Name: determination of vaccine immunogenicity using bovine monocyte-derived dendritic cells
Uploaded: 2023-05-19T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells at JoVE.com

Vi takker Dr. Eveline Wodak og Dr. Angelika Loistch (AGES) for deres støtte til å bestemme helsestatusen til dyrene og for å gi BTV, Dr. Bernhard Reinelt for å gi storfeblod, og Dr. Bharani Settypalli og Dr. William Dundon fra IAEA for nyttige råd om henholdsvis sanntids PCR-eksperimenter og språkredigering.

Blodinnsamling utføres av en sertifisert veterinærtjeneste i samsvar med de etiske retningslinjene fra det østerrikske byrået for helse og mattrygghet (AGES) og i samsvar med de aksepterte dyrevelferdsstandardene32. Studien fikk etisk godkjenning fra det østerrikske landbruksdepartementet. Det eksperimentelle designet for MoDCs generasjon og dens påfølgende anvendelse er illustrert i figur 1.
1. Produksjon av naive MoDC-er</str...

Denne studien demonstrerer en standardisert in vitro-metode for generering og fenotyping av bovine MoDCs og deres påfølgende bruk ved måling av vaksineimmunogeniteten til en kommersiell vaksine (f.eks. RV). Bovine MoDCs kan brukes som et verktøy for screening potensielle vaksineantigener mot storfesykdommer og forutsi deres potensielle kliniske innvirkning basert på immunresponser før de fortsetter mot in vivo dyreforsøk. MoDC-ene som ble generert ble identifisert basert på deres morfologiske, f...

Veterinærvaksinering representerer en viktig del av dyrehold og helse, da det bidrar til å forbedre matsikkerhet og dyrevelferd ved å gi beskyttelse mot sykdommer som påvirker husdyrsektoren globalt1. En effektiv in vitro-metode for å vurdere immunogeniteten til mulige vaksinekandidater vil bidra til å akselerere prosessen med vaksineutvikling og produksjon. Det er derfor nødvendig å utvide feltet immunanalyser med innovative metoder basert på in vitro-studier , da dette vil bidra til å avdekke kompleksiteten i immunprosessene relatert til immunisering og patogeninfeksjon. For tiden brukes in vivo dyreimmuniserings- og utfordringsstudier, som krever periodisk prøvetaking (f.eks. blod og milt), til å måle immunogeniteten til kandidatvaksiner og adjuvanser. Disse analysene er dyre, tidkrevende og har etiske implikasjoner, fordi i de fleste tilfeller utføres dyreavlivning ved slutten av forsøkene.
Som et alternativ til in vivo-analyser har mononukleære celler i perifert blod (PBMC) blitt brukt til å evaluere vaksineinduserte immunresponser in vitro2. PBMC er en heterogen populasjon av celler sammensatt av 70%-90% lymfocytter, 10%-20% monocytter og et begrenset antall dendrittiske celler (DCs, 1%-2%)3. PBMCs har antigenpresenterende celler (APCs) som B-celler, monocytter og DCs, som kontinuerlig patruljerer organismen på jakt etter tegn på infeksjon eller vevskader. Lokalt utskilte kjemokiner letter rekruttering og aktivering av APCer til disse stedene ved å binde seg til reseptorer på celleoverflaten. Når det gjelder monocytter, styrer kjemokiner sin skjebne til enten å differensiere i DCs eller makrofager4. Så snart DCs møter og fanger et patogen, migrerer de til sekundære lymfoide organer, hvor de kan presentere de behandlede patogenpeptidantigenene ved å bruke store histokompatibilitetskompleks (MHC) klasse I eller klasse II overflateproteiner til henholdsvis CD8 + T-celler eller CD4 + T-celler, og dermed utløse en immunrespons 5,6.
DCs nøkkelrolle i å orkestrere en beskyttende immunrespons mot ulike patogener gjør dem til et interessant forskningsmål for å forstå intracellulære immunmekanismer, spesielt når man designer vaksiner og hjelpestoffer mot smittsomme stoffer7. Siden fraksjonen av DCs som kan oppnås fra PBMCs er ganske liten (1% -2%), har monocytter i stedet blitt brukt til å generere DCs in vitro8. Disse monocyttavledede DCene (MoDCs) ble opprinnelig utviklet som en mulig behandlingsstrategi i kreftimmunterapi9. Mer nylig har MoDCs blitt brukt til vaksineforskning 10,11,12, og klassiske monocytter er den dominerende subtypen (89%) for MoDC-produksjon 13. Produksjon av MoDCs in vitro har tidligere blitt oppnådd ved tillegg av granulocytt-makrofag kolonistimulerende faktor (GM-CSF) gitt i kombinasjon med andre cytokiner som interleukin-4 (IL-4), tumornekrosefaktor α (TNF-α) eller IL-1314,15,16.
Suksessen til en in vitro MoDC-analyse er avhengig av evnen til antigenstimulerte modne MoDCs til å modulere omfanget og typen av immunresponsen som er spesifikk for typen antigen som oppdages17. Typen av patogen anerkjent og presentert av MoDCs bestemmer differensieringen av CD4 + T-hjelperceller (Th) til enten Th1, Th2 eller Th17 effektorceller og er preget av en patogenspesifikk sekretorisk cytokinprofil. En Th1-respons fremkalles mot intracellulære patogener og resulterer i utskillelse av interferon-gamma (IFN-γ) og tumornekrosefaktor beta (TNF-β), som modulerer fagocytisk avhengig beskyttelse. En Th2-respons utløses mot parasittiske organismer og er preget av IL-4, IL-5, IL-10 og IL-13 sekresjon, som initierer fagocytisk-uavhengig humoral beskyttelse. Th17 gir nøytrofilavhengig beskyttelse mot ekstracellulære bakterielle og soppinfeksjoner mediert av sekresjon av IL-17, IL-17F, IL-6, IL-22 og TNF-α 18,19,20,21. Basert på tidligere studier har det blitt bemerket at ikke alle patogener faller innenfor den forventede cytokinprofilen. For eksempel stimulerer dermal MoDCs, som respons på Leishmania parasittisk infeksjon, IFN-γ sekresjon fra CD4 + T-celler og CD8 + T-celler, og induserer dermed en beskyttende proinflammatorisk Th1-respons22.
Det er også vist at i kylling-MoDCs primet med Salmonella lipopolysakkarid (LPS), kan indusere en variabel respons mot Salmonella typhimurium ved å aktivere både Th1- og Th2-responser, mens Salmonella gallinarum induserer en Th2-respons alene, noe som kan forklare den høyere motstanden til sistnevnte mot MoDC-clearance23. Aktivering av MoDCs mot Brucella canis (B. canis) har også blitt rapportert i både hund og humant MoDC, noe som betyr at dette kan representere en zoonotisk infeksjonsmekanisme24. Humane MoDCs primet med B. canis induserer en sterk Th1-respons som gir motstand mot alvorlig infeksjon, mens hundens MoDCs induserer en dominant Th17-respons med redusert Th1-respons, som senere fører til etablering av kronisk infeksjon25. Bovine MoDCs viser en forbedret affinitet for munn- og klovsykevirus (FMDV) konjugert med immunoglobulin G (IgG) sammenlignet med ikke-konjugert FMDV alene, da MoDCs danner et viralt antistoffkompleks som respons på de tidligere10. Samlet viser disse studiene hvordan MoDCs har blitt brukt til å analysere kompleksiteten av immunresponser under patogeninfeksjon. De adaptive immunresponsene kan evalueres ved kvantifisering av spesifikke markører assosiert med lymfocyttproliferasjon. Ki-67, et intracellulært protein som bare påvises i delende celler, regnes som en pålitelig markør for proliferasjonsstudier26, og tilsvarende tilsvarer CD25 uttrykt på overflaten av T-celler i sen aktiveringsfase lymfocyttproliferasjon27,28.
Denne studien demonstrerer en standardisert metode for in vitro-generering av MoDCs fra storfe, etterfulgt av deres anvendelse i en in vitro immunanalyse som brukes til å teste immunogeniteten til vaksiner. En kommersielt tilgjengelig rabiesvaksine (RV) ble brukt til å validere effekten av denne analysen. T-lymfocyttaktivering og proliferasjon ble målt ved flowcytometri, sanntids kvantitativ polymerasekjedereaksjon (qPCR) og enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA) gjennom analyse av veletablerte celleaktiveringsmarkører som Ki-67 og CD25 og sekresjonen av IFN-γ 28,29,30,31. Ingen dyre- eller menneskeeksperimentelle forsøk utføres under MoDC-analysen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher</td>
			<td>A1049201</td>
			<td>Ammonium-Chloride-Potassium buffer for lysis of residual RBCs in harvested PBMC Fraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Heparin Tubes</td>
			<td>Becton, Dickinson (BD) and Company</td>
			<td>366480</td>
			<td>10 mL, additive sodium heparin 158 USP units, glass tube, 16 x 100 mm size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Dendritic Cell Growth Kit</td>
			<td>Bio-Rad, UK</td>
			<td>PBP015KZZ</td>
			<td>Cytokine cocktail composed of recombinant bovine IL-4 and GM-CSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine IFN-&#947; ELISA Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA5638KZZ</td>
			<td>Kit use for measuring IFN-&#947; expression in culture supernatant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA2678F</td>
			<td>Mouse anti-bovine CD14 monoclonal antibody, clone CC-G33, isotype IgG1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD25 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA2430PE</td>
			<td>Mouse anti bovine CD25 monoclonal antibody, clone IL-A11, isotype IgG1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA1653A647</td>
			<td>Mouse anti bovine CD4 monoclonal antibody, clone CC8, isotype IgG2a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD40 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA2431F</td>
			<td>Mouse anti-bovine CD40 monoclonal antibody, clone IL-A156, isotype IgG1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA837F</td>
			<td>Mouse anti bovine CD8 monoclonal antibody, clone CC63, isotype IgG2a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD86 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA2437PE</td>
			<td>Mouse anti-bovine CD86 monoclonal antibody, clone IL-A190, isotype IgG1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>-</td>
			<td>Thermal cycler PCR machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Centrifuge Tube</td>
			<td>Falcon Corning&#160;</td>
			<td>352096 &#38; 352070</td>
			<td>15 mL and 50 mL, high-clarity poypropylene conical bottom, graduated, sterial, seal screw cap, falcon tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix/Cytoperm Plus</td>
			<td>BD Bio Sciences</td>
			<td>555028</td>
			<td>Fixation/permeabilization kit with BD golgiPlug, use for flow cytometer cell staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1009832500</td>
			<td>Absolute for analysis EMSURE&#160;ACS,ISO, Reag. Ph Eur</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher</td>
			<td>10500064</td>
			<td>Qualified, heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll Plaque PLUS</td>
			<td>GE Health care Life Sciences, USA</td>
			<td>341691</td>
			<td>Lymphocyte-isolation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowClean Cleaning Agent</td>
			<td>Beckman Coulter, Life Sciences</td>
			<td>A64669</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>FlowJo, Becton, Dickinson (BD) and Company, LLC, USA</td>
			<td>-</td>
			<td>Flow cytometer Histogram software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowTubes/ FACS&#160; (Fluorescence-activated single-cell sorting) Tube</td>
			<td>Falcon Corning&#160;</td>
			<td>352235</td>
			<td>5 mL, sterial, round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap, use in flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresceinisothiocynat-Dextran</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>60842-46-8</td>
			<td>FITC-dextran MW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallios Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>-</td>
			<td>Flow cytometer machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard-Shell 96-Well PCR Plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSP9601</td>
			<td>96 well, low profile, thin wall, skirted, white/clear</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human CD14 MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi Bioteck, Germany</td>
			<td>130-050-201</td>
			<td>2 mL microbeads conjugated to monoclonal anti-human CD14 antibody isotype IgG2a, used for selection of bovine monocytes from PBMCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaluza</td>
			<td>Beckman Coulter, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>Flow cytometer multicolor data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Column</td>
			<td>Miltenyi Bioteck, Germany</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Magnetic activated cell sorting or immune magentic cell separation colum for separation of various CD14 cell population based on cell surface antigens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC Class II DQ DR Polymorphic Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA2228F</td>
			<td>Mouse anti-sheep MHC Class II DQ DR Polymorphic:FITC, clone 49.1, isotype IgG2a, cross reactive with bovine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>HS4325</td>
			<td>1.5 mL, conical bottom, graduated, sterial tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Power Point</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>-</td>
			<td>The graphical illustrations of experimental design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 Negative Control:FITC for CD14, CD40 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA928F</td>
			<td>Isotype control CD14 and CD40 monoclonal antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 Negative Control:PE for CD86 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA928PE</td>
			<td>Isotype control CD86 monoclonal antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 Negative Control:RPE for CD25 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA928PE</td>
			<td>Isotype control CD25 monoclonal antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG2a Negative Control:FITC for MHC Class II Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA929F</td>
			<td>Isotype control for MHC class II monoclonal antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nobivac Rabies</td>
			<td>MSD Animal Health, UK</td>
			<td>-</td>
			<td>1 &#181;L/mL of cell cultured inactivated vaccine containing &#62; 2 I.U./mL Rabies virus strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical seals</td>
			<td>Bi0-Rad</td>
			<td>TCS0803</td>
			<td>0.2 mL flat PCR tube 8-cap strips, optical, ultraclear, compatible for qPCR machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td>pH 7.4, 1x concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism - GraphPad 5 Software&#160;</td>
			<td>Dotmatics</td>
			<td>-</td>
			<td>Statistical software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Anti-human Ki-67 antibody</td>
			<td>Biolegend, USA</td>
			<td>350501</td>
			<td>Monoclonal antibody, cross reactive with cow, clone ki-67</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Mouse IgG1 k Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>400101</td>
			<td>Isotype control for Ki-67 monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>READIDROP Propidium Iodide</td>
			<td>BD Bio Sciences</td>
			<td>1351101</td>
			<td>Live/dead cell marker used for flow cytometry, amine reactive dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-2 Protein</td>
			<td>R&#38;D System, USA</td>
			<td>202-IL-010/CF</td>
			<td>Interleukin-2, 20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74106</td>
			<td>Kit use for extraction of total RNA; RLT buffer = lysis buffer; RW1 buffer = stringent guanidine-containing washing buffer; RDD buffer = DNase buffer; RPE buffer = mild wash buffer; RNaseOUT = RNase inhibitor.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td>Cell culture media with L-glutamine and sodium bicarbonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMART-servier medical art&#160;</td>
			<td>Les Laboratories Servier</td>
			<td>-</td>
			<td>Licensed under a creative commons attribution 3.0 unported license</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>172-5270</td>
			<td>2x qPCR mix conatins dNTPs, Ss07d fusion polymerase, MgCl2, SYBR Green I supermix = supermix, ROX normalization dyes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III First-Strand Synthesis System</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher</td>
			<td>18080051</td>
			<td>Kit for cDNA synthsis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Test plate 24</td>
			<td>TPP, Switzerland</td>
			<td>92024</td>
			<td>24 well plate, sterilized by radiation , growth enhanced treated, volume 3.18 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher</td>
			<td>15250061</td>
			<td>0.4%, 100 mL, dye to assess cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher</td>
			<td>10977023</td>
			<td>0.1 &#181;m membrane filtered distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15206067</td>
			<td>VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes have a green top and contain spray-dried lithium, sodium or ammonium heparin on the inner walls and are usedin clinical chemistry, immunology and serology. The anticoagulant heparin activates antithrombin, which blocks the clotting cascade and thus produces a whole blood/plasma sample.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W3500-1L</td>
			<td>Sterile-filtered, bioReagent suitable for cell culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of vaccine immunogenicity using bovine monocyte-derived dendritic cells

Dendrittiske celler (DC) er de mest potente antigenpresenterende cellene (APCs) i immunsystemet. De patruljerer organismen på jakt etter patogener og spiller en unik rolle i immunsystemet ved å knytte de medfødte og adaptive immunresponsene. Disse cellene kan fagocytisere og deretter presentere fangede antigener til effektorimmunceller, noe som utløser et mangfoldig utvalg av immunresponser. Denne artikkelen demonstrerer en standardisert metode for in vitro-generering av bovine monocytt-avledede dendrittiske celler (MoDCs) isolert fra mononukleære celler fra perifert blod (PBMC) og deres anvendelse i evaluering av vaksineimmunogenisitet.
Magnetbasert cellesortering ble brukt for å isolere CD14+-monocytter fra PBMC, og tilskudd av komplett dyrkningsmedium med interleukin (IL)-4 og granulocytt-makrofag-kolonistimulerende faktor (GM-CSF) ble brukt for å indusere differensiering av CD14+-monocytter til naive MoDCer. Genereringen av umodne MoDC-er ble bekreftet ved å påvise ekspresjonen av store histokompatibilitetskompleks II (MHC II), CD86 og CD40 celleoverflatemarkører. En kommersielt tilgjengelig rabiesvaksine ble brukt til å pulsere de umodne MoDCene, som senere ble dyrket sammen med naive lymfocytter.
Flowcytometrianalysen av antigenpulserte MoDCs og lymfocytt-kokultur avslørte stimulering av T-lymfocyttproliferasjon gjennom ekspresjon av Ki-67-, CD25-, CD4- og CD8-markører. Analysen av mRNA-ekspresjonen av IFN-γ og Ki-67, ved bruk av kvantitativ PCR, viste at MoDCs kunne indusere antigenspesifikk priming av lymfocytter i dette in vitro co-kultursystemet. Videre viste IFN-γ sekresjon vurdert med ELISA en signifikant høyere titer (**p < 0,01) i kokulturen av rabiesvaksinepulserte MoDC-lymfocytter enn i ikke-antigenpulsert MoDC-lymfocytt-samkultur. Disse resultatene viser gyldigheten av denne in vitro MoDC-analysen for å måle vaksineimmunogenisitet, noe som betyr at denne analysen kan brukes til å identifisere potensielle vaksinekandidater for storfe før de fortsetter med in vivo-studier , samt i vaksineimmunogenisitetsvurderinger av kommersielle vaksiner.

Denne metoden beskriver in vitro-generering av MoDCs fra storfe for evaluering av kandidatvaksineantigener før utførelse i in vivo-studier. Figur 1 illustrerer det eksperimentelle skjemaet for MoDC-generering fra storfe og anvendelsen av MoDCs for in vitro-analysen. Ved hjelp av den magnetbaserte cellesorteringsteknikken var det mulig å samle ca. 26 millioner CD14+ myocytter fra de høstede PBMCene, som tidligere var isolert fra 50 ml storfeblod. Den ...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells at JoVE.com

Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells

Metodikken beskriver genereringen av bovine monocytt-avledede dendrittiske celler (MoDCs) og deres anvendelse for in vitro-evaluering av antigenkandidater under utvikling av potensielle veterinære vaksiner hos storfe.

Bestemmelse av vaksineimmunogenisitet ved bruk av dendrittiske celler fra bovint monocytt

Dendritic cells (DCs) are the most potent antigen-presenting cells (APCs) within the immune system. They patrol the organism looking for pathogens and ...

Denne protokollen representerer en funksjonell in vitro-analyse ved bruk av dendrittiske celler fra bovint monocytt for å måle immunogenisitet fra vaksiner før in vivo-studier. Derfor fyller et eksisterende gap i husdyrvaksinologi. Det er generering og anvendelse av dendritiske celler.Som de mest potente antigenpresenterende cellene har dendrittiske celler blitt et sentralt forskningsmål for å forstå intracellulære immunmekanismer, inkludert vaksineeffektivitet. Denne analysen kan implementeres som et verktøy for screening av vaksinekandidater, som kvalitetskontrolltilstand for vaksineproduksjon, og for antigen- og adjuvant seleksjon. Demonstrere prosedyren vil være Richard Kangethe, forsker i dyreproduksjon og helse laboratorium.Begynn med å invertere og blande blodet oppnådd fra kalvens jugularvenpunktering med hepariniserte vakutainer. Overfør deretter 20 ml heparinisert blod til et sterilt 50 milliliter rør og fortynn det med 10 ml fosfatbufret saltvann eller PBS. Pipett 15 ml lymfocyttisolasjonsmedium til et sterilt 50 milliliter rør og vipp røret til en 45 graders stilling.Legg forsiktig 30 ml blod PBS-medium på toppen av lymfocyttisolasjonen ved hjelp av en 25 milliliter pipette og sakte returner røret til vertikal stilling før du sentrifugerer det. Deretter samles det tynne hvite laget av mononukleære celler i perifert blod eller PBMC-lag ved hjelp av en Pasteur-pipette og overfører den til et nytt 50 milliliter rør. Vask de høstede PBMC-ene to ganger med 40 ml PBS per vask og bland det grundig.Etter sentrifugering, resuspender pelleten i 15 ml ammoniumkloridkaliumbuffer eller ACK-buffer. Etter 10 til 15 minutters inkubasjon ved romtemperatur, tilsett opptil 40 ml PBS og sentrifuge røret med maksimal akselerasjon og retardasjon. Suspender pelleten i 10 ml komplett kulturmedium.Deretter tilsettes fem mikroliter CD14 MicroBead-buffer per 10 millioner celler og blandes grundig med en pipette. For flowcytometrianalyse, tilsett 10 mikroliter CD14-fluoresceinisotiocyanat eller FITC-fargeantistoff til PBMC-ene og inkuber det i 15 minutter ved fire til åtte grader Celsius før du fortsetter med flowcytometrien. Til de ufargede PBMC-ene, tilsett en milliliter faksbuffer og sentrifuge den i syv minutter ved 500g og fire grader Celsius.Deretter resuspenderes pelleten i 500 mikroliter faksbuffer per 100 millioner celler. Sett deretter den immunomagnetiske celleseparasjonskolonnen inn i separatoren og plasser et 50 milliliter oppsamlingsrør under kolonneutløpet for å samle gjennomstrømningen. Etter vasking av kolonnen med en milliliter avgasset faksbuffer, bytt ut det brukte 15 milliliter røret med et nytt.Pipett hundre millioner celler i 500 mikroliter buffer om gangen, slik at cellesuspensjonen kan passere gjennom kolonnen. Skyll deretter kolonnen tre ganger med tre milliliter avgasset faksbuffer hver gang. Etter å ha samlet gjennomstrømningen, merk den første eluerte, naive lymfocyttfraksjonen som CD14 negativ cellefraksjon.Fjern kolonnen fra separatoren og plasser et nytt sterilt 15 milliliter rør under kolonnen for avløpsoppsamlingen. Legg til fem milliliter faksbuffer i kolonnen og skyv den umiddelbart gjennom med stempelet. Samle inn og merk den andre gjennomstrømningen eller den naive monocytfraksjonen som CD14-positiv cellefraksjon.Legg til komplett kulturmedium til de høstede CD14-positive monocytter for å oppnå 1 million celler per milliliter. Deretter legger du til en milliliter cellesuspensjon til hver brønn på en steril 24-brønnsplate før du supplerer hver brønn med 40 mikroliter av cytokincocktailen som følger med i settet. På dag to, overfør halvparten av brønnens innhold til individuelle 1,5 milliliter rør ved hjelp av en pipette.Etter sentrifugering av 1,5 milliliters rør ved 500g i syv minutter, kast supernatanten og resuspender pelleten i 500 mikroliter friskt komplett kulturmedium. Overfør 500 mikroliter av denne resuspenderte cellesuspensjonen tilbake til de tilsvarende brønnene slik at det endelige volumet i brønnen blir en milliliter. Berik hver brønn med 20 mikroliter cytokincocktail.For å generere antigenpulserende MoDCs, tilsett en mikroliter per milliliter rabiesvirusvaksine eller RV-suspensjon til en milliliter naiv MoDC-kultur i 24-brønnplaten og inkuber platen i 48 timer ved 5% karbondioksid og 37 grader Celsius. På dag syv, hold 24-brønnsplaten som inneholder antigenpulserende MoDCs på is i 10 minutter før du tilsetter en milliliter iskald PBS per brønn og blander den grundig. Overfør suspensjonen til et 15 milliliter rør.Vask brønnene med to milliliter iskald PBS. Samle restcellene i hver brønn og overfør det vaskede innholdet til deres respektive rør. Sentrifuger cellesuspensjonen ved 500g i syv minutter.Etter å ha kassert supernatanten, resuspender antigenpulserende MoDCs cellepellet i et komplett kulturmedium for å justere den endelige konsentrasjonen på 100 000 celler per milliliter. For MoDC-lymfocytt co-kultur, frø brønnene til en steril 24-brønns plate med en milliliter av den naive lymfocyttcellesuspensjonen og en milliliter antigenpulsert eller ikke-antigenpulsert MoDC-suspensjon på den syvende dagen av antigenpulsen. Etter to dager med inkubasjon, suppler hver brønn med 20 nanogram per milliliter rekombinant interleukin-2 og fortsett inkubasjonen i ytterligere 120 timer.På dag 14, overfør en milliliter av kokulturen til et sterilt 1,5 milliliter rør og sentrifuge røret. Resuspender deretter cellepelleten med en milliliter antigenpulserende eller ikke-pulserende MoDC. Bland godt og overfør cellesuspensjonene til deres tilsvarende brønner.Etter celleoverflatefarging av PBMC og naive lymfocytter og monocytter, overfør en milliliter av cellesuspensjonen til et sterilt 1,5 milliliter rør ved hjelp av en pipette og sentrifuge i 10 minutter ved 500g. Resuspender deretter pelleten i en milliliter PBS og overfør den til et 15 milliliter rør. Samle også restcellene og de tilsvarende rørene ved hjelp av en milliliter PBS.Deretter tilsettes 10 ml PBS til 15 milliliters røret som inneholder cellene og blandes ved pipettering. Etter sentrifugering av røret i syv minutter ved 850g, fjern supernatanten og resuspender cellepelleten forsiktig med gjenværende suspensjon igjen etter dekantering av supernatanten. Overfør cellesuspensjonen til en V-bunns 96-brønnplate og forsegle brønnene for å unngå søl.Når fargingen er fullført, utfør flowcytometeranalysen. Fra forhåndsvisningen i sanntid, juster terskelen for fluorescens inkludert spenning og forsterkning og cellestørrelse for til slutt å tegne porter rundt ønsket cellepopulasjon mens du ekskluderer cellulært rusk. CD14-cellefarging og flowcytometri viste at den naive monocyttfraksjonen besto av 98 %CD14 positive monocyttceller og var funksjonelt i stand til antigenopptak.De naive MoDCs fenotypisk karakterisert ved å vurdere ekspresjonen av MHC klasse 2 og co-stimulerende CD86 og CD40 celleoverflatemarkører validerte dendrittiske celler eller DC-lignende fenotype. Under kokultur av MoDC-lymfocytter dag ni ble det observert en morfologisk forandring som viste dendrittekstensjon i RV-pulsen til MoDC. Sammenlignet med ikke-pulsert MoDC-lymfocyttkultur ble det vist en signifikant økning i lymfocyttproliferasjon ved oppregulering av aktiveringsmarkørene Ki67 og CD25 på CD4-positive og CD8-positive T-celler dag 16 i pulserende MoDC-lymfocytt-samkultur.De CD8-positive T-cellene fra de modne RV-pulserte MoDC-kokulturene viste en åttedobling av Ki67 sammenlignet med den ikke-spesifikke gruppen. De CD4-positive cellene i samme samkultur viste en syvfoldig økning i Ki67 sammenlignet med kontroller, noe som demonstrerte evnen til RV-primede MoDCs til å presentere RV-antigenet til naive lymfocytter og aktivere dem i en in vitro-tilstand. qPCR-kvantifiseringen av kokulturer viste mer enn 30 % økning i interferon gamma-uttrykk og mer enn 5 % økning i Ki67-uttrykk i alle kokulturer som brukte GAPDH som kalibrator.En signifikant høyere konsentrasjon av utskilt interferongamma ble observert i RV-pulsert MoDC-lymfocytt-kokultur sammenlignet med den ikke-spesifikke behandlingsgruppen. Utfør lagdelingstrinnet veldig sakte og forsiktig, og sørg for at blod legges på toppen av lymfocyttisolasjonsmediet. Vær ekstra forsiktig med å samle alle PBMCer uten å samle for mye materiale fra de andre lagene.Andre metoder som flowcytometri, ELISA og kvantitativ PCR, blant andre, kan brukes etter denne prosedyren for å evaluere aktiveringen av immunmarkører.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Isolering av Mouse Lung dendrittiske celler

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells

Generering av en ny dendritisk cellevaksine ved hjelp av melanom og squamous kreft stamceller

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H ...

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â² in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Aktivisering og måling av NLRP3 Inflammasome aktivitet Bruke IL-1β i Human Monocyte-avledet dendrittiske celler

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Kultur av makrofag-kolonistimulerende faktor Differensiert Humant Monocyte makrofager

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

Karakterisering av menneske moncyttavledede dendrittiske celler ved Imaging flowcytometrisystemer: En sammenligning mellom to Monocyte Isolation protokoller

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Generering av menneske moncyttavledede dendrittiske celler fra Whole Blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

Utvikling og validering av en Ultrasensitive ett molekyl Array Digital enzym knyttet Immunosorbent analysen for menneskelig Interferon-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

siRNA Electroporation to Modulate Autophagy in Herpes Simplex Virus Type 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells

siRNA electroporation til modulere Autofagi i herpes simplex virus type 1-infiserte monocytt-avledet dendrittiske celler

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) induces autophagy in both, immature dendritic cells (iDCs) as well as mature dendritic cells (mDCs), whereas ...

In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

In vitro stimulering og visualisering av ekstracellulære Trap Release i differensiert Human monocytt-avledet makrofager

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic ...

Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages

Visualisering av inflammatoriske caspaser indusert nærhet i humane monocytt-avledede makrofager

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct ...