Name: determination of vaccine immunogenicity using bovine monocyte-derived dendritic cells
Uploaded: 2023-05-19T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells at JoVE.com

我々は、動物の健康状態の判定とBTVの提供を支援してくれたEveline Wodak博士とAngelika Loistch博士(AGES)、ウシの血液を提供してくれたBernhard Reinelt博士、リアルタイムPCR実験と言語編集に関する有益なアドバイスをしてくださったIAEAのBharani Settypalli博士とWilliam Dundon博士にそれぞれ感謝します。

採血は、オーストリア保健食品安全庁(AGES)の倫理ガイドラインに従い、受け入れられている動物福祉基準32に準拠して、認定獣医サービスによって行われます。この研究は、オーストリア農業省から倫理的承認を受けました。MoDCの生成とその後のアプリケーションの実験計画を 図1に示します。
1.ナイーブMoDCの生産
<...

この研究は、ウシMoDCを生成および表現型化するための標準化された in vitro 方法と、その後の市販ワクチン(RVなど)のワクチン免疫原性の測定におけるそれらの使用を示しています。ウシMoDCは、in vivo 動物試験に進む前に、牛の病気に対する潜在的なワクチン抗原をスクリーニングし、免疫応答に基づいてそれらの潜在的な臨床的影響を予測するためのツールとして使用できます?...

獣医用ワクチン接種は、世界の畜産部門に影響を与える病気に対する保護を与えることにより、食料安全保障と動物福祉の改善に貢献するため、畜産と健康の重要な側面を表しています1。可能なワクチン候補の免疫原性を評価するための効果的な in vitro 法は、ワクチンの開発と製造のプロセスを加速するのに役立ちます。したがって、 in vitro 研究に基づく革新的な方法論で免疫アッセイの分野を拡大することは、免疫化と病原体感染に関連する免疫プロセスの複雑さを明らかにするのに役立つため、必要です。現在、定期的なサンプリング(血液や脾臓など)を必要とする in vivo 動物免疫およびチャレンジ試験が、候補ワクチンおよびアジュバントの免疫原性を測定するために使用されています。これらのアッセイは高価で時間がかかり、ほとんどの場合、動物の安楽死は試験の終わりまでに行われるため、倫理的な意味があります。
in vivoアッセイの代替として、末梢血単核細胞(PBMC)を使用して、in vitro2でワクチン誘導免疫応答を評価しています。PBMCは、70%〜90%のリンパ球、10%〜20%の単球、および限られた数の樹状細胞(DC、1%〜2%)で構成される不均一な細胞集団です3。PBMCには、B細胞、単球、DCなどの抗原提示細胞(APC)があり、感染や組織損傷の兆候を探して生物を常にパトロールします。局所的に分泌されるケモカインは、細胞表面受容体に結合することにより、これらの部位へのAPCの動員および活性化を促進する。単球の場合、ケモカインはDCまたはマクロファージのいずれかに分化するように運命を指示します4。DCが病原体に遭遇して捕獲するとすぐに、それらは二次リンパ器官に移動し、そこで主要組織適合遺伝子複合体(MHC)クラスIまたはクラスII表面タンパク質を使用して処理された病原体ペプチド抗原をそれぞれCD8+ T細胞またはCD4+ T細胞に提示することができ、したがって免疫応答を引き起こす5,6。
さまざまな病原体に対する防御免疫応答を調整する上でDCが果たす重要な役割は、特に感染性病原体に対するワクチンやアジュバントを設計する際に、細胞内免疫メカニズムを理解するための興味深い研究ターゲットになります7。PBMCから得ることができるDCの割合はかなり小さい(1%〜2%)ので、代わりに単球がin vitroでDCを生成するために使用されてきました8。これらの単球由来DC(MoDC)は、当初、がん免疫療法における可能な治療戦略として開発されました9。最近では、MoDCがワクチン研究に使用されており10、11、12、古典的な単球がMoDC産生の主要なサブタイプ(89%)です13。インビトロでのMoDCの産生は、インターロイキン-4(IL-4)、腫瘍壊死因子α(TNF-α)、またはIL-13などの他のサイトカインと組み合わせて与えられた顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)の添加によって以前に達成されています14,15,16。
in vitro MoDCアッセイの成功は、抗原刺激成熟MoDCが検出された抗原のタイプに特異的な免疫応答の範囲とタイプを調節する能力に依存しています17。MoDCによって認識および提示される病原体の種類は、CD4+ Tヘルパー(Th)細胞のTh1、Th2、またはTh17エフェクター細胞への分化を決定し、病原体特異的分泌サイトカインプロファイルによって特徴付けられます。Th1応答は細胞内病原体に対して誘発され、食作用依存性保護を調節するインターフェロンガンマ(IFN-γ)および腫瘍壊死因子ベータ(TNF-β)の分泌をもたらす。Th2応答は寄生生物に対して誘発され、IL-4、IL-5、IL-10、およびIL-13分泌によって特徴付けられ、食作用に依存しない体液性保護を開始します。Th17は、IL-17、IL-17F、IL-6、IL-22、およびTNF-α 18,19,20,21の分泌によって媒介される細胞外細菌および真菌感染症に対する好中球依存性の保護を提供します。以前の研究に基づいて、すべての病原体が予想されるサイトカインプロファイルに含まれるわけではないことが指摘されています。例えば、皮膚MoDCは、リーシュマニア寄生感染に応答して、CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞からのIFN−γ分泌を刺激し、したがって保護的炎症誘発性Th1応答を誘導する22。
また、サルモネラ菌リポ多糖(LPS)をプライミングしたニワトリMoDCでは、Th1応答とTh2応答の両方を活性化することにより、ネズミチフス菌に対する可変応答を誘導できることも示されていますが、サルモネラガリナラムはTh2応答のみを誘導し、MoDCクリアランス23に対する後者のより高い耐性を説明できる可能性があります。ブルセラ・カニス(B. canis)に対するMoDCの活性化は、イヌとヒトの両方のMoDCでも報告されており、これは人獣共通感染症の感染メカニズムを表している可能性があります24。B. canisでプライミングされたヒトMoDCは、重篤な感染に対する耐性を与える強力なTh1応答を誘導しますが、イヌMoDCは、Th1応答の低下を伴う優性Th17応答を誘導し、その後、慢性感染症の確立につながります25。ウシMoDCは、前者10に応答してウイルス抗体複合体を形成するため、免疫グロブリンG(IgG)と結合した口蹄疫ウイルス(FMDV)に対する親和性が非結合FMDV単独と比較して増強された。まとめると、これらの研究は、病原体感染中の免疫応答の複雑さを分析するためにMoDCがどのように使用されているかを示しています。適応免疫応答は、リンパ球増殖に関連する特異的マーカーの定量化によって評価することができる。分裂細胞でのみ検出される細胞内タンパク質であるKi-67は、増殖研究の信頼できるマーカーと見なされており26、同様に、活性化の後期にT細胞の表面に発現するCD25はリンパ球の増殖に対応します27,28。
この研究は、牛MoDCのin vitro生成のための標準化された方法と、それに続くワクチンの免疫原性をテストするために使用されるin vitro免疫アッセイでのそれらの適用を示しています。市販の狂犬病ワクチン(RV)を使用して、このアッセイの有効性を検証しました。Tリンパ球の活性化と増殖は、フローサイトメトリー、リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)、および酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によって測定され、Ki-67やCD25などの確立された細胞活性化マーカーの分析とIFN-γ 28,29,30,31の分泌を通じて測定されました。MoDCアッセイ中に動物または人間の実験試験は行われません。

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	<tbody>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher</td>
			<td>A1049201</td>
			<td>Ammonium-Chloride-Potassium buffer for lysis of residual RBCs in harvested PBMC Fraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Heparin Tubes</td>
			<td>Becton, Dickinson (BD) and Company</td>
			<td>366480</td>
			<td>10 mL, additive sodium heparin 158 USP units, glass tube, 16 x 100 mm size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Dendritic Cell Growth Kit</td>
			<td>Bio-Rad, UK</td>
			<td>PBP015KZZ</td>
			<td>Cytokine cocktail composed of recombinant bovine IL-4 and GM-CSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine IFN-&#947; ELISA Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA5638KZZ</td>
			<td>Kit use for measuring IFN-&#947; expression in culture supernatant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA2678F</td>
			<td>Mouse anti-bovine CD14 monoclonal antibody, clone CC-G33, isotype IgG1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD25 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA2430PE</td>
			<td>Mouse anti bovine CD25 monoclonal antibody, clone IL-A11, isotype IgG1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA1653A647</td>
			<td>Mouse anti bovine CD4 monoclonal antibody, clone CC8, isotype IgG2a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD40 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA2431F</td>
			<td>Mouse anti-bovine CD40 monoclonal antibody, clone IL-A156, isotype IgG1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA837F</td>
			<td>Mouse anti bovine CD8 monoclonal antibody, clone CC63, isotype IgG2a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD86 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA2437PE</td>
			<td>Mouse anti-bovine CD86 monoclonal antibody, clone IL-A190, isotype IgG1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>-</td>
			<td>Thermal cycler PCR machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Centrifuge Tube</td>
			<td>Falcon Corning&#160;</td>
			<td>352096 &#38; 352070</td>
			<td>15 mL and 50 mL, high-clarity poypropylene conical bottom, graduated, sterial, seal screw cap, falcon tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix/Cytoperm Plus</td>
			<td>BD Bio Sciences</td>
			<td>555028</td>
			<td>Fixation/permeabilization kit with BD golgiPlug, use for flow cytometer cell staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1009832500</td>
			<td>Absolute for analysis EMSURE&#160;ACS,ISO, Reag. Ph Eur</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher</td>
			<td>10500064</td>
			<td>Qualified, heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll Plaque PLUS</td>
			<td>GE Health care Life Sciences, USA</td>
			<td>341691</td>
			<td>Lymphocyte-isolation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowClean Cleaning Agent</td>
			<td>Beckman Coulter, Life Sciences</td>
			<td>A64669</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>FlowJo, Becton, Dickinson (BD) and Company, LLC, USA</td>
			<td>-</td>
			<td>Flow cytometer Histogram software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowTubes/ FACS&#160; (Fluorescence-activated single-cell sorting) Tube</td>
			<td>Falcon Corning&#160;</td>
			<td>352235</td>
			<td>5 mL, sterial, round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap, use in flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresceinisothiocynat-Dextran</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>60842-46-8</td>
			<td>FITC-dextran MW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallios Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>-</td>
			<td>Flow cytometer machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard-Shell 96-Well PCR Plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSP9601</td>
			<td>96 well, low profile, thin wall, skirted, white/clear</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human CD14 MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi Bioteck, Germany</td>
			<td>130-050-201</td>
			<td>2 mL microbeads conjugated to monoclonal anti-human CD14 antibody isotype IgG2a, used for selection of bovine monocytes from PBMCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaluza</td>
			<td>Beckman Coulter, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>Flow cytometer multicolor data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Column</td>
			<td>Miltenyi Bioteck, Germany</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Magnetic activated cell sorting or immune magentic cell separation colum for separation of various CD14 cell population based on cell surface antigens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC Class II DQ DR Polymorphic Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA2228F</td>
			<td>Mouse anti-sheep MHC Class II DQ DR Polymorphic:FITC, clone 49.1, isotype IgG2a, cross reactive with bovine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>HS4325</td>
			<td>1.5 mL, conical bottom, graduated, sterial tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Power Point</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>-</td>
			<td>The graphical illustrations of experimental design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 Negative Control:FITC for CD14, CD40 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA928F</td>
			<td>Isotype control CD14 and CD40 monoclonal antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 Negative Control:PE for CD86 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA928PE</td>
			<td>Isotype control CD86 monoclonal antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 Negative Control:RPE for CD25 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA928PE</td>
			<td>Isotype control CD25 monoclonal antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG2a Negative Control:FITC for MHC Class II Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA929F</td>
			<td>Isotype control for MHC class II monoclonal antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nobivac Rabies</td>
			<td>MSD Animal Health, UK</td>
			<td>-</td>
			<td>1 &#181;L/mL of cell cultured inactivated vaccine containing &#62; 2 I.U./mL Rabies virus strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical seals</td>
			<td>Bi0-Rad</td>
			<td>TCS0803</td>
			<td>0.2 mL flat PCR tube 8-cap strips, optical, ultraclear, compatible for qPCR machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td>pH 7.4, 1x concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism - GraphPad 5 Software&#160;</td>
			<td>Dotmatics</td>
			<td>-</td>
			<td>Statistical software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Anti-human Ki-67 antibody</td>
			<td>Biolegend, USA</td>
			<td>350501</td>
			<td>Monoclonal antibody, cross reactive with cow, clone ki-67</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Mouse IgG1 k Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>400101</td>
			<td>Isotype control for Ki-67 monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>READIDROP Propidium Iodide</td>
			<td>BD Bio Sciences</td>
			<td>1351101</td>
			<td>Live/dead cell marker used for flow cytometry, amine reactive dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-2 Protein</td>
			<td>R&#38;D System, USA</td>
			<td>202-IL-010/CF</td>
			<td>Interleukin-2, 20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74106</td>
			<td>Kit use for extraction of total RNA; RLT buffer = lysis buffer; RW1 buffer = stringent guanidine-containing washing buffer; RDD buffer = DNase buffer; RPE buffer = mild wash buffer; RNaseOUT = RNase inhibitor.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td>Cell culture media with L-glutamine and sodium bicarbonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMART-servier medical art&#160;</td>
			<td>Les Laboratories Servier</td>
			<td>-</td>
			<td>Licensed under a creative commons attribution 3.0 unported license</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>172-5270</td>
			<td>2x qPCR mix conatins dNTPs, Ss07d fusion polymerase, MgCl2, SYBR Green I supermix = supermix, ROX normalization dyes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III First-Strand Synthesis System</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher</td>
			<td>18080051</td>
			<td>Kit for cDNA synthsis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Test plate 24</td>
			<td>TPP, Switzerland</td>
			<td>92024</td>
			<td>24 well plate, sterilized by radiation , growth enhanced treated, volume 3.18 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher</td>
			<td>15250061</td>
			<td>0.4%, 100 mL, dye to assess cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher</td>
			<td>10977023</td>
			<td>0.1 &#181;m membrane filtered distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15206067</td>
			<td>VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes have a green top and contain spray-dried lithium, sodium or ammonium heparin on the inner walls and are usedin clinical chemistry, immunology and serology. The anticoagulant heparin activates antithrombin, which blocks the clotting cascade and thus produces a whole blood/plasma sample.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W3500-1L</td>
			<td>Sterile-filtered, bioReagent suitable for cell culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of vaccine immunogenicity using bovine monocyte-derived dendritic cells

樹状細胞(DC)は、免疫系内で最も強力な抗原提示細胞(APC)です。彼らは病原体を探して生物をパトロールし、自然免疫応答と適応免疫応答をリンクすることにより、免疫系内で独自の役割を果たします。これらの細胞は、捕捉された抗原を貪食し、エフェクター免疫細胞に提示し、多様な免疫応答を引き起こす可能性があります。この論文は、ウシ末梢血単核球(PBMC)から分離されたウシ単球由来樹状細胞(MoDC)の in vitro 生成のための標準化された方法と、ワクチンの免疫原性の評価におけるそれらの応用を示しています。
PBMCからCD14+ 単球を単離するために磁気ベースのセルソーティングを使用し、インターロイキン(IL)-4および顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)を完全培養培地に補充して、CD14+ 単球をナイーブMoDCに分化させました。未成熟MoDCの生成は、主要組織適合遺伝子複合体II(MHC II)、CD86、およびCD40細胞表面マーカーの発現を検出することによって確認されました。市販の狂犬病ワクチンを使用して未熟MoDCをパルスし、その後、ナイーブリンパ球と共培養しました。
抗原パルスMoDCとリンパ球共培養のフローサイトメトリー解析により、Ki-67、CD25、CD4、およびCD8マーカーの発現によるTリンパ球増殖の刺激が明らかになりました。定量的PCRを用いた IFN-γ および Ki-67のmRNA発現の分析は、MoDCがこの in vitro 共培養系においてリンパ球の抗原特異的プライミングを誘導できることを示した。さらに、ELISAを用いて評価されたIFN-γ分泌は、狂犬病ワクチンパルスMoDCリンパ球共培養において、非抗原パルスMoDCリンパ球共培養よりも有意に高い力価(**p < 0.01)を示した。これらの結果は、ワクチンの免疫原性を測定するためのこのin vitro MoDCアッセイの有効性を示しており、このアッセイは、 in vivo 試験を進める前に牛の潜在的なワクチン候補を特定するため、および市販ワクチンのワクチン免疫原性評価に使用できます。

この方法論は、in vivo研究を実施する前に候補ワクチン抗原を評価するためのウシMoDCのin vitro生成について説明しています。図1は、ウシMoDC生成の実験スキームと、インビトロアッセイへのMoDCの適用を示しています。磁気ベースの細胞選別技術を使用すると、50 mLの牛の血液から以前に分離された採取されたPBMCから約2,600万個のCD14+筋細胞を収...

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Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells

この方法論では、ウシ単球由来樹状細胞(MoDC)の生成と、牛の潜在的な獣医用ワクチンの開発中の抗原候補の in vitro 評価へのそれらの応用について説明しています。

ウシ単球由来樹状細胞を用いたワクチン免疫原性の決定

Dendritic cells (DCs) are the most potent antigen-presenting cells (APCs) within the immune system. They patrol the organism looking for pathogens and ...

このプロトコルは、in vivo研究の前にワクチンの免疫原性を測定するためにウシ単球由来の樹状細胞を使用する機能的なin vitroアッセイを表しています。したがって、家畜ワクチン学における既存のギャップを埋める。樹状細胞の生成と応用です。最も強力な抗原提示細胞として、樹状細胞はワクチンの有効性を含む細胞内免疫メカニズムを理解するための重要な研究標的となっています。このアッセイは、ワクチン候補のスクリーニング、ワクチン製造の品質管理状態、抗原およびアジュバントの選択のためのツールとして実施できます。手順を実演するのは、動物生産および健康研究所の科学者であるリチャード・カンゲテです。子牛の頸静脈穿刺から得られた血液を反転させてヘパリン化真空と混合することから始めます。次に、20ミリリットルのヘパリン化血液を滅菌50ミリリットルのチューブに移し、10ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水またはPBSで希釈します。15ミリリットルのリンパ球分離培地を滅菌50ミリリットルのチューブにピペットで入れ、チューブを45度の位置に傾けます。25ミリリットルのピペットを使用してリンパ球分離の上に30ミリリットルの血液PBS培地を注意深く重ね、チューブをゆっくりと垂直位置に戻してから遠心分離します。次に、パスツールピペットを使用して末梢血単核細胞の薄い白い層またはPBMC層を収集し、それを新しい50ミリリットルのチューブに移します。収穫したPBMCを1回の洗浄で40ミリリットルのPBSで2回洗浄し、よく混ぜます。遠心分離後、ペレットを15ミリリットルの塩化アンモニウムカリウム緩衝液またはACK緩衝液に再懸濁する。室温で10〜15分間インキュベートした後、最大40ミリリットルのPBSを加え、最大の加速と減速でチューブを遠心分離します。ペレットを10ミリリットルの完全培養培地に再懸濁します。次に、1000万細胞あたり5マイクロリットルのCD14マイクロビーズバッファーを加え、ピペットを使用して十分に混合します。フローサイトメトリー分析では、10マイクロリットルのCD14フルオレセインイソチオシアネートまたはFITC染色抗体をPBMCに加え、摂氏4〜8度で15分間インキュベートしてから、フローサイトメトリーを進めます。染色されていないPBMCに1ミリリットルのファックスバッファーを加え、500g、摂氏4度で7分間遠心分離します。次に、ペレットを1億細胞あたり500マイクロリットルのファックスバッファーに再懸濁します。次に、免疫磁気細胞分離カラムを分離器に挿入し、フロースルーを回収するためのカラム出口の下に50ミリリットルの収集チューブを置きます。1ミリリットルの脱気ファックスバッファーでカラムを洗浄した後、使用済みの15ミリリットルのチューブを新しいものと交換します。一度に500マイクロリットルのバッファーに1億個の細胞をピペットで入れ、細胞懸濁液をカラムに通過させます。次に、毎回3ミリリットルの脱気ファックスバッファーでカラムを3回すすぎます。フロースルーを回収した後、最初に溶出したナイーブリンパ球画分をCD14陰性細胞画分として標識する。カラムをセパレーターから取り外し、廃液収集のためにカラムの下に新しい滅菌15ミリリットルチューブを置きます。5ミリリットルのファックスバッファをカラムに追加し、プランジャーを使用してすぐに押し込みます。2番目のフロースルー画分またはナイーブ単球画分を収集し、CD14陽性細胞画分としてラベル付けします。採取したCD14陽性単球に完全培養液を加えて、ミリリットルあたり100万細胞を達成します。次に、キットに付属のサイトカインカクテル40マイクロリットルを各ウェルに補給する前に、滅菌24ウェルプレートの各ウェルに1ミリリットルの細胞懸濁液を追加します。2日目に、ピペットを使用して各ウェルの内容物の半分を個々の1.5ミリリットルチューブに移します。1.5ミリリットルのチューブを500gで7分間遠心分離した後、上清を廃棄し、ペレットを500マイクロリットルの新鮮な完全培養培地に再懸濁します。この再懸濁した細胞懸濁液500マイクロリットルを対応するウェルに戻して、ウェル内の最終容量が1ミリリットルになるようにします。20マイクロリットルのサイトカインカクテルで各ウェルを強化します。抗原パルスMoDCを生成するには、狂犬病ウイルスワクチンまたはRV懸濁液1ミリリットルあたり1マイクロリットルを24ウェルプレートのナイーブMoDC培養液1ミリリットルに加え、プレートを5%二酸化炭素および摂氏37度で48時間インキュベートします。7日目に、抗原パルスMoDCを含む24ウェルプレートを氷上に10分間保持してから、ウェルあたり1ミリリットルの氷冷PBSを加えて完全に混合します。懸濁液を15ミリリットルのチューブに移します。2ミリリットルの氷冷PBSでウェルを洗います。各ウェル内の残留細胞を収集し、洗浄した内容物をそれぞれのチューブに移します。細胞懸濁液を500gで7分間遠心分離します。上清を廃棄した後、抗原パルスMoDCs細胞ペレットを完全培養培地に再懸濁し、ミリリットル当たり100, 000細胞に最終濃度を調整した。MoDCリンパ球共培養では、抗原パルスの7日目に、滅菌24ウェルプレートのウェルに1ミリリットルのナイーブリンパ球細胞懸濁液と1ミリリットルの抗原パルスまたは非抗原パルスMoDC懸濁液を播種します。2日間のインキュベーション後、各ウェルにミリリットル当たり20ナノグラムの組換えインターロイキン-2を補給し、さらに120時間インキュベーションを続ける。14日目に、1ミリリットルの共培養を滅菌1.5ミリリットルのチューブに移し、チューブを遠心分離します。次に、細胞ペレットを1ミリリットルの抗原パルスまたは非パルスMoDCで再懸濁します。よく混合し、細胞懸濁液を対応するウェルに移します。PBMCならびにナイーブリンパ球および単球の細胞表面染色後、1ミリリットルの細胞懸濁液をピペットおよび遠心分離機を用いて滅菌1.5ミリリットルチューブに500gで10分間移す。次に、ペレットを1ミリリットルのPBSに再懸濁し、15ミリリットルのチューブに移します。また、1ミリリットルのPBSを使用して残留細胞と対応するチューブを収集します。次に、細胞を含む15ミリリットルのチューブに10ミリリットルのPBSを加え、ピペッティングで混合します。チューブを850gで7分間遠心分離した後、上清を除去し、上清をデカントした後に残った懸濁液とともに細胞ペレットを注意深く再懸濁します。細胞懸濁液をV底の96ウェルプレートに移し、こぼれないようにウェルを密封します。染色が完了したら、フローサイトメーター分析を実行します。リアルタイムプレビューから、電圧、ゲイン、細胞サイズなどの蛍光の閾値を調整して、細胞の破片を排除しながら、目的の細胞集団の周囲にゲートを描画します。CD14細胞染色およびフローサイトメトリーは、ナイーブ単球画分が98%CD14陽性単球細胞を含み、機能的に抗原取り込み可能であることを示した。MHCクラス2および共刺激性CD86およびCD40細胞表面マーカーの発現を評価することによって特徴付けられるナイーブMoDCの表現型は、樹状細胞またはDC様表現型を検証した。9日目のMoDCリンパ球共培養中に、MoDCへのRVパルスに樹状突起の伸長を示す形態学的変化が観察された。非パルスMoDCリンパ球培養と比較して、パルスMoDCリンパ球共培養の16日目にCD4陽性およびCD8陽性T細胞上のKi67およびCD25活性化マーカーのアップレギュレーションによってリンパ球増殖の有意な増加が実証された。成熟RVパルスMoDC共培養からのCD8陽性T細胞は、非特異的群と比較してKi67の8倍のアップレギュレーションを示した。同じ共培養のCD4陽性細胞は、対照と比較してKi67の7倍の増加を示し、RVプライミングMoDCがRV抗原をナイーブリンパ球に提示し、in vitro条件でそれらを活性化する能力を示しました。共培養のqPCR定量は、GAPDHをキャリブレーターとして使用するすべての共培養において、インターフェロンガンマ発現の30%以上の増加およびKi67発現の5%以上の増加を示した。分泌されたインターフェロンガンマの有意な濃度は、非特異的治療群と比較してRVパルスMoDCリンパ球共培養において観察された。重ね合わせステップを非常にゆっくりと慎重に実行し、血液がリンパ球分離培地の上に置かれていることを確認します。他のレイヤーからあまり多くの材料を収集しないように、すべてのPBMCを収集するように特に注意してください。フローサイトメトリー、ELISA、定量PCRなどの他の方法は、この手順の後に免疫マーカーの活性化を評価するために適用できます。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

マウス肺樹状細胞の分離

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells

黒色腫と扁平上癌幹細胞を用いた新規樹状細胞ワクチンの生成

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H ...

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â² in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

ヒト単球由来樹状細胞におけるIL-1βを用いて活性化し、NLRP3ソーム活性の測定

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

マクロファージコロニー刺激因子分化したヒト単球由来マクロファージの文化

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

イメージングフローサイトメトリーによるヒト単球由来樹状細胞の特徴付け：二つの単球の分離プロトコルの比較

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

全血からのヒト単球由来樹状細胞の生成

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

超高感度単一分子の開発と検証配列人間のインターフェロン-α のデジタルの酵素免疫測定法

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

siRNA Electroporation to Modulate Autophagy in Herpes Simplex Virus Type 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells

単純ヘルペスウイルス1型にオートファジーを調節するsiRNAエレクトロポレーション 1-感染単球由来樹状細胞

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) induces autophagy in both, immature dendritic cells (iDCs) as well as mature dendritic cells (mDCs), whereas ...

In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

分化ヒト単球由来マクロファージにおける細胞外トラップ放出のIn Vitro刺激と可視化

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic ...

Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages

ヒト単球由来マクロファージにおける炎症性カスパーゼ誘導近接の可視化

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct ...