Name: determination of vaccine immunogenicity using bovine monocyte-derived dendritic cells
Uploaded: 2023-05-19T12:30:00
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Ringraziamo la dottoressa Eveline Wodak e la dottoressa Angelika Loistch (AGES) per il loro supporto nel determinare lo stato di salute degli animali e per aver fornito BTV, il dottor Bernhard Reinelt per aver fornito sangue bovino e il dottor Bharani Settypalli e il dottor William Dundon dell'AIEA per consigli utili rispettivamente sugli esperimenti di PCR in tempo reale e sull'editing linguistico.

La raccolta del sangue viene eseguita da un servizio veterinario certificato in conformità con le linee guida etiche dell'Agenzia austriaca per la salute e la sicurezza alimentare (AGES) e in conformità con gli standard accettati in materia di benessere degli animali32. Lo studio ha ricevuto l'approvazione etica dal Ministero dell'Agricoltura austriaco. Il progetto sperimentale per la generazione di MoDC e la sua successiva applicazione è illustrato nella Figura 1....

Questo studio dimostra un metodo standardizzato in vitro per generare e fenotipizzare MoDC bovine e il loro successivo utilizzo nella misurazione dell'immunogenicità del vaccino di un vaccino commerciale (ad esempio, RV). I MoDC bovini possono essere utilizzati come strumento per lo screening di potenziali antigeni vaccinali contro le malattie del bestiame e prevedere il loro potenziale impatto clinico sulla base delle risposte immunitarie prima di procedere verso studi in vivo sugli animali. I MoDC ge...

La vaccinazione veterinaria rappresenta un aspetto cruciale della zootecnia e della salute, in quanto contribuisce a migliorare la sicurezza alimentare e il benessere degli animali conferendo protezione contro le malattie che colpiscono il settore zootecnico a livello globale1. Un metodo efficace in vitro per valutare l'immunogenicità di possibili candidati vaccini contribuirebbe ad accelerare il processo di sviluppo e produzione del vaccino. È quindi necessario ampliare il campo dei saggi immunitari con metodologie innovative basate su studi in vitro, in quanto ciò contribuirebbe a svelare la complessità dei processi immunitari legati all'immunizzazione e all'infezione da patogeni. Attualmente, gli studi di immunizzazione e di provocazione animale in vivo , che richiedono campionamenti periodici (ad esempio, sangue e milza), vengono utilizzati per misurare l'immunogenicità dei vaccini candidati e degli adiuvanti. Questi test sono costosi, richiedono tempo e hanno implicazioni etiche, perché nella maggior parte dei casi, l'eutanasia animale viene effettuata entro la fine delle prove.
In alternativa ai test in vivo, le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) sono state utilizzate per valutare le risposte immunitarie indotte dal vaccino in vitro2. Le PBMC sono una popolazione eterogenea di cellule composta per il 70%-90% da linfociti, per il 10%-20% da monociti e da un numero limitato di cellule dendritiche (DC, 1%-2%)3. Le PBMC ospitano cellule presentanti l'antigene (APC) come cellule B, monociti e DC, che pattugliano costantemente l'organismo alla ricerca di segni di infezione o danno tissutale. Le chemochine secrete localmente facilitano il reclutamento e l'attivazione delle APC in questi siti legandosi ai recettori della superficie cellulare. Nel caso dei monociti, le chemochine dirigono il loro destino a differenziarsi in DC o macrofagi4. Non appena le DC incontrano e catturano un agente patogeno, migrano verso organi linfoidi secondari, dove possono presentare gli antigeni peptidici patogeni trasformati utilizzando proteine di superficie di classe I o di classe II del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) rispettivamente alle cellule T CD8+ o alle cellule T CD4+, innescando così una risposta immunitaria 5,6.
Il ruolo chiave svolto dalle DC nell'orchestrare una risposta immunitaria protettiva contro vari agenti patogeni le rende un interessante obiettivo di ricerca per la comprensione dei meccanismi immunitari intracellulari, specialmente quando si progettano vaccini e adiuvanti contro agenti infettivi7. Poiché la frazione di DC che può essere ottenuta dalle PBMC è piuttosto piccola (1% -2%), i monociti sono stati invece utilizzati per generare DC in vitro8. Queste DC derivate da monociti (MoDC) sono state inizialmente sviluppate come possibile strategia di trattamento nell'immunoterapia del cancro9. Più recentemente, i MoDC sono stati utilizzati per la ricerca sui vaccini 10,11,12 e i monociti classici sono il sottotipo predominante (89%) per la produzione di MoDC 13. La produzione di MoDC in vitro è stata precedentemente ottenuta attraverso l'aggiunta del fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi (GM-CSF) somministrato in combinazione con altre citochine come l'interleuchina-4 (IL-4), il fattore di necrosi tumorale α (TNF-α) o IL-1314,15,16.
Il successo di un test MoDC in vitro si basa sulla capacità dei MoDC maturi stimolati dall'antigene di modulare l'estensione e il tipo di risposta immunitaria specifica per il tipo di antigene rilevato17. Il tipo di patogeno riconosciuto e presentato dalle MoDC determina la differenziazione delle cellule T helper (Th) CD4+ in cellule effettrici Th1, Th2 o Th17 ed è caratterizzato da un profilo di citochine secretorie specifiche per patogeno. Una risposta Th1 è suscitata contro i patogeni intracellulari e provoca la secrezione di interferone-gamma (IFN-γ) e fattore di necrosi tumorale beta (TNF-β), che modula la protezione fagocitico-dipendente. Una risposta Th2 viene attivata contro gli organismi parassiti ed è caratterizzata dalla secrezione di IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13, che avvia la protezione umorale fagocitica-indipendente. Th17 offre protezione neutrofili-dipendente contro le infezioni batteriche e fungine extracellulari mediate dalla secrezione di IL-17, IL-17F, IL-6, IL-22 e TNF-α 18,19,20,21. Sulla base di studi precedenti, è stato notato che non tutti i patogeni rientrano nel profilo di citochine atteso. Ad esempio, le MoDC dermiche, in risposta all'infezione parassitaria da Leishmania, stimolano la secrezione di IFN-γ dalle cellule T CD4+ e dalle cellule T CD8+, inducendo così una risposta protettiva proinfiammatoria Th122.
È stato anche dimostrato che, nei MoDC di pollo innescati con Salmonella lipopolisaccaride (LPS), possono indurre una risposta variabile contro Salmonella typhimurium attivando sia le risposte Th1 che Th2, mentre Salmonella gallinarum induce una risposta Th2 da sola, il che potrebbe spiegare la maggiore resistenza di quest'ultima verso la clearance MoDC23. L'attivazione di MoDC contro Brucella canis (B. canis) è stata riportata anche in MoDC sia canine che umane, il che significa che questo potrebbe rappresentare un meccanismo di infezione zoonotica24. I MoDC umani innescati con B. canis inducono una forte risposta Th1 che conferisce resistenza a infezioni gravi, mentre i MoDC canini inducono una risposta Th17 dominante con una risposta Th1 ridotta, portando successivamente all'instaurazione di infezione cronica25. Le MoDC bovine mostrano una maggiore affinità per il virus dell'afta epizootica (FMDV) coniugato con immunoglobuline G (IgG) rispetto all'FMDV non coniugato da solo, poiché i MoDC formano un complesso di anticorpi virali in risposta ai primi10. Nel loro insieme, questi studi mostrano come le MoDC sono state utilizzate per analizzare la complessità delle risposte immunitarie durante l'infezione da patogeni. Le risposte immunitarie adattative possono essere valutate mediante la quantificazione di specifici marcatori associati alla proliferazione linfocitaria. Ki-67, una proteina intracellulare rilevata solo nelle cellule in divisione, è considerata un marker affidabile per gli studi di proliferazione26, e allo stesso modo, CD25 espresso sulla superficie delle cellule T durante la fase tardiva di attivazione corrisponde alla proliferazione linfocitaria27,28.
Questo studio dimostra un metodo standardizzato per la generazione in vitro di MoDC per bovini seguita dalla loro applicazione in un test immunitario in vitro utilizzato per testare l'immunogenicità dei vaccini. Un vaccino antirabbico disponibile in commercio (RV) è stato utilizzato per convalidare l'efficacia di questo test. L'attivazione e la proliferazione dei linfociti T sono state misurate mediante citometria a flusso, reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale (qPCR) e saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) attraverso l'analisi di marcatori di attivazione cellulare ben consolidati come Ki-67 e CD25 e la secrezione di IFN-γ 28,29,30,31. Durante il test MoDC non vengono eseguite prove sperimentali su animali o sull'uomo.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher</td>
			<td>A1049201</td>
			<td>Ammonium-Chloride-Potassium buffer for lysis of residual RBCs in harvested PBMC Fraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Heparin Tubes</td>
			<td>Becton, Dickinson (BD) and Company</td>
			<td>366480</td>
			<td>10 mL, additive sodium heparin 158 USP units, glass tube, 16 x 100 mm size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Dendritic Cell Growth Kit</td>
			<td>Bio-Rad, UK</td>
			<td>PBP015KZZ</td>
			<td>Cytokine cocktail composed of recombinant bovine IL-4 and GM-CSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine IFN-&#947; ELISA Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA5638KZZ</td>
			<td>Kit use for measuring IFN-&#947; expression in culture supernatant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA2678F</td>
			<td>Mouse anti-bovine CD14 monoclonal antibody, clone CC-G33, isotype IgG1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD25 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA2430PE</td>
			<td>Mouse anti bovine CD25 monoclonal antibody, clone IL-A11, isotype IgG1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA1653A647</td>
			<td>Mouse anti bovine CD4 monoclonal antibody, clone CC8, isotype IgG2a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD40 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA2431F</td>
			<td>Mouse anti-bovine CD40 monoclonal antibody, clone IL-A156, isotype IgG1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA837F</td>
			<td>Mouse anti bovine CD8 monoclonal antibody, clone CC63, isotype IgG2a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD86 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA2437PE</td>
			<td>Mouse anti-bovine CD86 monoclonal antibody, clone IL-A190, isotype IgG1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>-</td>
			<td>Thermal cycler PCR machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Centrifuge Tube</td>
			<td>Falcon Corning&#160;</td>
			<td>352096 &#38; 352070</td>
			<td>15 mL and 50 mL, high-clarity poypropylene conical bottom, graduated, sterial, seal screw cap, falcon tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix/Cytoperm Plus</td>
			<td>BD Bio Sciences</td>
			<td>555028</td>
			<td>Fixation/permeabilization kit with BD golgiPlug, use for flow cytometer cell staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1009832500</td>
			<td>Absolute for analysis EMSURE&#160;ACS,ISO, Reag. Ph Eur</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher</td>
			<td>10500064</td>
			<td>Qualified, heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll Plaque PLUS</td>
			<td>GE Health care Life Sciences, USA</td>
			<td>341691</td>
			<td>Lymphocyte-isolation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowClean Cleaning Agent</td>
			<td>Beckman Coulter, Life Sciences</td>
			<td>A64669</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>FlowJo, Becton, Dickinson (BD) and Company, LLC, USA</td>
			<td>-</td>
			<td>Flow cytometer Histogram software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowTubes/ FACS&#160; (Fluorescence-activated single-cell sorting) Tube</td>
			<td>Falcon Corning&#160;</td>
			<td>352235</td>
			<td>5 mL, sterial, round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap, use in flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresceinisothiocynat-Dextran</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>60842-46-8</td>
			<td>FITC-dextran MW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallios Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>-</td>
			<td>Flow cytometer machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard-Shell 96-Well PCR Plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSP9601</td>
			<td>96 well, low profile, thin wall, skirted, white/clear</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human CD14 MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi Bioteck, Germany</td>
			<td>130-050-201</td>
			<td>2 mL microbeads conjugated to monoclonal anti-human CD14 antibody isotype IgG2a, used for selection of bovine monocytes from PBMCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaluza</td>
			<td>Beckman Coulter, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>Flow cytometer multicolor data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Column</td>
			<td>Miltenyi Bioteck, Germany</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Magnetic activated cell sorting or immune magentic cell separation colum for separation of various CD14 cell population based on cell surface antigens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC Class II DQ DR Polymorphic Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA2228F</td>
			<td>Mouse anti-sheep MHC Class II DQ DR Polymorphic:FITC, clone 49.1, isotype IgG2a, cross reactive with bovine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>HS4325</td>
			<td>1.5 mL, conical bottom, graduated, sterial tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Power Point</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>-</td>
			<td>The graphical illustrations of experimental design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 Negative Control:FITC for CD14, CD40 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA928F</td>
			<td>Isotype control CD14 and CD40 monoclonal antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 Negative Control:PE for CD86 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA928PE</td>
			<td>Isotype control CD86 monoclonal antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 Negative Control:RPE for CD25 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA928PE</td>
			<td>Isotype control CD25 monoclonal antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG2a Negative Control:FITC for MHC Class II Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA929F</td>
			<td>Isotype control for MHC class II monoclonal antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nobivac Rabies</td>
			<td>MSD Animal Health, UK</td>
			<td>-</td>
			<td>1 &#181;L/mL of cell cultured inactivated vaccine containing &#62; 2 I.U./mL Rabies virus strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical seals</td>
			<td>Bi0-Rad</td>
			<td>TCS0803</td>
			<td>0.2 mL flat PCR tube 8-cap strips, optical, ultraclear, compatible for qPCR machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td>pH 7.4, 1x concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism - GraphPad 5 Software&#160;</td>
			<td>Dotmatics</td>
			<td>-</td>
			<td>Statistical software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Anti-human Ki-67 antibody</td>
			<td>Biolegend, USA</td>
			<td>350501</td>
			<td>Monoclonal antibody, cross reactive with cow, clone ki-67</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Mouse IgG1 k Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>400101</td>
			<td>Isotype control for Ki-67 monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>READIDROP Propidium Iodide</td>
			<td>BD Bio Sciences</td>
			<td>1351101</td>
			<td>Live/dead cell marker used for flow cytometry, amine reactive dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-2 Protein</td>
			<td>R&#38;D System, USA</td>
			<td>202-IL-010/CF</td>
			<td>Interleukin-2, 20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74106</td>
			<td>Kit use for extraction of total RNA; RLT buffer = lysis buffer; RW1 buffer = stringent guanidine-containing washing buffer; RDD buffer = DNase buffer; RPE buffer = mild wash buffer; RNaseOUT = RNase inhibitor.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td>Cell culture media with L-glutamine and sodium bicarbonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMART-servier medical art&#160;</td>
			<td>Les Laboratories Servier</td>
			<td>-</td>
			<td>Licensed under a creative commons attribution 3.0 unported license</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>172-5270</td>
			<td>2x qPCR mix conatins dNTPs, Ss07d fusion polymerase, MgCl2, SYBR Green I supermix = supermix, ROX normalization dyes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III First-Strand Synthesis System</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher</td>
			<td>18080051</td>
			<td>Kit for cDNA synthsis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Test plate 24</td>
			<td>TPP, Switzerland</td>
			<td>92024</td>
			<td>24 well plate, sterilized by radiation , growth enhanced treated, volume 3.18 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher</td>
			<td>15250061</td>
			<td>0.4%, 100 mL, dye to assess cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher</td>
			<td>10977023</td>
			<td>0.1 &#181;m membrane filtered distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15206067</td>
			<td>VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes have a green top and contain spray-dried lithium, sodium or ammonium heparin on the inner walls and are usedin clinical chemistry, immunology and serology. The anticoagulant heparin activates antithrombin, which blocks the clotting cascade and thus produces a whole blood/plasma sample.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W3500-1L</td>
			<td>Sterile-filtered, bioReagent suitable for cell culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of vaccine immunogenicity using bovine monocyte-derived dendritic cells

Le cellule dendritiche (DC) sono le cellule presentanti l'antigene (APC) più potenti all'interno del sistema immunitario. Pattugliano l'organismo alla ricerca di agenti patogeni e svolgono un ruolo unico all'interno del sistema immunitario collegando le risposte immunitarie innate e adattative. Queste cellule possono fagocitare e quindi presentare antigeni catturati alle cellule immunitarie effettrici, innescando una vasta gamma di risposte immunitarie. Questo articolo dimostra un metodo standardizzato per la generazione in vitro di cellule dendritiche derivate da monociti bovini (MoDC) isolate da cellule mononucleate del sangue periferico del bestiame (PBMC) e la loro applicazione nella valutazione dell'immunogenicità del vaccino.
La selezione cellulare su base magnetica è stata utilizzata per isolare i monociti CD14+ dalle PBMC e l'integrazione di terreno di coltura completo con interleuchina (IL)-4 e fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi (GM-CSF) è stata utilizzata per indurre la differenziazione dei monociti CD14+ in MoDC naïve. La generazione di MoDC immature è stata confermata rilevando l'espressione dei marcatori di superficie cellulare del complesso maggiore di istocompatibilità II (MHC II), CD86 e CD40. Un vaccino antirabbico disponibile in commercio è stato utilizzato per pulsare i MoDC immaturi, che sono stati successivamente co-coltivati con linfociti naïve.
L'analisi citometrica a flusso delle MoDC pulsate dall'antigene e della co-coltura linfocitaria ha rivelato la stimolazione della proliferazione dei linfociti T attraverso l'espressione dei marcatori Ki-67, CD25, CD4 e CD8. L'analisi dell'espressione dell'mRNA di IFN-γ e Ki-67, utilizzando la PCR quantitativa, ha mostrato che i MoDC potrebbero indurre il priming antigene-specifico dei linfociti in questo sistema di co-coltura in vitro . Inoltre, la secrezione di IFN-γ valutata utilizzando ELISA ha mostrato un titolo significativamente più alto (**p < 0,01) nella co-coltura di linfociti MoDC pulsata dal vaccino antirabbico rispetto alla co-coltura di linfociti MoDC non pulsata dall'antigene. Questi risultati mostrano la validità di questo test MoDC in vitro per misurare l'immunogenicità del vaccino, il che significa che questo test può essere utilizzato per identificare potenziali candidati vaccini per i bovini prima di procedere con studi in vivo , nonché nelle valutazioni dell'immunogenicità dei vaccini commerciali.

Questa metodologia descrive la generazione in vitro di MoDC bovini per la valutazione degli antigeni vaccinali candidati prima di eseguire studi in vivo. La figura 1 illustra lo schema sperimentale della generazione di MoDC bovini e l'applicazione dei MoDC per il saggio in vitro. Utilizzando la tecnica di selezione cellulare basata sul magnetismo, è stato possibile raccogliere circa 26 milioni di miociti CD14+ dalle PBMC raccolte, che in precedenza eran...

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Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells

La metodologia descrive la generazione di cellule dendritiche derivate da monociti bovini (MoDC) e la loro applicazione per la valutazione in vitro di candidati antigenici durante lo sviluppo di potenziali vaccini veterinari nei bovini.

Determinazione dell'immunogenicità del vaccino utilizzando cellule dendritiche derivate da monociti bovini

Dendritic cells (DCs) are the most potent antigen-presenting cells (APCs) within the immune system. They patrol the organism looking for pathogens and ...

Questo protocollo rappresenta un saggio funzionale in vitro che utilizza cellule dendritiche derivate da monociti bovini per misurare l'immunogenicità del vaccino prima degli studi in vivo. Pertanto, colmando una lacuna esistente nella vaccinologia del bestiame. È la generazione e l'applicazione di cellule dendritiche.Come le cellule presentanti l'antigene più potenti, le cellule dendritiche sono diventate un obiettivo di ricerca chiave per comprendere i meccanismi immunitari intracellulari, compresa l'efficacia del vaccino. Questo test può essere implementato come strumento per lo screening dei candidati vaccini, come stato di controllo della qualità per la produzione di vaccini e per la selezione dell'antigene e dell'adiuvante. A dimostrare la procedura sarà Richard Kangethe, scienziato del laboratorio di produzione e salute animale.Inizia invertendo e mescolando il sangue ottenuto dalla puntura della vena giugulare del vitello con vacutainers eparinizzati. Quindi trasferire 20 millilitri di sangue eparinizzato in un tubo sterile da 50 millilitri e diluirlo con 10 millilitri di soluzione salina tamponata fosfato o PBS. Pipettare 15 millilitri di terreno di isolamento dei linfociti su un tubo sterile da 50 millilitri e inclinare il tubo in una posizione di 45 gradi.Posizionare con cura 30 millilitri di terreno PBS di sangue sopra l'isolamento dei linfociti utilizzando una pipetta da 25 millilitri e riportare lentamente il tubo in posizione verticale prima di centrifugarlo. Quindi raccogliere il sottile strato bianco di cellule mononucleate del sangue periferico o strato di PBMC utilizzando una pipetta Pasteur e trasferirlo in un nuovo tubo da 50 millilitri. Lavare i PBMC raccolti due volte utilizzando 40 millilitri di PBS per lavaggio e mescolare accuratamente.Dopo la centrifugazione, risospendere il pellet in 15 millilitri di tampone di potassio cloruro di ammonio o tampone ACK. Dopo 10-15 minuti di incubazione a temperatura ambiente, aggiungere fino a 40 millilitri di PBS e centrifugare il tubo con la massima accelerazione e decelerazione. Risospendere il pellet in 10 millilitri di terreno di coltura completo.Quindi aggiungere cinque microlitri di tampone CD14 MicroBead per 10 milioni di cellule e mescolare accuratamente usando una pipetta. Per l'analisi della citometria a flusso, aggiungere 10 microlitri di isotiocianato di fluoresceina CD14 o anticorpo colorante FITC alle PBMC e incubarlo per 15 minuti a quattro-otto gradi Celsius prima di procedere con la citometria a flusso. Alle PBMC non macchiate, aggiungere un millilitro di tampone fax e centrifugarlo per sette minuti a 500 g e quattro gradi Celsius.Quindi risospendere il pellet in 500 microlitri di tampone fax per 100 milioni di celle. Quindi, inserire la colonna di separazione cellulare immunomagnetica nel separatore e posizionare un tubo di raccolta da 50 millilitri sotto l'uscita della colonna per raccogliere il flusso attraverso. Dopo aver lavato la colonna con un buffer fax degassato da un millilitro, sostituire il tubo da 15 millilitri usato con uno nuovo.Pipettare cento milioni di cellule in 500 microlitri di tampone alla volta consentendo alla sospensione cellulare di passare attraverso la colonna. Quindi sciacquare la colonna tre volte con tre millilitri di tampone fax degassato ogni volta. Dopo aver raccolto il flow-through, etichettare la prima frazione linfocitaria naïve eluita come frazione cellulare CD14 negativa.Rimuovere la colonna dal separatore e posizionare un nuovo tubo sterile da 15 millilitri sotto la colonna per la raccolta degli effluenti. Aggiungere cinque millilitri di buffer fax nella colonna e spingerlo immediatamente attraverso utilizzando lo stantuffo. Raccogliere ed etichettare il secondo flusso attraverso o la frazione monocitaria naïve come frazione cellulare CD14 positiva.Aggiungi terreno di coltura completo ai monociti CD14 positivi raccolti per ottenere 1 milione di cellule per millilitro. Quindi, aggiungere una sospensione cellulare da un millilitro a ciascun pozzetto di una piastra sterile a 24 pozzetti prima di integrare ciascun pozzetto con 40 microlitri del cocktail di citochine fornito nel kit. Il secondo giorno, trasferire metà del contenuto di ciascun pozzetto in singoli tubi da 1,5 millilitri utilizzando una pipetta.Dopo aver centrifugato i tubi da 1,5 millilitri a 500 g per sette minuti, scartare il surnatante e risospendere il pellet in 500 microlitri di terreno di coltura fresco completo. Trasferire 500 microlitri di questa sospensione cellulare risospesa ai pozzetti corrispondenti in modo che il volume finale nel pozzo diventi di un millilitro. Arricchire ogni pozzetto con 20 microlitri di cocktail di citochine.Per generare MoDC pulsate dall'antigene, aggiungere un microlitro per millilitro di vaccino contro il virus della rabbia o sospensione RV a un millilitro di coltura MoDC naïve nella piastra a 24 pozzetti e incubare la piastra per 48 ore al 5% di anidride carbonica e 37 gradi Celsius. Il settimo giorno, tenere la piastra a 24 pozzetti contenente i MoDC pulsati dall'antigene sul ghiaccio per 10 minuti prima di aggiungere un millilitro di PBS ghiacciato per pozzetto e mescolarlo accuratamente. Trasferire la sospensione su un tubo da 15 millilitri.Lavare i pozzetti con due millilitri di PBS ghiacciato. Raccogliere le cellule residue all'interno di ciascun pozzetto e trasferire il contenuto lavato nei rispettivi tubi. Centrifugare la sospensione cellulare a 500g per sette minuti.Dopo aver scartato il surnatante, risospendere il pellet cellulare MoDC pulsato dall'antigene in un terreno di coltura completo per regolare la concentrazione finale di 100.000 cellule per millilitro. Per la co-coltura di linfociti MoDC, seminare i pozzetti di una piastra sterile a 24 pozzetti con un millilitro di sospensione di cellule linfocitarie naïve e un millilitro di sospensione MoDC pulsata dall'antigene o non pulsata dall'antigene il settimo giorno dell'impulso dell'antigene. Dopo due giorni di incubazione, integrare ogni pozzetto con 20 nanogrammi per millilitro di interleuchina-2 ricombinante e continuare l'incubazione per altre 120 ore.Il giorno 14, trasferire un millilitro di co-coltura in un tubo sterile da 1,5 millilitri e centrifugare il tubo. Quindi risospendere il pellet cellulare con un millilitro di MoDC pulsate dall'antigene o non pulsate. Mescolare bene e trasferire le sospensioni cellulari nei pozzetti corrispondenti.Dopo la colorazione della superficie cellulare delle PBMC e dei linfociti e monociti naïve, trasferire un millilitro della sospensione cellulare in un tubo sterile da 1,5 millilitri usando una pipetta e centrifugare per 10 minuti a 500 g. Quindi risospendere il pellet in un millilitro di PBS e trasferirlo in un tubo da 15 millilitri. Raccogliere anche le celle residue e i tubi corrispondenti utilizzando un millilitro di PBS.Quindi aggiungere 10 millilitri di PBS al tubo da 15 millilitri contenente le celle e mescolare mediante pipettaggio. Dopo aver centrifugato il tubo per sette minuti a 850g, rimuovere il surnatante e risospendere con attenzione il pellet cellulare con sospensione residua rimasta dopo la decantazione del surnatante. Trasferire la sospensione della cella su una piastra a V da 96 pozzetti e sigillare i pozzetti per evitare fuoriuscite.Una volta completata la colorazione, eseguire l'analisi del citometro a flusso. Dall'anteprima in tempo reale, regolare la soglia di fluorescenza tra cui tensione e guadagno e dimensione della cella per disegnare eventualmente porte intorno alla popolazione cellulare desiderata escludendo eventuali detriti cellulari. La colorazione delle cellule CD14 e la citometria a flusso hanno mostrato che la frazione monocitaria naïve comprendeva il 98% di cellule monocitarie CD14 positive ed era funzionalmente in grado di assorbire l'antigene.Le MoDC naïve fenotipicamente caratterizzate dalla valutazione dell'espressione di MHC Classe 2 e dei marcatori di superficie delle cellule CD86 e CD40 co-stimolatorie hanno convalidato le cellule dendritiche o il fenotipo DC-like. Durante la co-coltura di linfociti MoDC il nono giorno, è stato osservato un cambiamento morfologico che mostra l'estensione dei dendriti nell'impulso RV ai MoDC. Rispetto alla coltura di linfociti MoDC non pulsata, un aumento significativo della proliferazione dei linfociti è stato dimostrato dalla sovraregolazione dei marcatori di attivazione Ki67 e CD25 sulle cellule T CD4 positive e CD8 positive al giorno 16 nella co-coltura di linfociti MoDC pulsati.Le cellule T CD8 positive delle co-colture mature di MoDC pulsate RV hanno mostrato una sovraregolazione di otto volte di Ki67 rispetto al gruppo non specifico. Le cellule CD4 positive nella stessa co-coltura hanno mostrato un aumento di sette volte di Ki67 rispetto ai controlli, dimostrando la capacità dei MoDC innescati da RV di presentare l'antigene RV ai linfociti naïve e attivarli in una condizione in vitro. La quantificazione qPCR delle co-colture ha mostrato un aumento di oltre il 30% nell'espressione di interferone gamma e di oltre il 5% nell'espressione di Ki67 in tutte le co-colture che hanno utilizzato GAPDH come calibratore.Una concentrazione significativamente più elevata di interferone gamma secreto è stata osservata nella co-coltura di linfociti MoDC pulsati RV rispetto al gruppo di trattamento non specifico. Eseguire la fase di stratificazione molto lentamente e con attenzione, assicurandosi che il sangue sia posto sopra il mezzo di isolamento dei linfociti. Prestare particolare attenzione a raccogliere tutte le PBMC senza raccogliere troppo materiale dagli altri livelli.Altri metodi come la citometria a flusso, l'ELISA e la PCR quantitativa, tra gli altri, possono essere applicati dopo questa procedura per valutare l'attivazione dei marcatori immunitari.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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