. Tilsæt fem milliliter faxbuffer i kolonnen, og skub den straks igennem ved hjælp af stemplet. Saml og mærk den anden gennemstrømning eller den naive monocytfraktion som den CD14-positive cellefraktion.Tilsæt komplet dyrkningsmedium til de høstede CD14-positive monocytter for at opnå 1 million celler pr. Milliliter. Derefter tilsættes en milliliter cellesuspension til hver brønd i en steril 24-brøndplade, inden hver brønd suppleres med 40 mikroliter cytokincocktail, der leveres i sættet. På dag to overføres halvdelen af hvert huls indhold til individuelle 1,5 ml rør ved hjælp af en pipette.Efter centrifugering af 1,5 ml-glassene ved 500 g i syv minutter kasseres supernatanten, og pelleten resuspenderes i 500 mikroliter frisk, komplet dyrkningsmedium. Overfør 500 mikroliter af denne resuspenderede cellesuspension tilbage til de tilsvarende brønde, så det endelige volumen i brønden bliver en milliliter. Berig hver brønd med 20 mikroliter cytokincocktail.For at generere antigenpulserede MoDC'er tilsættes en mikroliter pr. milliliter rabiesvirusvaccine eller RV-suspension til en milliliter naiv MoDC-kultur i 24-brøndpladen og inkuberer pladen i 48 timer ved 5% kuldioxid og 37 grader Celsius. På dag syv skal du opbevare pladen med 24 brønde, der indeholder de antigenpulserede MoDC'er, på is i 10 minutter, før du tilsætter en milliliter iskold PBS pr. Brønd og blander den grundigt. Overfør suspensionen til et 15 ml rør.Vask brøndene med to ml iskold PBS. Opsaml de resterende celler i hver brønd og overfør det vaskede indhold til deres respektive rør. Centrifuger cellesuspensionen ved 500 g i syv minutter.Efter kassering af supernatanten resuspenderes den antigenpulserede MoDCs cellepellet i et komplet dyrkningsmedium for at justere den endelige koncentration på 100.000 celler pr. Ml. Til MoDC-lymfocyt-co-kultur frø brøndene i en steril 24-brøndplade med en milliliter af den naive lymfocytcellesuspension og en milliliter antigenpulseret eller ikke-antigenpulseret MoDC-suspension på antigenpulsens syvende dag. Efter to dages inkubation suppleres hver brønd med 20 nanogram pr. Milliliter rekombinant interleukin-2 og fortsætter inkubationen i yderligere 120 timer.På dag 14 overføres en milliliter af cokulturen til et sterilt 1,5 ml rør og centrifugeres røret. Derefter resuspenderes cellepillen med en milliliter antigenpulserede eller ikke-pulserende MoDC'er. Bland godt og overfør cellesuspensionerne til deres tilsvarende brønde.Efter celleoverfladefarvning af PBMC'erne og naive lymfocytter og monocytter overføres en milliliter af cellesuspensionen til et sterilt 1,5 ml rør ved hjælp af en pipette og centrifugeres i 10 minutter ved 500 g. Derefter resuspenderes pelleten i en milliliter PBS og overføres til et 15 ml rør. Opsaml også de resterende celler og de tilsvarende rør ved hjælp af en milliliter PBS.Derefter tilsættes 10 ml PBS til 15 ml røret indeholdende cellerne og blandes ved pipettering. Efter centrifugering af røret i syv minutter ved 850 g fjernes supernatanten, og cellepelleten resuspenderes forsigtigt med resterende suspension, der er tilbage efter dekantering af supernatanten. Overfør cellesuspensionen til en V-bundplade med 96 brønde, og forsegl brøndene for at undgå spild.Når farvningen er afsluttet, skal du udføre flowcytometeranalysen. Fra forhåndsvisningen i realtid skal du justere tærsklen for fluorescens inklusive spænding og forstærkning og cellestørrelse for til sidst at tegne porte omkring den ønskede cellepopulation, mens du udelukker cellulært affald. CD14-cellefarvning og flowcytometri viste, at den naive monocytfraktion omfattede 98% CD14-positive monocytceller og funktionelt var i stand til antigenoptagelse.De naive MoDCs fænotypisk karakteriseret ved at vurdere ekspressionen af MHC klasse 2 og co-stimulerende CD86 og CD40 celleoverflademarkører validerede dendritiske celler eller DC-lignende fænotype. Under MoDC-lymfocyt-cokulturen på dag ni blev der observeret en morfologisk ændring, der viste dendritforlængelse i RV-pulsen til MoDC'er. Sammenlignet med den ikke-pulserende MoDC-lymfocytkultur blev en signifikant stigning i lymfocytproliferation demonstreret ved opregulering af Ki67- og CD25-aktiveringsmarkørerne på CD4-positive og CD8-positive T-celler på dag 16 i den pulserende MoDC-lymfocyt-cokultur.De CD8-positive T-celler fra de modne RV-pulserede MoDC-cokulturer udviste en ottedobbelt opregulering af Ki67 sammenlignet med den ikke-specifikke gruppe. De CD4-positive celler i samme co-kultur viste en syv gange stigning i Ki67 sammenlignet med kontroller, hvilket demonstrerede RV-primede MoDC'ers evne til at præsentere RV-antigenet for naive lymfocytter og aktivere dem i en in vitro-tilstand. qPCR-kvantificeringen af co-kulturer viste mere end 30% stigning i interferon gamma-ekspression og mere end 5% stigning i Ki67-ekspression i alle co-kulturer ved hjælp af GAPDH som kalibrator.En signifikant højere koncentration af udskilt interferon gamma blev observeret i RV pulserende MoDC lymfocyt co-kultur sammenlignet med den ikke-specifikke behandlingsgruppe. Udfør lagdelingstrinnet meget langsomt og omhyggeligt, og sørg for, at blod lægges oven på lymfocytisoleringsmediet. Vær ekstra omhyggelig med at samle alle PBMC'er uden at indsamle for meget materiale fra de andre lag.Andre metoder såsom flowcytometri, ELISA og kvantitativ PCR kan blandt andet anvendes efter denne procedure til at evaluere aktiveringen af immunmarkører.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Isolering af Mouse Lung dendritiske celler

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells

Generation af en ny dendritisk-celle vaccine ved hjælp af melanom og squamous cancer stamceller

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H ...

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â² in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Aktivering og måling af NLRP3 Inflammasome Aktivitet hjælp af IL-1β i Human monocytafledte dendritiske celler

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Dyrkning af makrofag kolonistimulerende faktor differentierede humane monocytafledte makrofager

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

Karakterisering af Humane monocytafledte dendritiske celler fra Imaging flowcytometri: en sammenligning mellem to Monocyt Isolation protokoller

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Generation of Human monocytafledte dendritiske celler fra fuldblod

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

Udvikling og validering af et Ultrasensitive enkelt molekyle Array Digital enzym-forbundet Immunosorbent Assay for menneskelige Interferon-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

siRNA Electroporation to Modulate Autophagy in Herpes Simplex Virus Type 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells

siRNA elektroporation at Modutere Autophagy i herpes simplex virus type 1-inficerede Monocyte-afledte dendritiske celler

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) induces autophagy in both, immature dendritic cells (iDCs) as well as mature dendritic cells (mDCs), whereas ...

In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

In vitro stimulation og visualisering af ekstracellulær fælde frigivelse i differentierede humane monocytter-afledte makrofager

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic ...

Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages

Visualisering af inflammatorisk caspases induceret nærhed i humane monocytafledte makrofager

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct ...