Name: determination of vaccine immunogenicity using bovine monocyte-derived dendritic cells
Uploaded: 2023-05-19T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells at JoVE.com

We danken Dr. Eveline Wodak en Dr. Angelika Loistch (AGES) voor hun steun bij het bepalen van de gezondheidsstatus van de dieren en voor het verstrekken van BTV, Dr. Bernhard Reinelt voor het verstrekken van runderbloed en Dr. Bharani Settypalli en Dr. William Dundon van de IAEA voor nuttig advies over respectievelijk de real-time PCR-experimenten en taalbewerking.

Bloedafname wordt uitgevoerd door een gecertificeerde dierenarts in overeenstemming met de ethische richtlijnen van het Oostenrijkse Agentschap voor Gezondheid en Voedselveiligheid (AGES) en in overeenstemming met de geaccepteerde dierenwelzijnsnormen32. De studie kreeg ethische goedkeuring van het Oostenrijkse ministerie van Landbouw. Het experimentele ontwerp voor het genereren van MoDC's en de daaropvolgende toepassing ervan wordt geïllustreerd in figuur 1.
<p...

Deze studie toont een gestandaardiseerde in vitro methode voor het genereren en fenotyperen van boviene MoDC's en hun daaropvolgende gebruik bij het meten van de vaccinimmunogeniciteit van een commercieel vaccin (bijv. RV). Runder-MoDC's kunnen worden gebruikt als een hulpmiddel voor het screenen van potentiële vaccinantigenen tegen veeziekten en het voorspellen van hun potentiële klinische impact op basis van immuunresponsen voordat wordt overgegaan tot in vivo dierproeven. De gegenereerde MoDC's wer...

Veterinaire vaccinatie is een cruciaal aspect van de veehouderij en gezondheid, omdat het bijdraagt aan het verbeteren van de voedselzekerheid en het dierenwelzijn door bescherming te bieden tegen ziekten die de veehouderij wereldwijd treffen1. Een effectieve in vitro methode om de immunogeniciteit van mogelijke vaccinkandidaten te beoordelen, zou het proces van vaccinontwikkeling en -productie helpen versnellen. Het is daarom noodzakelijk om het veld van immuuntesten uit te breiden met innovatieve methodologieën op basis van in vitro studies, omdat dit zou helpen om de complexiteit van de immuunprocessen met betrekking tot immunisatie en pathogene infectie te onthullen. Momenteel worden in vivo immunisatie- en challengestudies bij dieren, die periodieke bemonstering vereisen (bijv. Bloed en milt), gebruikt om de immunogeniciteit van kandidaat-vaccins en adjuvantia te meten. Deze testen zijn duur, tijdrovend en hebben ethische implicaties, omdat in de meeste gevallen euthanasie bij dieren wordt uitgevoerd aan het einde van de proeven.
Als alternatief voor in vivo assays zijn perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) gebruikt om vaccin-geïnduceerde immuunresponsen in vitrote evalueren 2. PBMC's zijn een heterogene populatie van cellen die bestaat uit 70% -90% lymfocyten, 10% -20% monocyten en een beperkt aantal dendritische cellen (DC's, 1% -2%)3. PBMC's herbergen antigeen-presenterende cellen (APC's) zoals B-cellen, monocyten en DC's, die voortdurend patrouilleren in het organisme op zoek naar tekenen van infectie of weefselbeschadiging. Lokaal uitgescheiden chemokines vergemakkelijken de rekrutering en activering van APC's naar deze plaatsen door zich te binden aan celoppervlakreceptoren. In het geval van monocyten richten chemokines hun lot om te differentiëren in DC's of macrofagen4. Zodra DC's een pathogeen tegenkomen en vangen, migreren ze naar secundaire lymfoïde organen, waar ze de verwerkte pathogene peptide-antigenen kunnen presenteren met behulp van major histocompatibility complex (MHC) klasse I of klasse II oppervlakte-eiwitten aan respectievelijk CD8 + T-cellen of CD4 + T-cellen, waardoor een immuunrespons 5,6 wordt geactiveerd.
De sleutelrol die DC's spelen bij het orkestreren van een beschermende immuunrespons tegen verschillende pathogenen maakt ze een interessant onderzoeksdoel voor het begrijpen van intracellulaire immuunmechanismen, vooral bij het ontwerpen van vaccins en adjuvantia tegen infectieuze agentia7. Aangezien de fractie van DC's die kan worden verkregen uit PBMC's vrij klein is (1%-2%), zijn monocyten in plaats daarvan gebruikt om DC's in vitro8 te genereren. Deze van monocyten afgeleide DC's (MoDC's) werden aanvankelijk ontwikkeld als een mogelijke behandelingsstrategie in kankerimmunotherapie9. Meer recent zijn MoDC's gebruikt voor vaccinonderzoek 10,11,12, en klassieke monocyten zijn het overheersende subtype (89%) voor MoDC-productie 13. De productie van MoDC's in vitro is eerder bereikt door de toevoeging van granulocyt-macrofaag koloniestimulerende factor (GM-CSF) gegeven in combinatie met andere cytokines zoals interleukine-4 (IL-4), tumornecrosefactor α (TNF-α) of IL-1314,15,16.
Het succes van een in vitro MoDC-test is afhankelijk van het vermogen van antigeen-gestimuleerde volwassen MoDC's om de omvang en het type van de immuunrespons te moduleren die specifiek zijn voor het type antigeen dat is gedetecteerd17. Het type pathogeen dat door MoDC's wordt herkend en gepresenteerd, bepaalt de differentiatie van CD4 + T-helper (Th) -cellen in Th1-, Th2- of Th17-effectorcellen en wordt gekenmerkt door een pathogeenspecifiek secretoir cytokineprofiel. Een Th1-respons wordt opgewekt tegen intracellulaire pathogenen en resulteert in de secretie van interferon-gamma (IFN-γ) en tumornecrosefactor bèta (TNF-β), die fagocytisch-afhankelijke bescherming moduleert. Een Th2-respons wordt geactiveerd tegen parasitaire organismen en wordt gekenmerkt door IL-4, IL-5, IL-10 en IL-13-secretie, die fagocytisch-onafhankelijke humorale bescherming initieert. Th17 biedt neutrofielafhankelijke bescherming tegen extracellulaire bacteriële en schimmelinfecties gemedieerd door de secretie van IL-17, IL-17F, IL-6, IL-22 en TNF-α 18,19,20,21. Op basis van eerdere studies is opgemerkt dat niet alle pathogenen binnen het verwachte cytokineprofiel vallen. Dermale MoDC's stimuleren bijvoorbeeld, als reactie op leishmania parasitaire infectie, IFN-γ secretie van CD4 + T-cellen en CD8 + T-cellen, waardoor een beschermende pro-inflammatoire Th1-respons wordt geïnduceerd22.
Het is ook aangetoond dat MoDC's bij kippen die zijn geprimed met Salmonella lipopolysaccharide (LPS), een variabele respons tegen Salmonella typhimurium kunnen induceren door zowel Th1- als Th2-responsen te activeren, terwijl Salmonella gallinarum alleen een Th2-respons induceert, wat de hogere weerstand van de laatste tegen MoDC-klaring23 zou kunnen verklaren. De activering van MoDC's tegen Brucella canis (B. canis) is ook gemeld in zowel honden- als menselijke MoDC's, wat betekent dat dit een zoönotisch infectiemechanisme kan vertegenwoordigen24. Menselijke MoDC's geprimed met B. canis induceren een sterke Th1-respons die weerstand biedt tegen ernstige infectie, terwijl Canine MoDC's een dominante Th17-respons induceren met een verminderde Th1-respons, wat vervolgens leidt tot de oprichting van chronische infectie25. Runder-MoDC's vertonen een verhoogde affiniteit voor mond- en klauwzeervirus (FMDV) geconjugeerd met immunoglobuline G (IgG) in vergelijking met niet-geconjugeerde FMDV alleen, aangezien de MoDC's een viraal antilichaamcomplex vormen als reactie op de eerste10. Samen laten deze studies zien hoe MoDC's zijn gebruikt om de complexiteit van immuunresponsen tijdens pathogene infectie te analyseren. De adaptieve immuunresponsen kunnen worden geëvalueerd door de kwantificering van specifieke markers geassocieerd met lymfocytenproliferatie. Ki-67, een intracellulair eiwit dat alleen in delende cellen wordt gedetecteerd, wordt beschouwd als een betrouwbare marker voor proliferatiestudies26, en evenzo komt CD25 uitgedrukt op het oppervlak van T-cellen tijdens de late fase van activering overeen met lymfocytenproliferatie27,28.
Deze studie toont een gestandaardiseerde methode voor de in vitro generatie van runder-MoDC's, gevolgd door hun toepassing in een in vitro immuuntest die wordt gebruikt voor het testen van de immunogeniciteit van vaccins. Een in de handel verkrijgbaar rabiësvaccin (RV) werd gebruikt om de werkzaamheid van deze test te valideren. T-lymfocytenactivatie en -proliferatie werden gemeten door flowcytometrie, real-time kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR) en enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) door de analyse van gevestigde celactivatiemarkers zoals Ki-67 en CD25 en de secretie van IFN-γ 28,29,30,31. Er worden geen dier- of menselijke experimentele proeven uitgevoerd tijdens de MoDC-test.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher</td>
			<td>A1049201</td>
			<td>Ammonium-Chloride-Potassium buffer for lysis of residual RBCs in harvested PBMC Fraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Heparin Tubes</td>
			<td>Becton, Dickinson (BD) and Company</td>
			<td>366480</td>
			<td>10 mL, additive sodium heparin 158 USP units, glass tube, 16 x 100 mm size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Dendritic Cell Growth Kit</td>
			<td>Bio-Rad, UK</td>
			<td>PBP015KZZ</td>
			<td>Cytokine cocktail composed of recombinant bovine IL-4 and GM-CSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine IFN-&#947; ELISA Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA5638KZZ</td>
			<td>Kit use for measuring IFN-&#947; expression in culture supernatant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA2678F</td>
			<td>Mouse anti-bovine CD14 monoclonal antibody, clone CC-G33, isotype IgG1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD25 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA2430PE</td>
			<td>Mouse anti bovine CD25 monoclonal antibody, clone IL-A11, isotype IgG1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA1653A647</td>
			<td>Mouse anti bovine CD4 monoclonal antibody, clone CC8, isotype IgG2a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD40 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA2431F</td>
			<td>Mouse anti-bovine CD40 monoclonal antibody, clone IL-A156, isotype IgG1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA837F</td>
			<td>Mouse anti bovine CD8 monoclonal antibody, clone CC63, isotype IgG2a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD86 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA2437PE</td>
			<td>Mouse anti-bovine CD86 monoclonal antibody, clone IL-A190, isotype IgG1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>-</td>
			<td>Thermal cycler PCR machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Centrifuge Tube</td>
			<td>Falcon Corning&#160;</td>
			<td>352096 &#38; 352070</td>
			<td>15 mL and 50 mL, high-clarity poypropylene conical bottom, graduated, sterial, seal screw cap, falcon tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix/Cytoperm Plus</td>
			<td>BD Bio Sciences</td>
			<td>555028</td>
			<td>Fixation/permeabilization kit with BD golgiPlug, use for flow cytometer cell staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1009832500</td>
			<td>Absolute for analysis EMSURE&#160;ACS,ISO, Reag. Ph Eur</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher</td>
			<td>10500064</td>
			<td>Qualified, heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll Plaque PLUS</td>
			<td>GE Health care Life Sciences, USA</td>
			<td>341691</td>
			<td>Lymphocyte-isolation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowClean Cleaning Agent</td>
			<td>Beckman Coulter, Life Sciences</td>
			<td>A64669</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>FlowJo, Becton, Dickinson (BD) and Company, LLC, USA</td>
			<td>-</td>
			<td>Flow cytometer Histogram software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowTubes/ FACS&#160; (Fluorescence-activated single-cell sorting) Tube</td>
			<td>Falcon Corning&#160;</td>
			<td>352235</td>
			<td>5 mL, sterial, round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap, use in flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresceinisothiocynat-Dextran</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>60842-46-8</td>
			<td>FITC-dextran MW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallios Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>-</td>
			<td>Flow cytometer machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard-Shell 96-Well PCR Plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSP9601</td>
			<td>96 well, low profile, thin wall, skirted, white/clear</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human CD14 MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi Bioteck, Germany</td>
			<td>130-050-201</td>
			<td>2 mL microbeads conjugated to monoclonal anti-human CD14 antibody isotype IgG2a, used for selection of bovine monocytes from PBMCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaluza</td>
			<td>Beckman Coulter, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>Flow cytometer multicolor data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Column</td>
			<td>Miltenyi Bioteck, Germany</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Magnetic activated cell sorting or immune magentic cell separation colum for separation of various CD14 cell population based on cell surface antigens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC Class II DQ DR Polymorphic Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA2228F</td>
			<td>Mouse anti-sheep MHC Class II DQ DR Polymorphic:FITC, clone 49.1, isotype IgG2a, cross reactive with bovine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>HS4325</td>
			<td>1.5 mL, conical bottom, graduated, sterial tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Power Point</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>-</td>
			<td>The graphical illustrations of experimental design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 Negative Control:FITC for CD14, CD40 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA928F</td>
			<td>Isotype control CD14 and CD40 monoclonal antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 Negative Control:PE for CD86 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA928PE</td>
			<td>Isotype control CD86 monoclonal antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 Negative Control:RPE for CD25 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA928PE</td>
			<td>Isotype control CD25 monoclonal antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG2a Negative Control:FITC for MHC Class II Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA929F</td>
			<td>Isotype control for MHC class II monoclonal antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nobivac Rabies</td>
			<td>MSD Animal Health, UK</td>
			<td>-</td>
			<td>1 &#181;L/mL of cell cultured inactivated vaccine containing &#62; 2 I.U./mL Rabies virus strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical seals</td>
			<td>Bi0-Rad</td>
			<td>TCS0803</td>
			<td>0.2 mL flat PCR tube 8-cap strips, optical, ultraclear, compatible for qPCR machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td>pH 7.4, 1x concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism - GraphPad 5 Software&#160;</td>
			<td>Dotmatics</td>
			<td>-</td>
			<td>Statistical software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Anti-human Ki-67 antibody</td>
			<td>Biolegend, USA</td>
			<td>350501</td>
			<td>Monoclonal antibody, cross reactive with cow, clone ki-67</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Mouse IgG1 k Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>400101</td>
			<td>Isotype control for Ki-67 monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>READIDROP Propidium Iodide</td>
			<td>BD Bio Sciences</td>
			<td>1351101</td>
			<td>Live/dead cell marker used for flow cytometry, amine reactive dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-2 Protein</td>
			<td>R&#38;D System, USA</td>
			<td>202-IL-010/CF</td>
			<td>Interleukin-2, 20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74106</td>
			<td>Kit use for extraction of total RNA; RLT buffer = lysis buffer; RW1 buffer = stringent guanidine-containing washing buffer; RDD buffer = DNase buffer; RPE buffer = mild wash buffer; RNaseOUT = RNase inhibitor.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td>Cell culture media with L-glutamine and sodium bicarbonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMART-servier medical art&#160;</td>
			<td>Les Laboratories Servier</td>
			<td>-</td>
			<td>Licensed under a creative commons attribution 3.0 unported license</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>172-5270</td>
			<td>2x qPCR mix conatins dNTPs, Ss07d fusion polymerase, MgCl2, SYBR Green I supermix = supermix, ROX normalization dyes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III First-Strand Synthesis System</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher</td>
			<td>18080051</td>
			<td>Kit for cDNA synthsis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Test plate 24</td>
			<td>TPP, Switzerland</td>
			<td>92024</td>
			<td>24 well plate, sterilized by radiation , growth enhanced treated, volume 3.18 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher</td>
			<td>15250061</td>
			<td>0.4%, 100 mL, dye to assess cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher</td>
			<td>10977023</td>
			<td>0.1 &#181;m membrane filtered distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15206067</td>
			<td>VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes have a green top and contain spray-dried lithium, sodium or ammonium heparin on the inner walls and are usedin clinical chemistry, immunology and serology. The anticoagulant heparin activates antithrombin, which blocks the clotting cascade and thus produces a whole blood/plasma sample.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W3500-1L</td>
			<td>Sterile-filtered, bioReagent suitable for cell culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of vaccine immunogenicity using bovine monocyte-derived dendritic cells

Dendritische cellen (DC's) zijn de krachtigste antigeen-presenterende cellen (APC's) binnen het immuunsysteem. Ze patrouilleren in het organisme op zoek naar ziekteverwekkers en spelen een unieke rol binnen het immuunsysteem door de aangeboren en adaptieve immuunresponsen te koppelen. Deze cellen kunnen fagocytiseren en vervolgens gevangen antigenen presenteren aan effector-immuuncellen, waardoor een breed scala aan immuunresponsen wordt geactiveerd. Dit artikel demonstreert een gestandaardiseerde methode voor de in vitro generatie van van runderen monocyten-afgeleide dendritische cellen (MoDC's) geïsoleerd uit perifere bloedmononucleaire cellen van runderen (PBMC's) en hun toepassing bij het evalueren van vaccinimmunogeniciteit.
Magnetische celsortering werd gebruikt om CD14+ monocyten uit PBMC's te isoleren, en de suppletie van compleet kweekmedium met interleukine (IL)-4 en granulocyt-macrofaag koloniestimulerende factor (GM-CSF) werd gebruikt om de differentiatie van CD14+ monocyten in naïeve MoDC's te induceren. De generatie van onrijpe MoDC's werd bevestigd door het detecteren van de expressie van belangrijke histocompatibiliteitscomplex II (MHC II), CD86 en CD40 celoppervlakmarkers. Een in de handel verkrijgbaar rabiësvaccin werd gebruikt om de onrijpe MoDC's te pulseren, die vervolgens samen met naïeve lymfocyten werden gekweekt.
De flowcytometrie-analyse van de antigeen-gepulseerde MoDC's en lymfocytenco-cultuur onthulde de stimulatie van T-lymfocytenproliferatie door de expressie van Ki-67-, CD25-, CD4- en CD8-markers. De analyse van de mRNA-expressie van IFN-γ en Ki-67, met behulp van kwantitatieve PCR, toonde aan dat de MoDC's de antigeenspecifieke priming van lymfocyten in dit in vitro co-cultuursysteem konden induceren. Bovendien toonde IFN-γ secretie beoordeeld met behulp van ELISA een significant hogere titer (**p < 0,01) in de rabiësvaccin-gepulseerde MoDC-lymfocytencocultuur dan in de niet-antigeen-gepulseerde MoDC-lymfocytencocultuur. Deze resultaten tonen de validiteit van deze in vitro MoDC-test om vaccinimmunogeniciteit te meten, wat betekent dat deze test kan worden gebruikt om potentiële vaccinkandidaten voor runderen te identificeren voordat wordt overgegaan tot in vivo onderzoeken, evenals in vaccinimmunogeniciteitsbeoordelingen van commerciële vaccins.

Deze methodologie beschrijft de in vitro generatie van runder-MoDC's voor de evaluatie van kandidaat-vaccinantigenen voorafgaand aan het uitvoeren van in vivo studies. Figuur 1 illustreert het experimentele schema van de productie van MoDC's bij runderen en de toepassing van de MoDC's voor de in vitro test. Met behulp van de magnetische celsorteertechniek was het mogelijk om ongeveer 26 miljoen CD14+ myocyten te verzamelen uit de geoogste PBMC's, die eer...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells at JoVE.com

Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells

De methodologie beschrijft de generatie van van boviene monocyten afgeleide dendritische cellen (MoDC's) en hun toepassing voor de in vitro evaluatie van antigene kandidaten tijdens de ontwikkeling van potentiële veterinaire vaccins bij runderen.

Bepaling van de immunogeniciteit van het vaccin met behulp van van runderen monocyten afgeleide dendritische cellen

Dendritic cells (DCs) are the most potent antigen-presenting cells (APCs) within the immune system. They patrol the organism looking for pathogens and ...

Dit protocol vertegenwoordigt een functionele in vitro test met behulp van van rundermonocyten afgeleide dendritische cellen om de immunogeniciteit van het vaccin te meten voorafgaand aan in vivo studies. Daarom wordt een bestaande leemte in de veevaccinatie opgevuld. Het is het genereren en toepassen van dendritische cellen.Als de krachtigste antigeen-presenterende cellen zijn dendritische cellen een belangrijk onderzoeksdoel geworden voor het begrijpen van intracellulaire immuunmechanismen, waaronder de werkzaamheid van vaccins. Deze test kan worden geïmplementeerd als een hulpmiddel voor het screenen van vaccinkandidaten, als een kwaliteitscontrolestaat voor vaccinproductie en voor antigeen- en adjuvansselectie. Richard Kangethe, wetenschapper in het laboratorium voor dierlijke productie en gezondheid, zal de procedure demonstreren.Begin met het omkeren en mengen van het bloed verkregen uit de halsaderpunctie van het kalf met gehepariniseerde vacutainers. Breng vervolgens 20 milliliter gehepariniseerd bloed over naar een steriele buis van 50 milliliter en verdun deze met 10 milliliter fosfaat gebufferde zoutoplossing of PBS. Pipetteer 15 milliliter lymfocytenisolatiemedium tot een steriele buis van 50 milliliter en kantel de buis in een positie van 45 graden.Leg voorzichtig 30 milliliter bloed PBS-medium op de lymfocytenisolatie met behulp van een pipet van 25 milliliter en breng de buis langzaam terug naar een verticale positie voordat u deze centrifugeert. Verzamel vervolgens de dunne witte laag perifere bloedmononucleaire cellen of PBMC-laag met behulp van een Pasteur-pipet en breng deze over in een nieuwe buis van 50 milliliter. Was de geoogste PBMC's twee keer met 40 milliliter PBS per wasbeurt en meng deze grondig.Na het centrifugeren, resuspendien de pellet in 15 milliliter ammoniumchloride kaliumbuffer of ACK-buffer. Voeg na 10 tot 15 minuten incubatie bij kamertemperatuur tot 40 milliliter PBS toe en centrifugeer de buis met maximale versnelling en vertraging. Resuspendie van de pellet in 10 milliliter volledig kweekmedium.Voeg vervolgens vijf microliter CD14 MicroBead-buffer per 10 miljoen cellen toe en meng grondig met behulp van een pipet. Voeg voor flowcytometrie-analyse 10 microliter CD14-fluoresceïne-isothiocyanaat of FITC-kleuringsantilichaam toe aan de PBMC's en incuber het gedurende 15 minuten bij vier tot acht graden Celsius voordat u doorgaat met de flowcytometrie. Voeg aan de niet-gekleurde PBMC's een milliliter faxbuffer toe en centrifugeer deze gedurende zeven minuten bij 500 g en vier graden Celsius.Suspensie de pellet vervolgens in 500 microliter faxbuffer per 100 miljoen cellen. Steek vervolgens de immunomagnetische celscheidingskolom in de separator en plaats een opvangbuis van 50 milliliter onder de kolomuitlaat voor het opvangen van de doorstroom. Na het wassen van de kolom met één milliliter ontgaste faxbuffer, vervangt u de gebruikte buis van 15 milliliter door een nieuwe.Pipetteer honderd miljoen cellen in 500 microliter buffer per keer waardoor de celsuspensie door de kolom kan gaan. Spoel de kolom vervolgens drie keer af met telkens drie milliliter ontgaste faxbuffer. Na het verzamelen van de doorstroming, label de eerste geëlueerde naïeve lymfocytenfractie als de CD14 negatieve celfractie.Verwijder de kolom uit de separator en plaats een nieuwe steriele buis van 15 milliliter onder de kolom voor de effluentopvang. Voeg vijf milliliter faxbuffer toe aan de kolom en duw deze er onmiddellijk doorheen met behulp van de zuiger. Verzamel en label de tweede doorstroom of de naïeve monocytenfractie als de CD14-positieve celfractie.Voeg een compleet kweekmedium toe aan de geoogste CD14-positieve monocyten om 1 miljoen cellen per milliliter te bereiken. Voeg vervolgens een milliliter celsuspensie toe aan elke put van een steriele 24-putplaat voordat u elke put aanvult met 40 microliter van de cytokinecocktail die in de kit wordt geleverd. Breng op dag twee de helft van de inhoud van elke put over naar afzonderlijke buizen van 1,5 milliliter met behulp van een pipet.Nadat u de buizen van 1,5 milliliter gedurende zeven minuten op 500 g hebt gecentrifugeerd, gooit u het supernatant weg en resuspenseert u de pellet in 500 microliter vers volledig kweekmedium. Breng 500 microliter van deze geresuspendeerde celsuspensie terug naar de overeenkomstige putten, zodat het uiteindelijke volume in de put één milliliter wordt. Verrijk elke put met 20 microliter cytokinecocktail.Om antigeen-gepulseerde MoDC's te genereren, voegt u één microliter per milliliter rabiësvirusvaccin of RV-suspensie toe aan één milliliter naïeve MoDC-cultuur in de 24-wellplaat en incubeert u de plaat gedurende 48 uur bij 5% koolstofdioxide en 37 graden Celsius. Houd op dag zeven de 24-well-plaat met de antigeen-gepulseerde MoDC's gedurende 10 minuten op ijs voordat u een milliliter ijskoude PBS per put toevoegt en deze grondig mengt. Breng de suspensie over in een buis van 15 milliliter.Was de putjes met twee milliliter ijskoude PBS. Verzamel de resterende cellen in elke put en breng de gewassen inhoud over in hun respectieve buizen. Centrifugeer de celsuspensie gedurende zeven minuten op 500 g.Na het weggooien van het supernatant, resuspensie de antigeen-gepulseerde MoDCs-celpellet in een compleet kweekmedium om de uiteindelijke concentratie van 100.000 cellen per milliliter aan te passen. Voor MoDC-lymfocytencocultuur zaait u de putjes van een steriele 24-putplaat met één milliliter van de naïeve lymfocytencelsuspensie en één milliliter antigeen-gepulseerde of niet-antigeen-gepulseerde MoDC-suspensie op de zevende dag van de antigeenpuls. Na twee dagen incubatie, vul elke put aan met 20 nanogram per milliliter recombinant interleukine-2 en zet de incubatie nog eens 120 uur voort.Breng op dag 14 een milliliter van de co-cultuur over in een steriele buis van 1,5 milliliter en centrifugeer de buis. Vervolgens resuspendeerde de celpellet met één milliliter antigeengepulseerde of niet-gepulste MoDC's. Meng goed en breng de celsuspensies over naar de bijbehorende putjes.Na celoppervlakkleuring van de PBMC's en naïeve lymfocyten en monocyten, breng een milliliter van de celsuspensie over naar een steriele buis van 1,5 milliliter met behulp van een pipet en centrifuge gedurende 10 minuten bij 500 g. Breng de pellet vervolgens terug in één milliliter PBS en breng deze over in een buis van 15 milliliter. Verzamel ook de resterende cellen en de bijbehorende buizen met behulp van één milliliter PBS.Voeg vervolgens 10 milliliter PBS toe aan de buis van 15 milliliter met de cellen en meng door pipetteren. Na het centrifugeren van de buis gedurende zeven minuten bij 850 g, verwijdert u het supernatant en resuspenseert u de celkorrel voorzichtig met resterende suspensie die overblijft na het decanteren van het supernatant. Breng de celophanging over op een V-bodem 96-putplaat en sluit de putten af om morsen te voorkomen.Zodra de kleuring is voltooid, voert u de flowcytometeranalyse uit. Pas vanuit de realtime preview de drempel van fluorescentie aan, inclusief spanning en versterking en celgrootte om uiteindelijk poorten rond de gewenste celpopulatie te tekenen terwijl cellulair puin wordt uitgesloten. CD14-celkleuring en flowcytometrie toonden aan dat de naïeve monocytenfractie voor 98% CD14-positieve monocytencellen bestond en functioneel in staat was tot antigeenopname.De naïeve MoDC's fenotypisch gekenmerkt door het beoordelen van de expressie van MHC Klasse 2 en co-stimulerende CD86 en CD40 celoppervlak markers valideerden de dendritische cellen of DC-achtig fenotype. Tijdens de MoDC-lymfocytencocultuur op dag negen werd een morfologische verandering waargenomen die dendrietuitbreiding liet zien in de RV-puls naar MoDC's. Vergeleken met de niet-gepulseerde MoDC-lymfocytencultuur werd een significante toename van lymfocytenproliferatie aangetoond door de upregulatie van de Ki67- en CD25-activeringsmarkers op de CD4-positieve en CD8-positieve T-cellen op dag 16 in de gepulseerde MoDC-lymfocytencocultuur.De CD8-positieve T-cellen uit de volwassen RV-gepulseerde MoDC-coculturen vertoonden een achtvoudige upregulatie van Ki67 in vergelijking met de niet-specifieke groep. De CD4-positieve cellen in dezelfde co-cultuur vertoonden een zevenvoudige toename van Ki67 in vergelijking met controles, wat het vermogen van RV-geprimeerde MoDC's aantoont om het RV-antigeen aan naïeve lymfocyten te presenteren en ze in een in vitro toestand te activeren. De qPCR-kwantificering van coculturen toonde meer dan 30% toename in interferon gamma-expressie en meer dan 5% toename in Ki67-expressie in alle co-culturen die GAPDH als kalibrator gebruikten.Een significant hogere concentratie van uitgescheiden interferon gamma werd waargenomen in de RV gepulseerde MoDC lymfocyt co-cultuur in vergelijking met de niet-specifieke behandelingsgroep. Voer de gelaagdheidsstap zeer langzaam en voorzichtig uit en zorg ervoor dat er bloed op het lymfocytenisolatiemedium wordt gelegd. Wees extra voorzichtig om alle PBMC's te verzamelen zonder te veel materiaal van de andere lagen te verzamelen.Andere methoden zoals flowcytometrie, ELISA en kwantitatieve PCR, onder andere, kunnen na deze procedure worden toegepast om de activering van immuunmarkers te evalueren.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Isolatie van Mouse Lung dendritische cellen

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells

Generatie van een nieuw dendritisch celvaccin met melanoom en plaveiselkankerstamcellen

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H ...

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Activering en waardering van NLRP3 inflammasome activiteit met behulp van IL-1β in Human Monocyt-afgeleide dendritische cellen

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

Karakterisering van Human-monocyten afgeleide dendritische cellen door Imaging flowcytometrie: Een vergelijking tussen twee monocyten Isolation Protocollen

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Genereren van Human-monocyten afgeleide dendritische cellen uit volbloed

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

Ontwikkeling en validatie van een Ultrasensitive enkel molecuul Array digitale Enzyme-linked Immunosorbent Assay voor menselijk Interferon-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

siRNA Electroporation to Modulate Autophagy in Herpes Simplex Virus Type 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells

siRNA Electroporation voor het moduleren van Autophagie in herpes simplex virus type 1-geïnfecteerde monocyt-afgeleide dendritische cellen

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) induces autophagy in both, immature dendritic cells (iDCs) as well as mature dendritic cells (mDCs), whereas ...

In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

In vitro stimulatie en visualisatie van extracellulaire val afgifte in gedifferentieerde humane monocyte-afgeleide macrofagen

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic ...

Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages

Visualisatie van inflammatoire caspasen geïnduceerde nabijheid in menselijke monocyt-afgeleide macrofagen

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct ...

Gedesialyleerde monocyt-afgeleide DC's van geïsoleerde PBMC's met behulp van behandeling met sialidase

Generation of Monocyte-Derived Dendritic Cells with Differing Sialylated Phenotypes

Auteur in de schijnwerpers: Rijping van dendritische cellen met behulp van op sialidasen gebaseerde enzymatische behandeling van het celoppervlak 

Generatie van monocyt-afgeleide dendritische cellen met verschillende gesialyleerde fenotypes

Sialic acids are negatively charged monosaccharides typically found at the termini of cell surface glycans. Due to their hydrophilicity and biophysical ...