Name: determination of vaccine immunogenicity using bovine monocyte-derived dendritic cells
Uploaded: 2023-05-19T12:30:00
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Nous remercions la Dre Eveline Wodak et la Dre Angelika Loistch (AGES) pour leur soutien dans la détermination de l’état de santé des animaux et pour la fourniture du virus de la fièvre catarrhale ovine, le Dr Bernhard Reinelt pour la fourniture de sang bovin, et le Dr Bharani Settypalli et le Dr William Dundon de l’AIEA pour leurs conseils utiles sur les expériences de PCR en temps réel et l’édition du langage, respectivement.

La collecte de sang est effectuée par un service vétérinaire certifié conformément aux directives éthiques de l’Agence autrichienne pour la santé et la sécurité alimentaire (AGES) et conformément aux normes acceptées en matière de bien-être animal32. L’étude a reçu l’approbation éthique du ministère autrichien de l’Agriculture. La conception expérimentale de la génération de DCMO et son application ultérieure sont illustrées à la figure 1</strong...

Cette étude démontre une méthode in vitro normalisée pour la production et le phénotypage des DC bovins et leur utilisation subséquente pour mesurer l’immunogénicité vaccinale d’un vaccin commercial (p. ex. RV). Les DC bovines peuvent être utilisées comme outil pour dépister les antigènes vaccinaux potentiels contre les maladies des bovins et prédire leur impact clinique potentiel en fonction des réponses immunitaires avant de procéder à des essais in vivo sur des animaux. Les DC gé...

La vaccination vétérinaire représente un aspect crucial de l’élevage et de la santé animale, car elle contribue à améliorer la sécurité alimentaire et le bien-être animal en conférant une protection contre les maladies qui affectent le secteur de l’élevage à l’échelle mondiale1. Une méthode in vitro efficace pour évaluer l’immunogénicité d’éventuels candidats vaccins contribuerait à accélérer le processus de développement et de production de vaccins. Il est donc nécessaire d’élargir le champ des tests immunitaires avec des méthodologies innovantes basées sur des études in vitro , car cela contribuerait à dévoiler la complexité des processus immunitaires liés à l’immunisation et à l’infection pathogène. À l’heure actuelle, on utilise l’immunisation in vivo des animaux et les études de provocation, qui nécessitent un échantillonnage périodique (p. ex. sang et rate), pour mesurer l’immunogénicité des vaccins et adjuvants candidats. Ces tests sont coûteux, prennent beaucoup de temps et ont des implications éthiques, car dans la plupart des cas, l’euthanasie animale est effectuée à la fin des essais.
Comme alternative aux essais in vivo, les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) ont été utilisées pour évaluer les réponses immunitaires induites par le vaccin in vitro2. Les PBMC sont une population hétérogène de cellules composée de 70 % à 90 % de lymphocytes, de 10 à 20 % de monocytes et d’un nombre limité de cellules dendritiques (DC, 1 % à 2 %)3. Les PBMC hébergent des cellules présentatrices d’antigènes (APC) telles que les cellules B, les monocytes et les DC, qui patrouillent constamment l’organisme à la recherche de signes d’infection ou de lésions tissulaires. Les chimiokines sécrétées localement facilitent le recrutement et l’activation des APC sur ces sites en se liant aux récepteurs de surface cellulaire. Dans le cas des monocytes, les chimiokines dirigent leur destin pour se différencier en DC ou en macrophages4. Dès que les DC rencontrent et capturent un agent pathogène, ils migrent vers les organes lymphoïdes secondaires, où ils peuvent présenter les antigènes peptidiques pathogènes traités à l’aide de protéines de surface de classe I ou de classe II du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) aux lymphocytes T CD8+ ou aux lymphocytes T CD4+, respectivement, déclenchant ainsi une réponse immunitaire 5,6.
Le rôle clé joué par les CD dans l’orchestration d’une réponse immunitaire protectrice contre divers agents pathogènes en fait une cible de recherche intéressante pour comprendre les mécanismes immunitaires intracellulaires, en particulier lors de la conception de vaccins et d’adjuvants contre les agents infectieux7. Étant donné que la fraction de DC pouvant être obtenue à partir des PBMC est plutôt faible (1% -2%), les monocytes ont plutôt été utilisés pour générer des DC in vitro8. Ces DC dérivés de monocytes (MoDC) ont été initialement développés comme stratégie de traitement possible en immunothérapie du cancer9. Plus récemment, les MoDC ont été utilisés pour la recherche sur les vaccins 10,11,12, et les monocytes classiques sont le sous-type prédominant (89%) pour la production de MoDC 13. La production de MoDCs in vitro a déjà été réalisée par l’ajout de facteur de stimulation des colonies de granulocytes-macrophages (GM-CSF) administré en association avec d’autres cytokines telles que l’interleukine-4 (IL-4), le facteur de nécrose tumorale α (TNF-α) ou l’IL-1314,15,16.
Le succès d’un essai de DC in vitro repose sur la capacité des MoDC matures stimulés par l’antigène à moduler l’étendue et le type de réponse immunitaire spécifique au type d’antigène détecté17. Le type d’agent pathogène reconnu et présenté par les DC détermine la différenciation des lymphocytes T auxiliaires (Th) CD4+ en cellules effectrices Th1, Th2 ou Th17 et est caractérisé par un profil de cytokines sécrétoires spécifique à l’agent pathogène. Une réponse Th1 est provoquée contre les agents pathogènes intracellulaires et entraîne la sécrétion d’interféron gamma (IFN-γ) et de facteur de nécrose tumorale bêta (TNF-β), qui module la protection phagocytaire-dépendante. Une réponse Th2 est déclenchée contre les organismes parasites et est caractérisée par la sécrétion d’IL-4, IL-5, IL-10 et IL-13, qui initie une protection humorale indépendante des phagocytes . Th17 offre une protection dépendante des neutrophiles contre les infections bactériennes et fongiques extracellulaires médiées par la sécrétion d’IL-17, IL-17F, IL-6, IL-22 et TNF-α 18,19,20,21. Sur la base d’études antérieures, il a été noté que tous les agents pathogènes ne correspondent pas au profil cytokinique attendu. Par exemple, les MoDC dermiques, en réponse à une infection parasitaire à Leishmania, stimulent la sécrétion d’IFN-γ par les lymphocytes T CD4+ et les lymphocytes T CD8+, induisant ainsi une réponse pro-inflammatoire protectrice en Th122.
Il a également été démontré que, chez les poulets, les MoDCs amorcés avec Salmonella lipopolysaccharide (LPS), peuvent induire une réponse variable contre Salmonella typhimurium en activant à la fois les réponses Th1 et Th2, tandis que Salmonella gallinarum induit une réponse Th2 seule, ce qui pourrait expliquer la résistance plus élevée de cette dernière à la clairance MoDC23. L’activation des DC contre Brucella canis (B. canis) a également été rapportée dans les MoDC canins et humains, ce qui signifie que cela pourrait représenter un mécanisme d’infection zoonotique24. Les MoDC humains amorcés avec B. canis induisent une forte réponse Th1 qui confère une résistance à une infection grave, tandis que les MoDC canins induisent une réponse Th17 dominante avec une réponse Th1 réduite, conduisant par la suite à l’établissement d’une infection chronique25. Les DCD bovins présentent une affinité accrue pour le virus aphteux (FMDV) conjugué à l’immunoglobuline G (IgG) par rapport au virus de la fièvre aphteuse non conjugué seul, car les MoDC forment un complexe viral-anticorps en réponse aux10 premiers. Prises ensemble, ces études montrent comment les DC ont été utilisés pour analyser la complexité des réponses immunitaires au cours d’une infection pathogène. Les réponses immunitaires adaptatives peuvent être évaluées par la quantification de marqueurs spécifiques associés à la prolifération des lymphocytes. La Ki-67, une protéine intracellulaire détectée uniquement dans les cellules en division, est considérée comme un marqueur fiable pour les études de prolifération26, et de même, CD25 exprimé à la surface des lymphocytes T au cours de la phase tardive d’activation correspond à la prolifération lymphocytaire27,28.
Cette étude démontre une méthode standardisée pour la génération in vitro de MD bovins suivie de leur application dans un essai immunitaire in vitro utilisé pour tester l’immunogénicité des vaccins. Un vaccin antirabique (RV) disponible dans le commerce a été utilisé pour valider l’efficacité de ce test. L’activation et la prolifération des lymphocytes T ont été mesurées par cytométrie en flux, réaction en chaîne quantitative par polymérase en temps réel (qPCR) et dosage immuno-enzymatique (ELISA) grâce à l’analyse de marqueurs d’activation cellulaire bien établis tels que Ki-67 et CD25 et la sécrétion d’IFN-γ 28,29,30,31. Aucun essai expérimental animal ou humain n’est effectué au cours du test MoDC.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher</td>
			<td>A1049201</td>
			<td>Ammonium-Chloride-Potassium buffer for lysis of residual RBCs in harvested PBMC Fraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Heparin Tubes</td>
			<td>Becton, Dickinson (BD) and Company</td>
			<td>366480</td>
			<td>10 mL, additive sodium heparin 158 USP units, glass tube, 16 x 100 mm size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Dendritic Cell Growth Kit</td>
			<td>Bio-Rad, UK</td>
			<td>PBP015KZZ</td>
			<td>Cytokine cocktail composed of recombinant bovine IL-4 and GM-CSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine IFN-&#947; ELISA Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA5638KZZ</td>
			<td>Kit use for measuring IFN-&#947; expression in culture supernatant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA2678F</td>
			<td>Mouse anti-bovine CD14 monoclonal antibody, clone CC-G33, isotype IgG1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD25 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA2430PE</td>
			<td>Mouse anti bovine CD25 monoclonal antibody, clone IL-A11, isotype IgG1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA1653A647</td>
			<td>Mouse anti bovine CD4 monoclonal antibody, clone CC8, isotype IgG2a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD40 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA2431F</td>
			<td>Mouse anti-bovine CD40 monoclonal antibody, clone IL-A156, isotype IgG1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA837F</td>
			<td>Mouse anti bovine CD8 monoclonal antibody, clone CC63, isotype IgG2a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD86 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA2437PE</td>
			<td>Mouse anti-bovine CD86 monoclonal antibody, clone IL-A190, isotype IgG1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>-</td>
			<td>Thermal cycler PCR machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Centrifuge Tube</td>
			<td>Falcon Corning&#160;</td>
			<td>352096 &#38; 352070</td>
			<td>15 mL and 50 mL, high-clarity poypropylene conical bottom, graduated, sterial, seal screw cap, falcon tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix/Cytoperm Plus</td>
			<td>BD Bio Sciences</td>
			<td>555028</td>
			<td>Fixation/permeabilization kit with BD golgiPlug, use for flow cytometer cell staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1009832500</td>
			<td>Absolute for analysis EMSURE&#160;ACS,ISO, Reag. Ph Eur</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher</td>
			<td>10500064</td>
			<td>Qualified, heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll Plaque PLUS</td>
			<td>GE Health care Life Sciences, USA</td>
			<td>341691</td>
			<td>Lymphocyte-isolation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowClean Cleaning Agent</td>
			<td>Beckman Coulter, Life Sciences</td>
			<td>A64669</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>FlowJo, Becton, Dickinson (BD) and Company, LLC, USA</td>
			<td>-</td>
			<td>Flow cytometer Histogram software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowTubes/ FACS&#160; (Fluorescence-activated single-cell sorting) Tube</td>
			<td>Falcon Corning&#160;</td>
			<td>352235</td>
			<td>5 mL, sterial, round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap, use in flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresceinisothiocynat-Dextran</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>60842-46-8</td>
			<td>FITC-dextran MW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallios Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>-</td>
			<td>Flow cytometer machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard-Shell 96-Well PCR Plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSP9601</td>
			<td>96 well, low profile, thin wall, skirted, white/clear</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human CD14 MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi Bioteck, Germany</td>
			<td>130-050-201</td>
			<td>2 mL microbeads conjugated to monoclonal anti-human CD14 antibody isotype IgG2a, used for selection of bovine monocytes from PBMCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaluza</td>
			<td>Beckman Coulter, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>Flow cytometer multicolor data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Column</td>
			<td>Miltenyi Bioteck, Germany</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Magnetic activated cell sorting or immune magentic cell separation colum for separation of various CD14 cell population based on cell surface antigens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC Class II DQ DR Polymorphic Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA2228F</td>
			<td>Mouse anti-sheep MHC Class II DQ DR Polymorphic:FITC, clone 49.1, isotype IgG2a, cross reactive with bovine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>HS4325</td>
			<td>1.5 mL, conical bottom, graduated, sterial tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Power Point</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>-</td>
			<td>The graphical illustrations of experimental design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 Negative Control:FITC for CD14, CD40 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA928F</td>
			<td>Isotype control CD14 and CD40 monoclonal antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 Negative Control:PE for CD86 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA928PE</td>
			<td>Isotype control CD86 monoclonal antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 Negative Control:RPE for CD25 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA928PE</td>
			<td>Isotype control CD25 monoclonal antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG2a Negative Control:FITC for MHC Class II Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA929F</td>
			<td>Isotype control for MHC class II monoclonal antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nobivac Rabies</td>
			<td>MSD Animal Health, UK</td>
			<td>-</td>
			<td>1 &#181;L/mL of cell cultured inactivated vaccine containing &#62; 2 I.U./mL Rabies virus strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical seals</td>
			<td>Bi0-Rad</td>
			<td>TCS0803</td>
			<td>0.2 mL flat PCR tube 8-cap strips, optical, ultraclear, compatible for qPCR machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td>pH 7.4, 1x concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism - GraphPad 5 Software&#160;</td>
			<td>Dotmatics</td>
			<td>-</td>
			<td>Statistical software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Anti-human Ki-67 antibody</td>
			<td>Biolegend, USA</td>
			<td>350501</td>
			<td>Monoclonal antibody, cross reactive with cow, clone ki-67</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Mouse IgG1 k Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>400101</td>
			<td>Isotype control for Ki-67 monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>READIDROP Propidium Iodide</td>
			<td>BD Bio Sciences</td>
			<td>1351101</td>
			<td>Live/dead cell marker used for flow cytometry, amine reactive dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-2 Protein</td>
			<td>R&#38;D System, USA</td>
			<td>202-IL-010/CF</td>
			<td>Interleukin-2, 20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74106</td>
			<td>Kit use for extraction of total RNA; RLT buffer = lysis buffer; RW1 buffer = stringent guanidine-containing washing buffer; RDD buffer = DNase buffer; RPE buffer = mild wash buffer; RNaseOUT = RNase inhibitor.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td>Cell culture media with L-glutamine and sodium bicarbonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMART-servier medical art&#160;</td>
			<td>Les Laboratories Servier</td>
			<td>-</td>
			<td>Licensed under a creative commons attribution 3.0 unported license</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>172-5270</td>
			<td>2x qPCR mix conatins dNTPs, Ss07d fusion polymerase, MgCl2, SYBR Green I supermix = supermix, ROX normalization dyes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III First-Strand Synthesis System</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher</td>
			<td>18080051</td>
			<td>Kit for cDNA synthsis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Test plate 24</td>
			<td>TPP, Switzerland</td>
			<td>92024</td>
			<td>24 well plate, sterilized by radiation , growth enhanced treated, volume 3.18 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher</td>
			<td>15250061</td>
			<td>0.4%, 100 mL, dye to assess cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher</td>
			<td>10977023</td>
			<td>0.1 &#181;m membrane filtered distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15206067</td>
			<td>VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes have a green top and contain spray-dried lithium, sodium or ammonium heparin on the inner walls and are usedin clinical chemistry, immunology and serology. The anticoagulant heparin activates antithrombin, which blocks the clotting cascade and thus produces a whole blood/plasma sample.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W3500-1L</td>
			<td>Sterile-filtered, bioReagent suitable for cell culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of vaccine immunogenicity using bovine monocyte-derived dendritic cells

Les cellules dendritiques (CD) sont les cellules présentatrices d’antigènes (APC) les plus puissantes du système immunitaire. Ils patrouillent l’organisme à la recherche d’agents pathogènes et jouent un rôle unique au sein du système immunitaire en reliant les réponses immunitaires innées et adaptatives. Ces cellules peuvent phagocyter puis présenter des antigènes capturés aux cellules immunitaires effectrices, déclenchant une gamme variée de réponses immunitaires. Cet article démontre une méthode normalisée pour la génération in vitro de cellules dendritiques dérivées de monocytes bovins (MoDC) isolées à partir de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) de bovins et leur application dans l’évaluation de l’immunogénicité du vaccin.
Le tri cellulaire magnétique a été utilisé pour isoler les monocytes CD14+ des PBMC, et la supplémentation d’un milieu de culture complet avec de l’interleukine (IL)-4 et du facteur de stimulation des colonies de granulocytes-macrophages (GM-CSF) a été utilisée pour induire la différenciation des monocytes CD14+ en MoDC naïfs. La génération de MoDC immatures a été confirmée par la détection de l’expression des marqueurs de surface cellulaire du complexe majeur d’histocompatibilité II (MHC II), CD86 et CD40. Un vaccin antirabique disponible dans le commerce a été utilisé pour pulser les MoDC immatures, qui ont ensuite été co-cultivés avec des lymphocytes naïfs.
L’analyse par cytométrie en flux des MoDC pulsés d’antigènes et de la co-culture lymphocytaire a révélé la stimulation de la prolifération des lymphocytes T par l’expression de marqueurs Ki-67, CD25, CD4 et CD8. L’analyse de l’expression de l’ARNm de l’IFN-γ et du Ki-67, en utilisant la PCR quantitative, a montré que les MoDC pouvaient induire l’amorçage spécifique de l’antigène des lymphocytes dans ce système de co-culture in vitro . De plus, la sécrétion d’IFN-γ évaluée à l’aide d’ELISA a montré un titre significativement plus élevé (**p < 0,01) dans la co-culture MoDC-lymphocytes pulsée par le vaccin antirabique que dans la co-culture MoDC-lymphocytes non pulsée antigénique. Ces résultats montrent la validité de ce test MoDC in vitro pour mesurer l’immunogénicité du vaccin, ce qui signifie que ce test peut être utilisé pour identifier les candidats vaccins potentiels pour les bovins avant de procéder aux essais in vivo , ainsi que dans les évaluations de l’immunogénicité des vaccins commerciaux.

Cette méthodologie décrit la génération in vitro de MD bovins pour l’évaluation des antigènes vaccinaux candidats avant la réalisation d’études in vivo. La figure 1 illustre le schéma expérimental de la production de DC bovins et l’application des DC pour le test in vitro. En utilisant la technique de tri cellulaire magnétique, il a été possible de prélever environ 26 millions de myocytes CD14+ des PBMC récoltés, qui étaient aupara...

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Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells

La méthodologie décrit la génération de cellules dendritiques dérivées de monocytes bovins (MoDC) et leur application pour l’évaluation in vitro de candidats antigéniques au cours du développement de vaccins vétérinaires potentiels chez les bovins.

Détermination de l’immunogénicité du vaccin à l’aide de cellules dendritiques dérivées de monocytes bovins

Dendritic cells (DCs) are the most potent antigen-presenting cells (APCs) within the immune system. They patrol the organism looking for pathogens and ...

Ce protocole représente un essai fonctionnel in vitro utilisant des cellules dendritiques dérivées de monocytes bovins pour mesurer l’immunogénicité du vaccin avant les études in vivo. Par conséquent, combler une lacune existante dans la vaccinologie du bétail. C’est la génération et l’application de cellules dendritiques.En tant que cellules présentatrices d’antigènes les plus puissantes, les cellules dendritiques sont devenues une cible de recherche clé pour comprendre les mécanismes immunitaires intracellulaires, y compris l’efficacité du vaccin. Ce test peut être mis en œuvre comme outil de sélection des candidats vaccins, comme état de contrôle de la qualité pour la production de vaccins et pour la sélection des antigènes et des adjuvants. Richard Kangethe, scientifique au laboratoire de production et de santé animale, fera la démonstration de la procédure.Commencez par inverser et mélanger le sang obtenu à partir de la ponction de la veine jugulaire du veau avec des vacutainers héparinisés. Ensuite, transférez 20 millilitres de sang hépariné dans un tube stérile de 50 millilitres et diluez-le avec 10 millilitres de solution saline tamponnée au phosphate ou PBS. Pipeter 15 millilitres de milieu d’isolation lymphocytaire dans un tube stérile de 50 millilitres et incliner le tube à une position de 45 degrés.Déposer soigneusement 30 millilitres de milieu PBS sanguin sur l’isolement lymphocytaire à l’aide d’une pipette de 25 millilitres et ramener lentement le tube en position verticale avant de le centrifuger. Ensuite, collectez la fine couche blanche de cellules mononucléées du sang périphérique ou de la couche PBMC à l’aide d’une pipette Pasteur et transférez-la dans un nouveau tube de 50 millilitres. Lavez les PBMC récoltés deux fois en utilisant 40 millilitres de PBS par lavage et mélangez-les soigneusement.Après centrifugation, remettre la pastille en suspension dans 15 millilitres de tampon potassium et de chlorure d’ammonium ou de tampon ACK. Après 10 à 15 minutes d’incubation à température ambiante, ajoutez jusqu’à 40 millilitres de PBS et centrifugez le tube avec une accélération et une décélération maximales. Remettez en suspension la pastille dans 10 millilitres de milieu de culture complet.Ajoutez ensuite cinq microlitres de tampon MicroBead CD14 par 10 millions de cellules et mélangez soigneusement à l’aide d’une pipette. Pour l’analyse par cytométrie en flux, ajoutez 10 microlitres d’isothiocyanate de fluorescéine CD14 ou d’anticorps colorant FITC aux PBMC et incuberez-le pendant 15 minutes à quatre à huit degrés Celsius avant de procéder à la cytométrie en flux. Aux PBMC non tachés, ajoutez un millilitre de tampon de fax et centrifugez-le pendant sept minutes à 500g et quatre degrés Celsius.Ensuite, remettez la pastille en suspension dans 500 microlitres de tampon fax pour 100 millions de cellules. Ensuite, insérez la colonne de séparation cellulaire immunomagnétique dans le séparateur et placez un tube de collecte de 50 millilitres sous la sortie de la colonne pour recueillir le flux. Après avoir lavé la colonne avec un tampon fax dégazé d’un millilitre, remplacez le tube de 15 millilitres usagé par un nouveau.Pipeter cent millions de cellules dans 500 microlitres de tampon à la fois permettant à la suspension cellulaire de passer à travers la colonne. Rincez ensuite la colonne trois fois avec trois millilitres de tampon fax dégazé à chaque fois. Après avoir recueilli le flux, étiqueter la première fraction lymphocytaire naïve éluée comme fraction cellulaire CD14 négative.Retirez la colonne du séparateur et placez un nouveau tube stérile de 15 millilitres sous la colonne pour la collecte des effluents. Ajoutez cinq millilitres de tampon de fax dans la colonne et poussez-la immédiatement à l’aide du piston. Recueillir et étiqueter la deuxième fraction monocytaire à flux continu ou naïve comme la fraction cellulaire positive CD14.Ajouter un milieu de culture complet aux monocytes CD14 positifs récoltés pour atteindre 1 million de cellules par millilitre. Ensuite, ajoutez une suspension cellulaire d’un millilitre à chaque puits d’une plaque stérile de 24 puits avant de compléter chaque puits avec 40 microlitres du cocktail de cytokines fourni dans le kit. Le deuxième jour, transférez la moitié du contenu de chaque puits dans des tubes individuels de 1,5 millilitre à l’aide d’une pipette.Après avoir centrifugé les tubes de 1,5 millilitre à 500 g pendant sept minutes, jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 500 microlitres de milieu de culture complet frais. Transférez 500 microlitres de cette suspension cellulaire remise en suspension dans les puits correspondants afin que le volume final dans le puits devienne un millilitre. Enrichissez chaque puits avec 20 microlitres de cocktail de cytokines.Pour générer des MoDC pulsés d’antigène, ajoutez un microlitre par millilitre de vaccin antirabique ou de suspension de RV à un millilitre de culture de MoDC naïf dans la plaque de 24 puits et incuber la plaque pendant 48 heures à 5% de dioxyde de carbone et 37 degrés Celsius. Le septième jour, conservez la plaque de 24 puits contenant les MoDC pulsés d’antigène sur la glace pendant 10 minutes avant d’ajouter un millilitre de PBS glacé par puits et de bien mélanger. Transférer la suspension dans un tube de 15 millilitres.Lavez les puits avec deux millilitres de PBS glacé. Recueillir les cellules résiduelles dans chaque puits et transférer le contenu lavé dans leurs tubes respectifs. Centrifuger la suspension cellulaire à 500g pendant sept minutes.Après avoir éliminé le surnageant, remettre en suspension la pastille cellulaire MoDCs pulsée d’antigène dans un milieu de culture complet pour ajuster la concentration finale de 100 000 cellules par millilitre. Pour la co-culture MoDC-lymphocyte, ensemencer les puits d’une plaque stérile de 24 puits avec un millilitre de suspension de cellules lymphocytaires naïves et un millilitre de suspension MoDC pulsée ou non antigénique le septième jour de l’impulsion antigénique. Après deux jours d’incubation, complétez chaque puits avec 20 nanogrammes par millilitre d’interleukine-2 recombinante et poursuivez l’incubation pendant 120 heures supplémentaires.Le jour 14, transférer un millilitre de co-culture dans un tube stérile de 1,5 millilitre et centrifuger le tube. Ensuite, remettez en suspension la pastille cellulaire avec un millilitre de MoDC pulsés ou non pulsés d’antigène. Bien mélanger et transférer les suspensions cellulaires dans leurs puits correspondants.Après coloration à la surface cellulaire des PBMC et des lymphocytes et monocytes naïfs, transférer un millilitre de la suspension cellulaire dans un tube stérile de 1,5 millilitre à l’aide d’une pipette et d’une centrifugeuse pendant 10 minutes à 500 g. Ensuite, remettez la pastille en suspension dans un millilitre de PBS et transférez-la dans un tube de 15 millilitres. Collectez également les cellules résiduelles et les tubes correspondants en utilisant un millilitre de PBS.Ajoutez ensuite 10 millilitres de PBS au tube de 15 millilitres contenant les cellules et mélangez par pipetage. Après avoir centrifugé le tube pendant sept minutes à 850 g, retirer le surnageant et remettre délicatement en suspension la cellule avec la suspension résiduelle laissée après la décantation du surnageant. Transférer la suspension cellulaire sur une plaque à fond en V à 96 puits et sceller les puits pour éviter les déversements.Une fois la coloration terminée, effectuez l’analyse du cytomètre en flux. À partir de l’aperçu en temps réel, ajustez le seuil de fluorescence, y compris la tension, le gain et la taille de la cellule pour éventuellement tracer des portes autour de la population cellulaire souhaitée tout en excluant tout débris cellulaire. La coloration des cellules CD14 et la cytométrie en flux ont montré que la fraction monocytaire naïve comprenait 98% de cellules monocytaires CD14 positives et était fonctionnellement capable d’absorption de l’antigène.Les MoDCs naïfs phénotypiquement caractérisés par l’évaluation de l’expression du CMH de classe 2 et les marqueurs de surface cellulaire CD86 et CD40 co-stimulateurs ont validé les cellules dendritiques ou le phénotype DC-like. Au cours de la co-culture lymphocytaire MoDC le neuvième jour, un changement morphologique montrant une extension de dendrite a été observé dans l’impulsion RV vers MoDCs. Par rapport à la culture de lymphocytes MoDC non pulsés, une augmentation significative de la prolifération lymphocytaire a été démontrée par la régulation positive des marqueurs d’activation Ki67 et CD25 sur les lymphocytes T CD4 positifs et CD8 positifs au jour 16 dans la co-culture de lymphocytes MoDC pulsés.Les lymphocytes T CD8 positifs des co-cultures MoDC pulsées RV matures ont présenté une régulation positive huit fois supérieure de Ki67 par rapport au groupe non spécifique. Les cellules CD4 positives dans la même co-culture ont montré une multiplication par sept de Ki67 par rapport aux témoins, démontrant la capacité des MoDC amorcés par le RV à présenter l’antigène du RV aux lymphocytes naïfs et à les activer in vitro. La quantification qPCR des co-cultures a montré une augmentation de plus de 30% de l’expression de l’interféron gamma et une augmentation de plus de 5% de l’expression de Ki67 dans toutes les co-cultures utilisant GAPDH comme calibrateur.Une concentration significativement plus élevée d’interféron gamma sécrété a été observée dans la co-culture de lymphocytes MoDC pulsés RV par rapport au groupe de traitement non spécifique. Effectuez l’étape de stratification très lentement et soigneusement, en veillant à ce que le sang soit déposé sur le milieu d’isolement des lymphocytes. Faites très attention à collecter tous les PBMC sans collecter trop de matière des autres couches.D’autres méthodes telles que la cytométrie en flux, ELISA et la PCR quantitative, entre autres, peuvent être appliquées après cette procédure pour évaluer l’activation des marqueurs immunitaires.

Research

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