Name: determination of vaccine immunogenicity using bovine monocyte-derived dendritic cells
Uploaded: 2023-05-19T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells at JoVE.com

אנו מודים לד"ר אוולין וודאק וד"ר אנג'ליקה לויסטש (AGES) על תמיכתם בקביעת מצבם הבריאותי של בעלי החיים ועל אספקת BTV, ד"ר ברנהרד ריינלט על אספקת דם בקר, וד"ר בהראני סטיפלי וד"ר ויליאם דנדון מהסוכנות הבינלאומית לאנרגיה אטומית על עצות מועילות לגבי ניסויי PCR בזמן אמת ועריכת שפה, בהתאמה.

איסוף הדם מתבצע על ידי שירות וטרינר מוסמך בהתאם להנחיות האתיות של הסוכנות האוסטרית לבריאות ובטיחות מזון (AGES) ובהתאם לתקנים המקובלים לרווחת בעלי חיים32. המחקר קיבל אישור אתי ממשרד החקלאות האוסטרי. התכנון הניסיוני ליצירת MoDCs ויישומו לאחר מכן מומחש באיור 1.
<p class...

מחקר זה מדגים שיטה מתוקננת במבחנה לייצור ופנוטיפ של MoDC בקר והשימוש בהם לאחר מכן במדידת האימונוגניות של החיסון של חיסון מסחרי (למשל, RV). MoDCs של בקר יכולים לשמש ככלי לסינון אנטיגנים פוטנציאליים של חיסונים נגד מחלות בקר וחיזוי ההשפעה הקלינית הפוטנציאלית שלהם בהתבסס על תגובות חיסוניות לפ?...

חיסון וטרינרי מייצג היבט מכריע של גידול בעלי חיים ובריאותם, שכן הוא תורם לשיפור הביטחון התזונתי ורווחת בעלי החיים על ידי הענקת הגנה מפני מחלות המשפיעות על משק החי ברחבי העולם1. שיטה יעילה במבחנה להערכת האימונוגניות של מועמדים אפשריים לחיסון תסייע להאיץ את תהליך הפיתוח והייצור של חיסונים. לכן, יש צורך להרחיב את תחום בדיקות החיסון עם מתודולוגיות חדשניות המבוססות על מחקרי מבחנה , שכן זה יעזור לחשוף את המורכבות של תהליכים חיסוניים הקשורים חיסון זיהום פתוגן. כיום, מחקרי חיסון ואתגר של בעלי חיים in vivo , הדורשים דגימה תקופתית (למשל, דם וטחול), משמשים למדידת האימונוגניות של חיסונים ואדג'ובנטים מועמדים. בדיקות אלה יקרות, גוזלות זמן ויש להן השלכות אתיות, מכיוון שברוב המקרים, המתת חסד של בעלי חיים מתבצעת עד סוף הניסויים.
כחלופה למבחני in vivo, תאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMCs) שימשו להערכת תגובות חיסוניות המושרות על ידי חיסונים במבחנה2. PBMCs הם אוכלוסייה הטרוגנית של תאים המורכבת מ 70%-90% לימפוציטים, 10%-20% מונוציטים, ומספר מוגבל של תאים דנדריטיים (DCs, 1%-2%)3. PBMCs מכילים תאים מציגי אנטיגן (APC) כגון תאי B, מונוציטים ו-DC, אשר מסיירים ללא הרף באורגניזם בחיפוש אחר סימני זיהום או נזק לרקמות. כימוקינים המופרשים באופן מקומי מאפשרים גיוס והפעלה של נגמ"שים לאתרים אלה על ידי קשירה לקולטני פני השטח של התא. במקרה של מונוציטים, כימוקינים מכוונים את גורלם להתמיין ל-DCs או למקרופאגים4. ברגע ש-DCs נתקלים בפתוגן ולוכדים אותו, הם נודדים לאיברי לימפה משניים, שם הם יכולים להציג את האנטיגנים הפפטידיים המעובדים של הפתוגן באמצעות חלבוני שטח מסוג I או Class II של קומפלקס היסטותאימות עיקריים (MHC) לתאי CD8+ T או CD4+ T, בהתאמה, ובכך לעורר תגובה חיסונית 5,6.
תפקיד המפתח שממלאים DCs בתיאום תגובה חיסונית מגנה מפני פתוגנים שונים הופך אותם ליעד מחקרי מעניין להבנת מנגנוני חיסון תוך-תאיים, במיוחד בעת תכנון חיסונים ואדג'ובנטים נגד גורמים זיהומיים7. מכיוון שחלק ה- DCs שניתן להשיג מ- PBMCs הוא קטן למדי (1%-2%), מונוציטים שימשו במקום זאת ליצירת DCs במבחנה8. DCs אלה שמקורם במונוציטים (MoDCs) פותחו בתחילה כאסטרטגיית טיפול אפשרית באימונותרפיה לסרטן9. לאחרונה, MoDCs שימשו למחקר חיסונים 10,11,12, ומונוציטים קלאסיים הם תת-הסוג הדומיננטי (89%) לייצור MoDC 13. הייצור של MoDCs במבחנה הושג בעבר באמצעות תוספת של גורם מגרה מושבת גרנולוציטים-מקרופאגים (GM-CSF) שניתן בשילוב עם ציטוקינים אחרים כגון אינטרלוקין-4 (IL-4), גורם נמק הגידול α (TNF-α), או IL-1314,15,16.
ההצלחה של בדיקת MoDC במבחנה מסתמכת על היכולת של MoDCs בוגרים מעוררי אנטיגן לווסת את ההיקף והסוג של התגובה החיסונית הספציפית לסוג האנטיגן שזוהה17. סוג הפתוגן המוכר ומוצג על ידי MoDCs קובע את ההתמיינות של תאי CD4+ T עוזר (Th) לתאי השפעה Th1, Th2 או Th17 ומאופיין בפרופיל ציטוקין מפריש ספציפי לפתוגן. תגובת Th1 מופעלת נגד פתוגנים תוך-תאיים וגורמת להפרשת אינטרפרון-גמא (IFN-γ) וגורם נמק הגידול בטא (TNF-β), המווסת הגנה תלוית פגוציטים. תגובת Th2 מופעלת נגד אורגניזמים טפיליים ומאופיינת בהפרשת IL-4, IL-5, IL-10 ו-IL-13, היוזמת הגנה הומורלית בלתי תלויה בפאגוציטים. Th17 מציע הגנה תלוית נויטרופילים מפני זיהומים חיידקיים ופטריות חוץ-תאיים בתיווך הפרשת IL-17, IL-17F, IL-6, IL-22 ו-TNF-α 18,19,20,21. בהתבסס על מחקרים קודמים, צוין כי לא כל הפתוגנים נופלים בפרופיל הציטוקינים הצפוי. לדוגמה, MoDCs עוריים, בתגובה לזיהום טפילי לישמניה, מעוררים הפרשת IFN-γ מתאי T CD4+ ותאי T CD8+, ובכך גורמים לתגובת Th1 פרו-דלקתית מגנה22.
כמו כן, הוכח כי בעופות MoDCs עם סלמונלה ליפופוליסכריד (LPS), יכול לגרום לתגובה משתנה נגד סלמונלה טיפימוריום על ידי הפעלת תגובות Th1 ו- Th2, בעוד סלמונלה גלינרום גורם לתגובת Th2 בלבד, מה שיכול להסביר את ההתנגדות הגבוהה יותר של האחרון לקראת אישור MoDC23. ההפעלה של MoDCs נגד Brucella canis (B. canis) דווחה גם בכלבים ובבני אדם, כלומר זה יכול לייצג מנגנון זיהום זואונוטי24. MoDCs אנושיים עם B. canis גורמים לתגובת Th1 חזקה המקנה עמידות לזיהום חמור, בעוד ש-MoDCs לכלבים גורמים לתגובת Th17 דומיננטית עם תגובת Th1 מופחתת, מה שמוביל לאחר מכן לביסוס זיהום כרוני25. MoDCs של בקר מראים זיקה מוגברת לווירוס מחלת הפה והטלפיים (FMDV) מצומד לאימונוגלובולין G (IgG) בהשוואה ל- FMDV לא מצומד בלבד, שכן MoDCs יוצרים קומפלקס נוגדנים נגיפי בתגובה ל-10 הראשונים. יחד, מחקרים אלה מראים כיצד נעשה שימוש ב-MoDCs כדי לנתח את המורכבות של תגובות חיסוניות במהלך זיהום פתוגן. ניתן להעריך את התגובה החיסונית הנרכשת על ידי כימות של סמנים ספציפיים הקשורים לשגשוג לימפוציטים. Ki-67, חלבון תוך-תאי המזוהה רק בתאים מתחלקים, נחשב לסמן אמין למחקרי התפשטות26, ובאופן דומה, CD25 המתבטא על פני השטח של תאי T בשלב המאוחר של ההפעלה מתאים להתרבות לימפוציטים27,28.
מחקר זה מדגים שיטה מתוקננת לייצור במבחנה של MoDCs בקר, ולאחר מכן יישומם בבדיקת חיסון חוץ גופית המשמשת לבדיקת האימונוגניות של חיסונים. חיסון כלבת זמין מסחרית (RV) שימש כדי לאמת את היעילות של בדיקה זו. הפעלה והתפשטות של לימפוציטים מסוג T נמדדו על ידי ציטומטריית זרימה, תגובת שרשרת כמותית בזמן אמת של פולימראז (qPCR) ובדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזימים (ELISA) באמצעות ניתוח של סמני הפעלת תאים מבוססים היטב כגון Ki-67 ו- CD25 והפרשת IFN-γ 28,29,30,31. במהלך הניסוי של משרד ההגנה לא נערכו ניסויים בבעלי חיים או בבני אדם.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher</td>
			<td>A1049201</td>
			<td>Ammonium-Chloride-Potassium buffer for lysis of residual RBCs in harvested PBMC Fraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Heparin Tubes</td>
			<td>Becton, Dickinson (BD) and Company</td>
			<td>366480</td>
			<td>10 mL, additive sodium heparin 158 USP units, glass tube, 16 x 100 mm size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Dendritic Cell Growth Kit</td>
			<td>Bio-Rad, UK</td>
			<td>PBP015KZZ</td>
			<td>Cytokine cocktail composed of recombinant bovine IL-4 and GM-CSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine IFN-&#947; ELISA Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA5638KZZ</td>
			<td>Kit use for measuring IFN-&#947; expression in culture supernatant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA2678F</td>
			<td>Mouse anti-bovine CD14 monoclonal antibody, clone CC-G33, isotype IgG1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD25 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA2430PE</td>
			<td>Mouse anti bovine CD25 monoclonal antibody, clone IL-A11, isotype IgG1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA1653A647</td>
			<td>Mouse anti bovine CD4 monoclonal antibody, clone CC8, isotype IgG2a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD40 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA2431F</td>
			<td>Mouse anti-bovine CD40 monoclonal antibody, clone IL-A156, isotype IgG1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA837F</td>
			<td>Mouse anti bovine CD8 monoclonal antibody, clone CC63, isotype IgG2a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD86 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA2437PE</td>
			<td>Mouse anti-bovine CD86 monoclonal antibody, clone IL-A190, isotype IgG1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>-</td>
			<td>Thermal cycler PCR machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Centrifuge Tube</td>
			<td>Falcon Corning&#160;</td>
			<td>352096 &#38; 352070</td>
			<td>15 mL and 50 mL, high-clarity poypropylene conical bottom, graduated, sterial, seal screw cap, falcon tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix/Cytoperm Plus</td>
			<td>BD Bio Sciences</td>
			<td>555028</td>
			<td>Fixation/permeabilization kit with BD golgiPlug, use for flow cytometer cell staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1009832500</td>
			<td>Absolute for analysis EMSURE&#160;ACS,ISO, Reag. Ph Eur</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher</td>
			<td>10500064</td>
			<td>Qualified, heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll Plaque PLUS</td>
			<td>GE Health care Life Sciences, USA</td>
			<td>341691</td>
			<td>Lymphocyte-isolation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowClean Cleaning Agent</td>
			<td>Beckman Coulter, Life Sciences</td>
			<td>A64669</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>FlowJo, Becton, Dickinson (BD) and Company, LLC, USA</td>
			<td>-</td>
			<td>Flow cytometer Histogram software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowTubes/ FACS&#160; (Fluorescence-activated single-cell sorting) Tube</td>
			<td>Falcon Corning&#160;</td>
			<td>352235</td>
			<td>5 mL, sterial, round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap, use in flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresceinisothiocynat-Dextran</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>60842-46-8</td>
			<td>FITC-dextran MW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallios Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>-</td>
			<td>Flow cytometer machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard-Shell 96-Well PCR Plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSP9601</td>
			<td>96 well, low profile, thin wall, skirted, white/clear</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human CD14 MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi Bioteck, Germany</td>
			<td>130-050-201</td>
			<td>2 mL microbeads conjugated to monoclonal anti-human CD14 antibody isotype IgG2a, used for selection of bovine monocytes from PBMCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaluza</td>
			<td>Beckman Coulter, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>Flow cytometer multicolor data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Column</td>
			<td>Miltenyi Bioteck, Germany</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Magnetic activated cell sorting or immune magentic cell separation colum for separation of various CD14 cell population based on cell surface antigens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC Class II DQ DR Polymorphic Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA2228F</td>
			<td>Mouse anti-sheep MHC Class II DQ DR Polymorphic:FITC, clone 49.1, isotype IgG2a, cross reactive with bovine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>HS4325</td>
			<td>1.5 mL, conical bottom, graduated, sterial tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Power Point</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>-</td>
			<td>The graphical illustrations of experimental design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 Negative Control:FITC for CD14, CD40 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA928F</td>
			<td>Isotype control CD14 and CD40 monoclonal antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 Negative Control:PE for CD86 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA928PE</td>
			<td>Isotype control CD86 monoclonal antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 Negative Control:RPE for CD25 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA928PE</td>
			<td>Isotype control CD25 monoclonal antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG2a Negative Control:FITC for MHC Class II Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA929F</td>
			<td>Isotype control for MHC class II monoclonal antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nobivac Rabies</td>
			<td>MSD Animal Health, UK</td>
			<td>-</td>
			<td>1 &#181;L/mL of cell cultured inactivated vaccine containing &#62; 2 I.U./mL Rabies virus strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical seals</td>
			<td>Bi0-Rad</td>
			<td>TCS0803</td>
			<td>0.2 mL flat PCR tube 8-cap strips, optical, ultraclear, compatible for qPCR machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td>pH 7.4, 1x concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism - GraphPad 5 Software&#160;</td>
			<td>Dotmatics</td>
			<td>-</td>
			<td>Statistical software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Anti-human Ki-67 antibody</td>
			<td>Biolegend, USA</td>
			<td>350501</td>
			<td>Monoclonal antibody, cross reactive with cow, clone ki-67</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Mouse IgG1 k Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>400101</td>
			<td>Isotype control for Ki-67 monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>READIDROP Propidium Iodide</td>
			<td>BD Bio Sciences</td>
			<td>1351101</td>
			<td>Live/dead cell marker used for flow cytometry, amine reactive dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-2 Protein</td>
			<td>R&#38;D System, USA</td>
			<td>202-IL-010/CF</td>
			<td>Interleukin-2, 20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74106</td>
			<td>Kit use for extraction of total RNA; RLT buffer = lysis buffer; RW1 buffer = stringent guanidine-containing washing buffer; RDD buffer = DNase buffer; RPE buffer = mild wash buffer; RNaseOUT = RNase inhibitor.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td>Cell culture media with L-glutamine and sodium bicarbonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMART-servier medical art&#160;</td>
			<td>Les Laboratories Servier</td>
			<td>-</td>
			<td>Licensed under a creative commons attribution 3.0 unported license</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>172-5270</td>
			<td>2x qPCR mix conatins dNTPs, Ss07d fusion polymerase, MgCl2, SYBR Green I supermix = supermix, ROX normalization dyes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III First-Strand Synthesis System</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher</td>
			<td>18080051</td>
			<td>Kit for cDNA synthsis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Test plate 24</td>
			<td>TPP, Switzerland</td>
			<td>92024</td>
			<td>24 well plate, sterilized by radiation , growth enhanced treated, volume 3.18 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher</td>
			<td>15250061</td>
			<td>0.4%, 100 mL, dye to assess cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher</td>
			<td>10977023</td>
			<td>0.1 &#181;m membrane filtered distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15206067</td>
			<td>VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes have a green top and contain spray-dried lithium, sodium or ammonium heparin on the inner walls and are usedin clinical chemistry, immunology and serology. The anticoagulant heparin activates antithrombin, which blocks the clotting cascade and thus produces a whole blood/plasma sample.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W3500-1L</td>
			<td>Sterile-filtered, bioReagent suitable for cell culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of vaccine immunogenicity using bovine monocyte-derived dendritic cells

תאים דנדריטיים (DCs) הם התאים מציגי האנטיגן (APC) החזקים ביותר במערכת החיסון. הם מסיירים באורגניזם בחיפוש אחר פתוגנים וממלאים תפקיד ייחודי במערכת החיסון על ידי קישור בין תגובות החיסון המולדות והנרכשות. תאים אלה יכולים לבצע פגוציטים ולאחר מכן להציג אנטיגנים שנלכדו לתאי מערכת החיסון המשפיעים, מה שמעורר מגוון רחב של תגובות חיסוניות. מאמר זה מדגים שיטה סטנדרטית לייצור במבחנה של תאים דנדריטיים שמקורם במונוציטים של בקר (MoDCs) שבודדו מתאי דם חד-גרעיניים היקפיים של בקר (PBMCs) ויישומם בהערכת אימונוגניות חיסונים.
מיון תאים מבוסס מגנטית שימש לבידוד מונוציטים CD14+ מ- PBMCs, ותוספת של מדיום תרבית שלם עם אינטרלוקין (IL)-4 וגורם מגרה מושבת גרנולוציטים-מקרופאגים (GM-CSF) שימשה כדי לגרום להתמיינות של מונוציטים CD14+ ל- MoDCs נאיביים. הדור של MoDCs לא בשלים אושר על ידי זיהוי הביטוי של קומפלקס היסטותאימות גדול II (MHC II), CD86 ו- CD40 פני השטח של התא. חיסון כלבת זמין מסחרית שימש כדי לפעום את MoDCs לא בשלים, אשר לאחר מכן תורבתו יחד עם לימפוציטים נאיביים.
ניתוח ציטומטריית הזרימה של MoDCs פועמים אנטיגן ותרבית לימפוציטים משותפת חשף את הגירוי של התפשטות לימפוציטים מסוג T באמצעות ביטוי של סמני Ki-67, CD25, CD4 ו- CD8. ניתוח ביטוי ה-mRNA של IFN-γ ו-Ki-67, תוך שימוש ב-PCR כמותי, הראה כי ה-MoDCs יכולים לגרום לפרימה ספציפית לאנטיגן של לימפוציטים במערכת זו של תרבית משותפת במבחנה . יתר על כן, הפרשת IFN-γ שהוערכה באמצעות ELISA הראתה טיטר גבוה משמעותית (**p < 0.01) בתרבית הלימפוציטים MoDC-לימפוציטים פועמת חיסון כלבת מאשר בתרבית לימפוציטים MoDC-לימפוציטים ללא אנטיגן. תוצאות אלה מראות את התוקף של בדיקת MoDC במבחנה זו למדידת אימונוגניות חיסונים, כלומר ניתן להשתמש בבדיקה זו כדי לזהות מועמדים פוטנציאליים לחיסון בקר לפני שתמשיך בניסויי in vivo , כמו גם בהערכות אימונוגניות חיסונים של חיסונים מסחריים.

מתודולוגיה זו מתארת את הדור במבחנה של MoDCs בקר להערכת אנטיגנים מועמדים לחיסון לפני ביצוע מחקרי in vivo. איור 1 מדגים את התוכנית הניסיונית של יצירת MoDC בקר ואת היישום של MoDCs עבור בדיקות במבחנה. באמצעות טכניקת מיון תאים מבוססת מגנטיות, ניתן היה לאסוף כ -26 מיליון מיוצי?...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells at JoVE.com

Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells

המתודולוגיה מתארת את הייצור של תאים דנדריטיים שמקורם במונוציטים של בקר (MoDCs) ואת יישומם להערכה חוץ גופית של מועמדים אנטיגניים במהלך הפיתוח של חיסונים וטרינריים פוטנציאליים בבקר.

קביעת אימונוגניות החיסון באמצעות תאים דנדריטיים שמקורם במונוציטים של בקר

Dendritic cells (DCs) are the most potent antigen-presenting cells (APCs) within the immune system. They patrol the organism looking for pathogens and ...

פרוטוקול זה מייצג בדיקה פונקציונלית במבחנה באמצעות תאים דנדריטיים שמקורם במונוציטים של בקר כדי למדוד אימונוגניות של חיסונים לפני מחקרי in vivo. לכן, מילוי פער קיים בחיסון בעלי חיים. זהו הדור והיישום של תאים דנדריטיים.כתאים מציגי האנטיגן החזקים ביותר, תאים דנדריטיים הפכו ליעד מחקרי מרכזי להבנת מנגנוני חיסון תוך-תאיים, כולל יעילות החיסון. בדיקה זו יכולה להיות מיושמת ככלי לסינון מועמדים לחיסון, כמצב בקרת איכות לייצור חיסונים, ולבחירת אנטיגן ואדג'ובנט. מי שידגים את ההליך יהיה ריצ'רד קנגתה, מדען במעבדה לייצור ובריאות בעלי חיים.התחל על ידי היפוך וערבוב הדם המתקבל ניקוב הווריד הצווארי של העגל עם vacutainers heparinized. לאחר מכן להעביר 20 מיליליטר של דם heparinized צינור סטרילי 50 מיליליטר לדלל אותו עם 10 מיליליטר של פוספט buffered מלוחים או PBS. פיפטה 15 מיליליטר של בידוד לימפוציטים בינוני לצינור סטרילי 50 מיליליטר להטות את הצינור למצב 45 מעלות.בזהירות שכבה 30 מיליליטר של דם PBS בינוני על גבי בידוד לימפוציטים באמצעות פיפטה 25 מיליליטר ולאט לאט להחזיר את הצינור למצב אנכי לפני צנטריפוגה אותו. לאחר מכן לאסוף את השכבה הלבנה הדקה של תאים חד גרעיניים דם היקפיים או שכבת PBMC באמצעות פיפטה פסטר ולהעביר אותו לתוך צינור 50 מיליליטר חדש. שטפו את מרכזיות ה-PBMC שנקטפו פעמיים באמצעות 40 מיליליטר PBS לשטיפה וערבבו היטב.לאחר הצנטריפוגה, להשהות מחדש את הגלולה ב 15 מיליליטר של חיץ אשלגן אמוניום כלורי או חיץ ACK. לאחר 10 עד 15 דקות של דגירה בטמפרטורת החדר, להוסיף עד 40 מיליליטר של PBS וצנטריפוגה את הצינור עם תאוצה והאטה מקסימלית. להשהות את הגלולה ב 10 מיליליטר של מדיום תרבית שלם.לאחר מכן הוסף חמישה מיקרוליטרים של חיץ CD14 MicroBead לכל 10 מיליון תאים וערבב היטב באמצעות פיפטה. לניתוח ציטומטריית זרימה, הוסף 10 מיקרוליטר של נוגדן מכתים פלואורסצאין CD14 או FITC ל- PBMCs ודגר עליו במשך 15 דקות בארבע עד שמונה מעלות צלזיוס לפני שתמשיך עם ציטומטריית הזרימה. למרכזיות הלא מוכתמות, הוסיפו מיליליטר אחד של מאגר פקס וצנטריפוגו אותו למשך שבע דקות בטמפרטורה של 500 גרם וארבע מעלות צלזיוס.לאחר מכן להשעות מחדש את הגלולה ב 500 מיקרוליטר של מאגר פקס לכל 100 מיליון תאים. לאחר מכן, הכנס את עמודת הפרדת התאים האימונומגנטית למפריד ומקם צינור איסוף של 50 מיליליטר מתחת לשקע העמוד לאיסוף הזרימה. לאחר שטיפת העמוד עם מאגר פקס נטול גז של מיליליטר אחד, החלף את צינור ה- 15 מיליליטר המשומש בחדש.פיפטה מאה מיליון תאים ב-500 מיקרוליטר חיץ בכל פעם, מה שמאפשר לתרחיף התא לעבור דרך העמודה. לאחר מכן שטפו את העמוד שלוש פעמים עם שלושה מיליליטר של מאגר פקס נטול גז בכל פעם. לאחר איסוף הזרימה, תייגו את מקטע הלימפוציטים הנאיבי המדולל הראשון כשבר התא השלילי CD14.מוציאים את העמוד מהמפריד ומניחים צינור סטרילי חדש של 15 מיליליטר מתחת לטור לאיסוף הקולחים. הוסף חמישה מיליליטר של מאגר פקס לעמודה ודחף אותו מיד באמצעות הבוכנה. אסוף ותייג את הזרימה השנייה או את מקטע המונוציטים התמים כשבר התא החיובי CD14.הוסף מדיום תרבית שלם למונוציטים החיוביים CD14 שנקטפו כדי להשיג 1 מיליון תאים למיליליטר. לאחר מכן, הוסיפו תרחיף של מיליליטר אחד לכל באר של צלחת סטרילית בת 24 בארות לפני שתשלימו כל באר 40 מיקרוליטר של קוקטייל הציטוקינים המסופק בערכה. ביום השני, העבירו מחצית מתכולת כל באר לצינורות בודדים של 1.5 מיליליטר באמצעות פיפטה.לאחר צנטריפוגה של צינורות 1.5 מיליליטר במשקל 500 גרם למשך שבע דקות, יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש את הגלולה ב-500 מיקרוליטר של מדיום תרבית שלם טרי. העבר 500 מיקרוליטר של השעיית התא המושעה חזרה לבארות המתאימות, כך שהנפח הסופי בבאר יהפוך למיליליטר אחד. העשירו כל באר ב-20 מיקרוליטר קוקטייל ציטוקינים.כדי לייצר MoDC בפולסי אנטיגן, יש להוסיף מיקרוליטר אחד למיליליטר של חיסון נגד נגיף הכלבת או תרחיף RV למיליליטר אחד של תרבית תמימה של MoDC בצלחת בת 24 הקידוחים ולדגור על הצלחת במשך 48 שעות ב-5% פחמן דו-חמצני ו-37 מעלות צלזיוס. ביום השביעי, יש לשמור את צלחת 24 הקידוחים המכילה את פעימות האנטיגן MoDCs על קרח למשך 10 דקות לפני הוספת מיליליטר אחד של PBS קר כקרח לכל באר וערבוב יסודי. מעבירים את המתלה לצינור 15 מיליליטר.לשטוף את הבארות עם שני מיליליטר של PBS קר כקרח. לאסוף את התאים שיורית בתוך כל באר ולהעביר את התוכן שטוף לתוך צינורות המתאימים שלהם. צנטריפוגו את מתלה התא ב-500 גרם למשך שבע דקות.לאחר השלכת הסופרנטנט, השהה מחדש את כדורית תא MoDCs בפולס אנטיגן בתווך תרבית שלם כדי להתאים את הריכוז הסופי של 100, 000 תאים למיליליטר. עבור תרבית משותפת של לימפוציטים MoDC, זרעו את הבארות של צלחת סטרילית בת 24 בארות עם מיליליטר אחד של תרחיף תאי הלימפוציטים התמים ומיליליטר אחד של תרחיף MoDC בפולס אנטיגן או שאינו דופק אנטיגן ביום השביעי של דופק האנטיגן. לאחר יומיים של דגירה, להשלים כל באר עם 20 ננוגרם למיליליטר רקומביננטי אינטרלוקין-2 ולהמשיך את הדגירה במשך 120 שעות נוספות.ביום ה-14 מעבירים מיליליטר אחד מהתרבית המשותפת לצינור סטרילי של 1.5 מיליליטר וצנטריפוגה את הצינור. לאחר מכן להשעות מחדש את גלולת התא עם מיליליטר אחד של MoDCs דופקים אנטיגן או לא פועמים. מערבבים היטב ומעבירים את מתלי התאים לבארות המתאימות להם.לאחר צביעת פני התא של PBMCs ולימפוציטים ומונוציטים נאיביים, מעבירים מיליליטר אחד מתרחיף התא לצינור סטרילי של 1.5 מיליליטר באמצעות פיפטה וצנטריפוגה למשך 10 דקות במשקל 500 גרם. לאחר מכן להשעות את הגלולה במיליליטר אחד של PBS ולהעביר אותו צינור 15 מיליליטר. כמו כן לאסוף את התאים שיורית ואת צינורות המתאימים באמצעות מיליליטר אחד של PBS.לאחר מכן להוסיף 10 מיליליטר של PBS לצינור 15 מיליליטר המכיל את התאים ולערבב על ידי pipetting. לאחר צנטריפוגה של הצינור במשך שבע דקות במשקל של 850 גרם, מוציאים את הסופרנאטנט ובזהירות משעים מחדש את גלולת התא עם שאריות מתלה שנותרו לאחר פירוק הסופרנטנט. העבירו את מתלה התא לצלחת V בעלת 96 בארות ואטמו את הבארות כדי למנוע שפיכה.לאחר השלמת הצביעה, בצע את ניתוח ציטומטר הזרימה. מהתצוגה המקדימה בזמן אמת, התאם את סף הפלואורסצנטיות כולל מתח ורווח וגודל התא כדי לצייר בסופו של דבר שערים סביב אוכלוסיית התאים הרצויה תוך אי הכללת פסולת תאית. צביעת תאי CD14 וציטומטריית זרימה הראו כי מקטע המונוציטים התמים כלל 98% תאי מונוציטים חיוביים CD14 והיה מסוגל מבחינה תפקודית לקלוט אנטיגן.ה-MoDCs הנאיביים שהתאפיינו פנוטיפית בהערכת הביטוי של MHC Class 2 וסמני פני השטח של תאי CD86 ו-CD40 אימתו את התאים הדנדריטיים או את הפנוטיפ דמוי DC. במהלך תרבית לימפוציטים משותפת של MoDC ביום התשיעי, נצפה שינוי מורפולוגי המראה התרחבות דנדריט בדופק RV ל- MoDCs. בהשוואה לתרבית לימפוציטים MoDC ללא פעימות, הודגמה עלייה משמעותית בהתפשטות הלימפוציטים על ידי הגברת הוויסות של סמני ההפעלה Ki67 ו- CD25 על תאי T חיוביים CD4 ו- CD8 חיוביים ביום ה -16 בתרבית משותפת של לימפוציטים MoDC פועמים.תאי ה-T החיוביים ל-CD8 מתרביות ה-MoDC הבוגרות עם פעימות RV הציגו עלייה של פי שמונה ב-Ki67 בהשוואה לקבוצה הלא ספציפית. התאים החיוביים ל-CD4 באותה תרבית משותפת הראו עלייה של פי שבעה ב-Ki67 בהשוואה לקבוצת הביקורת, מה שמדגים את היכולת של RV primed MoDCs להציג את האנטיגן RV ללימפוציטים נאיביים ולהפעיל אותם במצב של מבחנה. כימות qPCR של תרביות משותפות הראה עלייה של יותר מ-30% בביטוי גמא אינטרפרון ויותר מ-5% בביטוי Ki67 בכל התרביות המשותפות שהשתמשו ב-GAPDH ככיול.ריכוז גבוה משמעותית של אינטרפרון גמא מופרש נצפה בתרבית הלימפוציטים של RV בפולסים של MoDC בהשוואה לקבוצת הטיפול הלא ספציפית. בצע את שלב השכבות לאט מאוד ובזהירות, להבטיח כי הדם מונח על גבי מדיום בידוד הלימפוציטים. היזהר במיוחד לאסוף את כל PBMCs מבלי לאסוף יותר מדי חומר מהשכבות האחרות.שיטות אחרות כגון ציטומטריה זרימה, ELISA ו PCR כמותי, בין היתר, ניתן ליישם לאחר הליך זה כדי להעריך את ההפעלה של סמנים חיסוניים.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

בידוד של ריאות תאים דנדריטים עכבר

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells

יצירת חיסון חדשני לתאים דנדריטיים באמצעות מלנומה ותאי גזע סרטניים קשקשיים

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H ...

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â² in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

הפעלה ומדידה של NLRP3 Inflammasome פעילות באמצעות IL-1β בתאים דנדריטים נגזרות מונוציטים אדם

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

תרבות של Macrophage מושבה מגרה פקטור בדיל אדם המקרופאגים מונוציטים הנגזר

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

אפיון של תאי דנדריטים אדם נגזר מונוציטים ידי cytometry זרימת הדמיה: השוואה בין שני פרוטוקולי בידוד מונוציטים

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

דור של תאי דנדריטים אדם נגזר מונוציטים מן הדם מלא

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

פיתוח ובדיקת של מולקולה בודדת העדינה מערך דיגיטלי מקושרים-אנזים Immunosorbent Assay עבור אינטרפרון אנושי-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

siRNA Electroporation to Modulate Autophagy in Herpes Simplex Virus Type 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells

siRNA אלקטרופורציה כדי לווסת את החלונות האוטומטיים בווירוס הרפס סוג 1-מונוציט הנגזר מונולוייט תאים דנדריטים

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) induces autophagy in both, immature dendritic cells (iDCs) as well as mature dendritic cells (mDCs), whereas ...

In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

בגירוי חוץ-גופית והדמיה של שחרור מלכודת השמנה ב הבדיל מונוקרוציט האדם הנגזר

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic ...

Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages

הדמיה של קספאזות דלקתיות המושרות קרבה במקרופאגים שמקורם במונוציטים אנושיים

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct ...