Name: determination of vaccine immunogenicity using bovine monocyte-derived dendritic cells
Uploaded: 2023-05-19T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells at JoVE.com

동물의 건강 상태를 확인하고 BTV를 제공하는 데 도움을 준 Eveline Wodak 박사와 Angelika Loistch 박사(AGES), 소의 혈액을 제공한 Bernhard Reinelt 박사, Real-Time PCR 실험 및 언어 편집에 대한 유용한 조언을 제공한 IAEA의 Bharani Settypalli 박사와 William Dundon 박사에게 각각 감사드립니다.

채혈은 오스트리아 보건식품안전청(AGES)의 윤리 가이드라인과 동물복지 기준32에 따라 공인된 수의사에 의해 수행됩니다. 이 연구는 오스트리아 농무부로부터 윤리적 승인을 받았습니다. MoDC 생성 및 후속 적용을 위한 실험 설계는 그림 1에 나와 있습니다.
1. 순진한 MoDC의 생산
참고: 전혈 샘플은 헤파린?...

이 연구는 소 MoDC를 생성 및 표현형화하기 위한 표준화된 시험관 내 방법과 상업용 백신(예: RV)의 백신 면역원성을 측정하는 데 사용하는 방법을 보여줍니다. 소 MoDC는 가축 질병에 대한 잠재적인 백신 항원을 스크리닝하고 생체 내 동물 시험을 진행하기 전에 면역 반응을 기반으로 잠재적인 임상 영향을 예측하기 위한 도구로 사용할 수 있습니다. 생성된 MoDC는 형태학적, 표현형적, ?...

수의학 예방 접종은 전 세계적으로 가축 부문에 영향을 미치는 질병에 대한 보호를 제공함으로써 식량 안보와 동물 복지 개선에 기여하기 때문에 축산 및 건강의 중요한 측면을 나타냅니다1. 가능한 백신 후보의 면역원성을 평가하는 효과적인 시험관 내 방법은 백신 개발 및 생산 과정을 가속화하는 데 도움이 될 것입니다. 따라서 시험관 내 연구를 기반으로 한 혁신적인 방법론으로 면역 분석 분야를 확장하는 것이 필요하며, 이는 예방 접종 및 병원체 감염과 관련된 면역 과정의 복잡성을 밝히는 데 도움이 될 것입니다. 현재, 주기적인 샘플링(예: 혈액 및 비장)이 필요한 생체 내 동물 면역화 및 챌린지 연구는 후보 백신 및 보조제의 면역원성을 측정하는 데 사용됩니다. 이러한 분석은 비용이 많이 들고 시간이 많이 걸리며 윤리적 의미가 있는데, 대부분의 경우 동물 안락사는 시험이 끝날 때까지 수행되기 때문입니다.
생체 내 분석의 대안으로 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 사용하여 시험관 내백신 유도 면역 반응을 평가했습니다 2. PBMC는 70%-90% 림프구, 10%-20% 단핵구 및 제한된 수의 수지상 세포(DC, 1%-2%)로 구성된 이질적인 세포 집단입니다3. PBMC에는 B 세포, 단핵구 및 DC와 같은 항원 제시 세포(APC)가 있어 감염이나 조직 손상의 징후를 찾기 위해 유기체를 지속적으로 순찰합니다. 국소 분비된 케모카인은 세포 표면 수용체에 결합하여 이러한 부위에 대한 APC의 모집 및 활성화를 촉진합니다. 단핵구의 경우, 케모카인은 DC 또는 대식세포로 분화하도록 운명을 지시한다4. DC는 병원체를 만나 포획하자마자 이차 림프 기관으로 이동하여 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 클래스 I 또는 클래스 II 표면 단백질을 사용하여 처리된 병원체 펩타이드 항원을 각각 CD8+ T 세포 또는 CD4+ T 세포에 제시하여 면역 반응을 유발할 수 있습니다 5,6.
다양한 병원체에 대한 보호 면역 반응을 조율하는 데 있어 DC가 수행하는 핵심 역할은 특히 감염원에 대한 백신 및 보조제를 설계할 때 세포 내 면역 메커니즘을 이해하기 위한 흥미로운 연구 대상이 됩니다7. PBMC로부터 얻을 수 있는 DC의 비율이 다소 작기 때문에(1%-2%), 대신 단핵구가 시험관 내에서 DC를 생성하는 데 사용되었습니다 8. 이러한 단핵구 유래 DC(MoDC)는 암 면역요법에서 가능한 치료 전략으로 처음 개발되었다9. 최근에는 MoDC가 백신 연구에 사용되었으며(10,11,12), 고전적 단핵구(monocyte)가 MoDC 생산의 주요 아형(89%)이다 13. 시험관 내에서 MoDC의 생산은 이전에 인터루킨-4(IL-4), 종양 괴사 인자 α(TNF-α) 또는 IL-13과 같은 다른 사이토카인과 함께 제공되는 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)의 첨가를 통해 달성되었습니다 14,15,16.
in vitro MoDC 분석의 성공 여부는 항원 자극 성숙 MoDC가 검출된 항원 유형에 특이적인 면역 반응의 범위와 유형을 조절하는 능력에 달려 있다17. MoDC에 의해 인식되고 제시되는 병원체의 유형은 CD4+ T 헬퍼(Th) 세포를 Th1, Th2 또는 Th17 이펙터 세포로 분화하는 것을 결정하며 병원체 특이적 분비 사이토카인 프로파일을 특징으로 합니다. Th1 반응은 세포 내 병원체에 대해 유도되어 식세포 의존성 보호를 조절하는 인터페론-감마(IFN-γ) 및 종양 괴사 인자 베타(TNF-β)의 분비를 초래합니다. Th2 반응은 기생 유기체에 대해 유발되며 IL-4, IL-5, IL-10 및 IL-13 분비를 특징으로 하며, 이는 식세포 독립적인 체액 보호를 시작합니다. Th17은 IL-17, IL-17F, IL-6, IL-22 및 TNF-α 18,19,20,21의 분비에 의해 매개되는 세포외 박테리아 및 진균 감염에 대한 호중구 의존성 보호를 제공한다. 이전 연구에 따르면 모든 병원체가 예상되는 사이토카인 프로필에 속하는 것은 아닙니다. 예를 들어, 리슈만편모충 기생충 감염에 대한 반응으로 피부 MoDC는 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포에서 IFN-γ 분비를 자극하여 보호 전염증 Th1 반응을 유도한다22.
또한 살모넬라 지질다당류(LPS)로 프라이밍된 닭 MoDC에서 Th1 및 Th2 반응을 모두 활성화하여 살모넬라 티피뮤리움에 대한 가변 반응을 유도할 수 있는 반면, 살모넬라 갈리나룸은 Th2 반응만 유도하여 MoDC 클리어런스23에 대한 후자의 더 높은 내성을 설명할 수 있습니다. 브루셀라 캐니스(Brucella canis, B. canis)에 대한 MoDC의 활성화는 개와 인간 MoDC 모두에서 보고되었으며, 이는 이것이 인수공통전염병 감염 메커니즘을 나타낼 수 있음을 의미한다24. B. canis로 프라이밍된 인간 MoDC는 중증 감염에 대한 내성을 부여하는 강력한 Th1 반응을 유도하는 반면, 개 MoDC는 감소된 Th1 반응으로 지배적인 Th17 반응을 유도하여 만성 감염을 확립합니다25. 소 MoDC는 비접합 FMDV 단독에 비해 면역글로불린 G(IgG)와 결합된 구제역 바이러스(FMDV)에 대해 향상된 친화력을 보여주며, 이는 MoDC가 전자에 반응하여 바이러스-항체 복합체를 형성하기 때문입니다10. 종합하면, 이러한 연구는 병원체 감염 중 면역 반응의 복잡성을 분석하기 위해 MoDC가 어떻게 사용되었는지 보여줍니다. 적응 면역 반응은 림프구 증식과 관련된 특정 마커의 정량화에 의해 평가될 수 있다. 분열하는 세포에서만 검출되는 세포내 단백질인 Ki-67은 증식 연구의 신뢰할 수 있는 마커로 간주되며26, 유사하게, 활성화의 후기 단계 동안 T 세포 표면에서 발현되는 CD25는 림프구 증식에 해당합니다27,28.
이 연구는 백신의 면역원성을 테스트하는 데 사용되는 체외 면역 분석에 적용한 후 소 MoDC의 시험관 내 생성을 위한 표준화된 방법을 보여줍니다. 이 분석의 효능을 검증하기 위해 상업적으로 이용 가능한 광견병 백신(RV)을 사용했습니다. T 림프구 활성화 및 증식은 Ki-67 및 CD25와 같은 잘 확립된 세포 활성화 마커의 분석과 IFN-γ 28,29,30,31의 분비를 통해 유세포 분석, 실시간 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR) 및 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)으로 측정되었습니다. MoDC 분석 중에는 동물 또는 인간 실험 시험이 수행되지 않습니다.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher</td>
			<td>A1049201</td>
			<td>Ammonium-Chloride-Potassium buffer for lysis of residual RBCs in harvested PBMC Fraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Heparin Tubes</td>
			<td>Becton, Dickinson (BD) and Company</td>
			<td>366480</td>
			<td>10 mL, additive sodium heparin 158 USP units, glass tube, 16 x 100 mm size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Dendritic Cell Growth Kit</td>
			<td>Bio-Rad, UK</td>
			<td>PBP015KZZ</td>
			<td>Cytokine cocktail composed of recombinant bovine IL-4 and GM-CSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine IFN-&#947; ELISA Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA5638KZZ</td>
			<td>Kit use for measuring IFN-&#947; expression in culture supernatant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA2678F</td>
			<td>Mouse anti-bovine CD14 monoclonal antibody, clone CC-G33, isotype IgG1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD25 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA2430PE</td>
			<td>Mouse anti bovine CD25 monoclonal antibody, clone IL-A11, isotype IgG1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA1653A647</td>
			<td>Mouse anti bovine CD4 monoclonal antibody, clone CC8, isotype IgG2a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD40 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA2431F</td>
			<td>Mouse anti-bovine CD40 monoclonal antibody, clone IL-A156, isotype IgG1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA837F</td>
			<td>Mouse anti bovine CD8 monoclonal antibody, clone CC63, isotype IgG2a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD86 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA2437PE</td>
			<td>Mouse anti-bovine CD86 monoclonal antibody, clone IL-A190, isotype IgG1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>-</td>
			<td>Thermal cycler PCR machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Centrifuge Tube</td>
			<td>Falcon Corning&#160;</td>
			<td>352096 &#38; 352070</td>
			<td>15 mL and 50 mL, high-clarity poypropylene conical bottom, graduated, sterial, seal screw cap, falcon tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix/Cytoperm Plus</td>
			<td>BD Bio Sciences</td>
			<td>555028</td>
			<td>Fixation/permeabilization kit with BD golgiPlug, use for flow cytometer cell staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1009832500</td>
			<td>Absolute for analysis EMSURE&#160;ACS,ISO, Reag. Ph Eur</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher</td>
			<td>10500064</td>
			<td>Qualified, heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll Plaque PLUS</td>
			<td>GE Health care Life Sciences, USA</td>
			<td>341691</td>
			<td>Lymphocyte-isolation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowClean Cleaning Agent</td>
			<td>Beckman Coulter, Life Sciences</td>
			<td>A64669</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>FlowJo, Becton, Dickinson (BD) and Company, LLC, USA</td>
			<td>-</td>
			<td>Flow cytometer Histogram software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowTubes/ FACS&#160; (Fluorescence-activated single-cell sorting) Tube</td>
			<td>Falcon Corning&#160;</td>
			<td>352235</td>
			<td>5 mL, sterial, round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap, use in flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresceinisothiocynat-Dextran</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>60842-46-8</td>
			<td>FITC-dextran MW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallios Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>-</td>
			<td>Flow cytometer machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard-Shell 96-Well PCR Plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSP9601</td>
			<td>96 well, low profile, thin wall, skirted, white/clear</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human CD14 MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi Bioteck, Germany</td>
			<td>130-050-201</td>
			<td>2 mL microbeads conjugated to monoclonal anti-human CD14 antibody isotype IgG2a, used for selection of bovine monocytes from PBMCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaluza</td>
			<td>Beckman Coulter, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>Flow cytometer multicolor data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Column</td>
			<td>Miltenyi Bioteck, Germany</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Magnetic activated cell sorting or immune magentic cell separation colum for separation of various CD14 cell population based on cell surface antigens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC Class II DQ DR Polymorphic Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA2228F</td>
			<td>Mouse anti-sheep MHC Class II DQ DR Polymorphic:FITC, clone 49.1, isotype IgG2a, cross reactive with bovine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>HS4325</td>
			<td>1.5 mL, conical bottom, graduated, sterial tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Power Point</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>-</td>
			<td>The graphical illustrations of experimental design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 Negative Control:FITC for CD14, CD40 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA928F</td>
			<td>Isotype control CD14 and CD40 monoclonal antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 Negative Control:PE for CD86 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA928PE</td>
			<td>Isotype control CD86 monoclonal antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 Negative Control:RPE for CD25 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA928PE</td>
			<td>Isotype control CD25 monoclonal antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG2a Negative Control:FITC for MHC Class II Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA929F</td>
			<td>Isotype control for MHC class II monoclonal antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nobivac Rabies</td>
			<td>MSD Animal Health, UK</td>
			<td>-</td>
			<td>1 &#181;L/mL of cell cultured inactivated vaccine containing &#62; 2 I.U./mL Rabies virus strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical seals</td>
			<td>Bi0-Rad</td>
			<td>TCS0803</td>
			<td>0.2 mL flat PCR tube 8-cap strips, optical, ultraclear, compatible for qPCR machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td>pH 7.4, 1x concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism - GraphPad 5 Software&#160;</td>
			<td>Dotmatics</td>
			<td>-</td>
			<td>Statistical software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Anti-human Ki-67 antibody</td>
			<td>Biolegend, USA</td>
			<td>350501</td>
			<td>Monoclonal antibody, cross reactive with cow, clone ki-67</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Mouse IgG1 k Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>400101</td>
			<td>Isotype control for Ki-67 monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>READIDROP Propidium Iodide</td>
			<td>BD Bio Sciences</td>
			<td>1351101</td>
			<td>Live/dead cell marker used for flow cytometry, amine reactive dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-2 Protein</td>
			<td>R&#38;D System, USA</td>
			<td>202-IL-010/CF</td>
			<td>Interleukin-2, 20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74106</td>
			<td>Kit use for extraction of total RNA; RLT buffer = lysis buffer; RW1 buffer = stringent guanidine-containing washing buffer; RDD buffer = DNase buffer; RPE buffer = mild wash buffer; RNaseOUT = RNase inhibitor.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td>Cell culture media with L-glutamine and sodium bicarbonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMART-servier medical art&#160;</td>
			<td>Les Laboratories Servier</td>
			<td>-</td>
			<td>Licensed under a creative commons attribution 3.0 unported license</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>172-5270</td>
			<td>2x qPCR mix conatins dNTPs, Ss07d fusion polymerase, MgCl2, SYBR Green I supermix = supermix, ROX normalization dyes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III First-Strand Synthesis System</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher</td>
			<td>18080051</td>
			<td>Kit for cDNA synthsis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Test plate 24</td>
			<td>TPP, Switzerland</td>
			<td>92024</td>
			<td>24 well plate, sterilized by radiation , growth enhanced treated, volume 3.18 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher</td>
			<td>15250061</td>
			<td>0.4%, 100 mL, dye to assess cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher</td>
			<td>10977023</td>
			<td>0.1 &#181;m membrane filtered distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15206067</td>
			<td>VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes have a green top and contain spray-dried lithium, sodium or ammonium heparin on the inner walls and are usedin clinical chemistry, immunology and serology. The anticoagulant heparin activates antithrombin, which blocks the clotting cascade and thus produces a whole blood/plasma sample.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W3500-1L</td>
			<td>Sterile-filtered, bioReagent suitable for cell culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of vaccine immunogenicity using bovine monocyte-derived dendritic cells

수지상 세포(DC)는 면역 체계 내에서 가장 강력한 항원 제시 세포(APC)입니다. 그들은 병원체를 찾기 위해 유기체를 순찰하고 선천성 면역 반응과 적응 면역 반응을 연결하여 면역 체계 내에서 독특한 역할을 합니다. 이 세포는 식세포화한 다음 포획된 항원을 이펙터 면역 세포에 제시하여 다양한 범위의 면역 반응을 유발할 수 있습니다. 이 논문은 소 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 분리된 소 단핵구 유래 수지상 세포(MoDC)의 시험관 내 생성을 위한 표준화된 방법과 백신 면역원성 평가에 대한 적용을 보여줍니다.
자기 기반 세포 분류를 사용하여 PBMC에서 CD14+ 단핵구를 분리하고, 완전한 배양 배지에 인터루킨(IL)-4를 보충하고 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)를 사용하여 CD14+ 단핵구가 나이브 MoDC로 분화되도록 유도했습니다. 미성숙 MoDC의 생성은 주요 조직적합성 복합체 II(MHC II), CD86 및 CD40 세포 표면 마커의 발현을 검출하여 확인되었습니다. 상업적으로 이용 가능한 광견병 백신을 사용하여 미성숙 MoDC를 펄싱했으며, 이후 나이브 림프구와 공동 배양되었습니다.
항원 펄스 MoDC와 림프구 공동 배양의 유세포 분석은 Ki-67, CD25, CD4 및 CD8 마커의 발현을 통한 T 림프구 증식의 자극을 밝혀냈습니다. 정량적 PCR을 사용하여 IFN-γ 및 Ki-67의 mRNA 발현을 분석한 결과, MoDC가 이 시험관 내 공동 배양 시스템에서 림프구의 항원 특이적 프라이밍을 유도할 수 있음을 보여주었습니다. 또한, ELISA를 사용하여 평가된 IFN-γ 분비는 비항원 펄스 MoDC-림프구 공동 배양보다 광견병 백신 펄스 MoDC-림프구 공동 배양에서 유의하게 더 높은 역가(**p < 0.01)를 보였다. 이러한 결과는 백신 면역원성을 측정하기 위한 이 시험관 내 MoDC 분석의 타당성을 보여주며, 이는 이 분석이 생체 내 시험을 진행하기 전에 소에 대한 잠재적인 백신 후보를 식별하는 데 사용될 수 있을 뿐만 아니라 상용 백신의 백신 면역원성 평가에서도 사용될 수 있음을 의미합니다.

이 방법론은 생체 내 연구를 수행하기 전에 후보 백신 항원을 평가하기 위한 소 MoDC의 시험관 내 생성을 설명합니다. 그림 1은 소 MoDC 생성의 실험 계획과 시험관 내 분석을 위한 MoDC의 적용을 보여줍니다. 자기 기반 세포 분류 기술을 사용하여 이전에 50mL의 소 혈액에서 분리된 수확된 PBMC에서 약 2,600만 개의 CD14+ 근세포를 수집할 수 있었습니다. CD...

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Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells

이 방법론은 소 단핵구 유래 수지상 세포(MoDC)의 생성과 소의 잠재적인 동물용 백신 개발 중 항원 후보의 시험관 내 평가를 위한 적용을 설명합니다.

소 단핵구 유래 수지상 세포를 이용한 백신 면역원성 측정

Dendritic cells (DCs) are the most potent antigen-presenting cells (APCs) within the immune system. They patrol the organism looking for pathogens and ...

이 프로토콜은 생체 내 연구 전에 백신 면역원성을 측정하기 위해 소 단핵구 유래 수지상 세포를 사용하는 기능적 시험관 내 분석을 나타냅니다. 따라서 가축 백신학의 기존 격차를 메우고 있습니다. 수지상 세포의 생성과 응용입니다.가장 강력한 항원 제시 세포인 수지상 세포는 백신 효능을 포함한 세포 내 면역 메커니즘을 이해하기 위한 핵심 연구 대상이 되었습니다. 이 분석은 백신 후보 스크리닝, 백신 생산을 위한 품질 관리 상태, 항원 및 보조제 선택을 위한 도구로 구현될 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 동물 생산 및 건강 실험실의 과학자 인 Richard Kangethe가 될 것입니다.송아지의 경정맥 천자에서 얻은 혈액을 헤파린 처리 된 진공 테이너와 혼합하여 시작하십시오. 그런 다음 20 밀리리터의 헤파린 화 된 혈액을 멸균 된 50 밀리리터 튜브에 옮기고 10 밀리리터의 인산염 완충 식염수 또는 PBS로 희석하십시오. 15 밀리리터의 림프구 분리 배지를 멸균된 50 밀리리터 튜브에 피펫팅하고, 튜브를 45도 위치로 기울인다.25밀리리터 피펫을 사용하여 림프구 분리 위에 30밀리리터의 혈액 PBS 배지를 조심스럽게 겹치고 튜브를 원심분리하기 전에 천천히 수직 위치로 되돌립니다. 그런 다음 파스퇴르 피펫을 사용하여 말초 혈액 단핵 세포 또는 PBMC 층의 얇은 흰색 층을 수집하고 새로운 50 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 세척 당 40 밀리리터의 PBS를 사용하여 수확 된 PBMC를 두 번 세척하고 완전히 혼합합니다.원심분리 후, 펠릿을 15 밀리리터의 염화 암모늄 칼륨 완충액 또는 ACK 완충액에 재현탁시킨다. 실온에서 10 내지 15 분 동안 배양 한 후, 최대 40 밀리리터의 PBS를 첨가하고 최대 가속 및 감속으로 튜브를 원심 분리한다. 펠릿을 10 밀리리터의 완전한 배양 배지에 재현탁시킨다.그런 다음 세포 1,000만 개당 5마이크로리터의 CD14 MicroBead 버퍼를 추가하고 피펫을 사용하여 완전히 혼합합니다. 유세포 분석을 위해 10마이크로리터의 CD14 플루오레세인 이소티오시아네이트 또는 FITC 염색 항체를 PBMC에 추가하고 유세포 분석을 진행하기 전에 섭씨 4도에서 8도에서 15분 동안 배양합니다. 염색되지 않은 PBMC에 1밀리리터의 팩스 버퍼를 추가하고 500g 및 섭씨 4도에서 7분 동안 원심분리합니다.그런 다음 펠릿을 1억 개의 세포당 500마이크로리터의 팩스 버퍼에 재현탁합니다. 다음으로, 면역자기 세포 분리 컬럼을 분리기에 삽입하고 플로우 스루를 수집하기 위한 컬럼 출구 아래에 50 밀리리터 수집 튜브를 배치합니다. 1밀리리터의 탈기된 팩스 버퍼로 컬럼을 세척한 후 사용한 15밀리리터 튜브를 새 것으로 교체합니다.한 번에 500 마이크로리터의 완충액에 1억 개의 세포를 피펫팅하여 세포 현탁액이 컬럼을 통과할 수 있도록 합니다. 그런 다음 매번 3밀리리터의 탈기된 팩스 버퍼로 컬럼을 세 번 헹굽니다. 플로우 스루를 수집한 후 첫 번째 용출된 나이브 림프구 분획을 CD14 음성 세포 분획으로 표시합니다.분리기에서 컬럼을 제거하고 폐수 수집을 위해 컬럼 아래에 새 멸균 15밀리리터 튜브를 놓습니다. 팩스 버퍼 5밀리리터를 컬럼에 넣고 플런저를 사용하여 즉시 밀어 넣습니다. 두 번째 통과 또는 나이브 단핵구 분획을 수집하고 CD14 양성 세포 분획으로 표시합니다.수확된 CD14 양성 단핵구에 완전한 배양 배지를 추가하여 밀리리터당 100만 개의 세포를 얻습니다. 다음으로, 키트에 제공된 40 마이크로리터의 사이토카인 칵테일로 각 웰을 보충하기 전에 멸균된 24-웰 플레이트의 각 웰에 1밀리리터의 세포 현탁액을 첨가한다. 둘째 날에는 피펫을 사용하여 각 웰 내용물의 절반을 개별 1.5 밀리리터 튜브로 옮깁니다.1.5 밀리리터 튜브를 500g에서 7분 동안 원심분리한 후, 상청액을 버리고 펠렛을 500 마이크로리터의 신선한 완전 배양 배지에 재현탁시킨다. 이 재현탁된 세포 현탁액 500 마이크로리터를 상응하는 웰로 다시 이송하여 웰 내의 최종 부피가 1밀리리터가 되도록 한다. 20 마이크로 리터의 사이토 카인 칵테일로 각 웰을 풍부하게하십시오.항원 펄스 MoDC를 생성하려면 24웰 플레이트에서 1밀리리터의 나이브 MoDC 배양에 1밀리리터당 1마이크로리터의 광견병 바이러스 백신 또는 RV 현탁액을 추가하고 플레이트를 5% 이산화탄소 및 섭씨 37도에서 48시간 동안 배양합니다. 7일째에 항원 펄스 MoDC가 들어 있는 24웰 플레이트를 10분 동안 얼음 위에 보관한 후 웰당 1밀리리터의 얼음처럼 차가운 PBS를 추가하고 완전히 혼합합니다. 서스펜션을 15 밀리리터 튜브로 옮깁니다.2 밀리리터의 얼음처럼 차가운 PBS로 우물을 씻으십시오. 각 웰 내의 잔류 세포를 수집하고 세척된 내용물을 각각의 튜브로 옮깁니다. 세포 현탁액을 500g에서 7분 동안 원심분리한다.상청액을 버린 후, 항원 펄스 MoDCs 세포 펠릿을 완전한 배양 배지에 재현탁하여 최종 농도를 밀리리터 당 100, 000 세포로 조정한다. MoDC-림프구 공동 배양의 경우, 항원 펄스의 7일째에 1밀리리터의 나이브 림프구 세포 현탁액과 1밀리리터의 항원 펄스 또는 비항원 펄스 MoDC 현탁액으로 멸균된 24웰 플레이트의 웰을 시딩합니다. 2 일간의 배양 후, 각 웰에 밀리리터 당 20 나노 그램의 재조합 인터루킨 -2를 보충하고 120 시간 동안 배양을 계속한다.14일째에, 공배양물 1밀리리터를 멸균된 1.5 밀리리터 튜브로 옮기고, 튜브를 원심분리한다. 그런 다음 1밀리리터의 항원 펄스 또는 비펄스 MoDC로 세포 펠릿을 재현탁합니다. 잘 섞고 세포 현탁액을 해당 웰로 옮깁니다.PBMCs 및 나이브 림프구 및 단핵구의 세포 표면 염색 후, 500g에서 10분 동안 피펫 및 원심분리기를 사용하여 1 밀리리터의 세포 현탁액을 멸균된 1.5 밀리리터 튜브로 옮긴다. 그런 다음 펠릿을 1 밀리리터의 PBS에 재현 탁하고 15 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 또한 1 밀리리터의 PBS를 사용하여 잔류 세포와 해당 튜브를 수집합니다.그런 다음 세포가 들어있는 15 밀리리터 튜브에 10 밀리리터의 PBS를 넣고 피펫 팅으로 혼합합니다. 튜브를 850g에서 7분 동안 원심분리한 후, 상층액을 제거하고 상층액을 디캔팅한 후 남은 잔류 현탁액으로 세포 펠릿을 조심스럽게 재현탁합니다. 세포 현탁액을 V-바닥 96웰 플레이트로 옮기고 유출을 방지하기 위해 웰을 밀봉합니다.염색이 완료되면 유세포 분석기 분석을 수행합니다. 실시간 미리보기에서 전압, 게인 및 세포 크기를 포함한 형광 임계값을 조정하여 최종적으로 세포 파편을 배제하면서 원하는 세포 집단 주위에 게이트를 그립니다. CD14 세포 염색 및 유세포 분석은 나이브 단핵구 분획이 98% CD14 양성 단핵구 세포로 구성되고 기능적으로 항원 흡수가 가능하다는 것을 보여주었습니다.MHC 클래스 2 및 공동 자극 CD86 및 CD40 세포 표면 마커의 발현을 평가하는 것을 특징으로 하는 나이브 MoDC는 수지상 세포 또는 DC 유사 표현형을 검증했습니다. 9일째 MoDC 림프구 공동 배양 동안, 수상돌기 확장을 나타내는 형태학적 변화가 MoDC에 대한 RV 펄스에서 관찰되었습니다. 비펄스 MoDC 림프구 배양과 비교하여, 펄스 MoDC 림프구 공동 배양에서 16일째에 CD4 양성 및 CD8 양성 T 세포에 대한 Ki67 및 CD25 활성화 마커의 상향 조절에 의해 림프구 증식의 상당한 증가가 입증되었습니다.성숙한 RV 펄스 MoDC 공동 배양의 CD8 양성 T 세포는 비특이적 그룹에 비해 Ki67의 8배 상향 조절을 나타냈습니다. 동일한 공동 배양에서 CD4 양성 세포는 대조군에 비해 Ki67이 7배 증가한 것으로 나타났으며, 이는 RV 프라이밍 MoDC가 RV 항원을 나이브 림프구에 제시하고 시험관 내 조건에서 활성화하는 능력을 입증했습니다. 공동 배양의 qPCR 정량화는 GAPDH를 교정기로 사용한 모든 공동 배양에서 인터페론 감마 발현의 30% 이상 증가와 Ki67 발현의 5% 이상의 증가를 보여주었습니다.비특이적 처리군에 비해 RV 펄싱된 MoDC 림프구 공동 배양에서 유의하게 더 높은 농도의 분비된 인터페론 감마가 관찰되었습니다. 레이어링 단계를 매우 천천히 그리고 조심스럽게 수행하여 혈액이 림프구 분리 배지 위에 놓이도록 합니다. 다른 레이어에서 너무 많은 재료를 수집하지 않고 모든 PBMC를 수집하도록 각별히 주의하십시오.유세포 분석, ELISA 및 정량적 PCR과 같은 다른 방법은이 절차 후에 적용하여 면역 마커의 활성화를 평가할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

마우스 폐에 돌기 세포의 분리

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

연구

면역학 및 감염병학

Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells

흑색종과 편평상피암 줄기세포를 이용한 새로운 수지상 세포 백신의 생성

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H ...

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â² in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

활성화 및 인간 단핵구 유래 수지상 세포에서 IL-1β를 사용하여 NLRP3 inflammasome을 활동의 측정

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

대 식세포 콜로니 자극 인자 차별화 된 인간 단핵구 유래 대 식세포의 문화

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

이미징 유동 세포 계측법에 의해 인간 단핵구 유래 수지상 세포의 특성 : 두 단핵구 격리 프로토콜 사이의 비교

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

전혈로부터 인간 단핵구 유래 수지상 세포의 생성

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

개발 및 검증 磁 단일 분자의 배열 디지털 효소 연결 된 Immunosorbent 분석 결과 인간 인터페론-α에 대 한

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

siRNA Electroporation to Modulate Autophagy in Herpes Simplex Virus Type 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells

siRNA 전기 포진 포진 심플렉스 바이러스 유형 1-감염 단핵구 파생 수지상 세포에서 자가 포식을 조절

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) induces autophagy in both, immature dendritic cells (iDCs) as well as mature dendritic cells (mDCs), whereas ...

In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

분화 한 인간 단핵구 유래 대식세포에서 세포 외 트랩 방출의 시험관 내 자극 및 시각화

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic ...

Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages

인간 단핵구 유래 대식세포에서 근접성을 유도한 염증성 카스파제의 시각화

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct ...