Name: determination of vaccine immunogenicity using bovine monocyte-derived dendritic cells
Uploaded: 2023-05-19T12:30:00
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Eveline Wodak y la Dra. Angelika Loistch (AGES) por su apoyo para determinar el estado de salud de los animales y por proporcionar BTV, al Dr. Bernhard Reinelt por proporcionar sangre bovina, y al Dr. Bharani Settypalli y al Dr. William Dundon del OIEA por su útil asesoramiento sobre los experimentos de PCR en tiempo real y la edición del idioma, respectivamente.

La extracción de sangre es realizada por un servicio veterinario certificado de acuerdo con las directrices éticas de la Agencia Austriaca de Salud y Seguridad Alimentaria (AGES) y de conformidad con las normas aceptadas de bienestar animal32. El estudio recibió la aprobación ética del Ministerio de Agricultura de Austria. El diseño experimental para la generación de MoDCs y su posterior aplicación se ilustra en la Figura 1.
1...

Este estudio demuestra un método in vitro estandarizado para generar y fenotipificar MoCD bovinos y su posterior uso en la medición de la inmunogenicidad de la vacuna de una vacuna comercial (por ejemplo, RV). Los MoDC bovinos se pueden utilizar como una herramienta para detectar posibles antígenos de vacunas contra enfermedades del ganado y predecir su posible impacto clínico en función de las respuestas inmunes antes de proceder a ensayos in vivo en animales. Los MoDCs generados fueron identifica...

La vacunación veterinaria representa un aspecto crucial de la cría y la salud de los animales, ya que contribuye a mejorar la seguridad alimentaria y el bienestar animal al conferir protección contra las enfermedades que afectan al sector ganadero a nivel mundial1. Un método in vitro eficaz para evaluar la inmunogenicidad de posibles vacunas candidatas ayudaría a acelerar el proceso de desarrollo y producción de vacunas. Por lo tanto, es necesario ampliar el campo de los ensayos inmunes con metodologías innovadoras basadas en estudios in vitro , ya que esto ayudaría a revelar la complejidad de los procesos inmunes relacionados con la inmunización y la infección por patógenos. Actualmente, la inmunización animal in vivo y los estudios de provocación, que requieren muestreos periódicos (por ejemplo, sangre y bazo), se utilizan para medir la inmunogenicidad de las vacunas candidatas y los adyuvantes. Estos ensayos son costosos, requieren mucho tiempo y tienen implicaciones éticas, porque en la mayoría de los casos, la eutanasia animal se lleva a cabo al final de los ensayos.
Como alternativa a los ensayos in vivo, se han utilizado células mononucleares de sangre periférica (PBMC) para evaluar las respuestas inmunitarias inducidas por la vacuna in vitro2. Las PBMC son una población heterogénea de células compuestas por 70%-90% de linfocitos, 10%-20% de monocitos y un número limitado de células dendríticas (DC, 1%-2%)3. Las PBMC albergan células presentadoras de antígeno (APC) como células B, monocitos y DC, que patrullan constantemente el organismo en busca de signos de infección o daño tisular. Las quimiocinas secretadas localmente facilitan el reclutamiento y la activación de APC en estos sitios al unirse a los receptores de la superficie celular. En el caso de los monocitos, las quimiocinas dirigen su destino para diferenciarse en CD o macrófagos4. Tan pronto como las CD encuentran y capturan un patógeno, migran a órganos linfoides secundarios, donde pueden presentar los antígenos peptídicos patógenos procesados utilizando proteínas de superficie de clase I o clase II del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) a las células T CD8+ o a las células T CD4+, respectivamente, desencadenando así una respuesta inmune 5,6.
El papel clave desempeñado por las CD en la orquestación de una respuesta inmune protectora contra diversos patógenos las convierte en un objetivo de investigación interesante para comprender los mecanismos inmunes intracelulares, especialmente cuando se diseñan vacunas y adyuvantes contra agentes infecciosos7. Dado que la fracción de CD que se puede obtener de PBMC es bastante pequeña (1% -2%), los monocitos se han utilizado para generar DC in vitro8. Estas CD derivadas de monocitos (MoDC) se desarrollaron inicialmente como una posible estrategia de tratamiento en la inmunoterapia contra el cáncer9. Más recientemente, los MoDC se han utilizado para la investigación de vacunas 10,11,12, y los monocitos clásicos son el subtipo predominante (89%) para la producción de MoDC 13. La producción de MoDCs in vitro se ha logrado previamente mediante la adición de factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) administrado en combinación con otras citocinas como la interleucina-4 (IL-4), el factor de necrosis tumoral α (TNF-α) o IL-1314,15,16.
El éxito de un ensayo in vitro de MoDC depende de la capacidad de los MoDC maduros estimulados por antígeno para modular el alcance y el tipo de respuesta inmune específica para el tipo de antígeno detectado17. El tipo de patógeno reconocido y presentado por los MoDC determina la diferenciación de las células CD4+ T auxiliares (Th) en células efectoras Th1, Th2 o Th17 y se caracteriza por un perfil de citoquinas secretoras específicas del patógeno. Se provoca una respuesta Th1 contra patógenos intracelulares y da como resultado la secreción de interferón-gamma (IFN-γ) y factor de necrosis tumoral beta (TNF-β), que modula la protección dependiente fagocítica. Una respuesta Th2 se desencadena contra organismos parásitos y se caracteriza por la secreción de IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13, que inicia la protección humoral independiente fagocítica. Th17 ofrece protección dependiente de neutrófilos contra infecciones bacterianas y fúngicas extracelulares mediadas por la secreción de IL-17, IL-17F, IL-6, IL-22 y TNF-α 18,19,20,21. Sobre la base de estudios previos, se ha observado que no todos los patógenos caen dentro del perfil de citoquinas esperado. Por ejemplo, las MoDC dérmicas, en respuesta a la infección parasitaria por Leishmania, estimulan la secreción de IFN-γ de las células T CD4+ y las células T CD8+, induciendo así una respuesta Th1 proinflamatoriaprotectora 22.
También se ha demostrado que, en pollos MoDCs preparados con lipopolisacárido de Salmonella (LPS), pueden inducir una respuesta variable contra Salmonella typhimurium activando las respuestas Th1 y Th2, mientras que Salmonella gallinarum induce una respuesta Th2 sola, lo que podría explicar la mayor resistencia de este último hacia el aclaramiento de MoDC23. La activación de MoDCs contra Brucella canis (B. canis) también ha sido reportada tanto en MoDCs caninos como humanos, lo que significa que esto podría representar un mecanismo de infección zoonótica24. Las MoDC humanas preparadas con B. canis inducen una fuerte respuesta Th1 que confiere resistencia a la infección grave, mientras que las MoDC caninas inducen una respuesta Th17 dominante con una respuesta Th1 reducida, lo que posteriormente conduce al establecimiento de una infección crónica25. Los MoCD bovinos muestran una mayor afinidad por el virus de la fiebre aftosa (FMDV) conjugado con inmunoglobulina G (IgG) en comparación con el FMDV no conjugado solo, ya que los MoDC forman un complejo de anticuerpos virales en respuesta a los10 primeros. Tomados en conjunto, estos estudios muestran cómo se han utilizado los MoDC para analizar la complejidad de las respuestas inmunes durante la infección por patógenos. Las respuestas inmunes adaptativas pueden evaluarse mediante la cuantificación de marcadores específicos asociados con la proliferación de linfocitos. Ki-67, una proteína intracelular detectada sólo en células en división, es considerada como un marcador confiable para estudios de proliferación26, y de manera similar, CD25 expresado en la superficie de las células T durante la fase tardía de activación corresponde a la proliferación de linfocitos27,28.
Este estudio demuestra un método estandarizado para la generación in vitro de MoCD de ganado vacuno seguido de su aplicación en un ensayo inmune in vitro utilizado para probar la inmunogenicidad de las vacunas. Se utilizó una vacuna antirrábica (VD) disponible comercialmente para validar la eficacia de este ensayo. La activación y proliferación de linfocitos T se midió mediante citometría de flujo, reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qPCR) y ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) mediante el análisis de marcadores de activación celular bien establecidos como Ki-67 y CD25 y la secreción de IFN-γ 28,29,30,31. No se realizan ensayos experimentales en animales o humanos durante el ensayo del MoDC.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher</td>
			<td>A1049201</td>
			<td>Ammonium-Chloride-Potassium buffer for lysis of residual RBCs in harvested PBMC Fraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Heparin Tubes</td>
			<td>Becton, Dickinson (BD) and Company</td>
			<td>366480</td>
			<td>10 mL, additive sodium heparin 158 USP units, glass tube, 16 x 100 mm size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Dendritic Cell Growth Kit</td>
			<td>Bio-Rad, UK</td>
			<td>PBP015KZZ</td>
			<td>Cytokine cocktail composed of recombinant bovine IL-4 and GM-CSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine IFN-&#947; ELISA Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA5638KZZ</td>
			<td>Kit use for measuring IFN-&#947; expression in culture supernatant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA2678F</td>
			<td>Mouse anti-bovine CD14 monoclonal antibody, clone CC-G33, isotype IgG1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD25 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA2430PE</td>
			<td>Mouse anti bovine CD25 monoclonal antibody, clone IL-A11, isotype IgG1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA1653A647</td>
			<td>Mouse anti bovine CD4 monoclonal antibody, clone CC8, isotype IgG2a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD40 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA2431F</td>
			<td>Mouse anti-bovine CD40 monoclonal antibody, clone IL-A156, isotype IgG1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA837F</td>
			<td>Mouse anti bovine CD8 monoclonal antibody, clone CC63, isotype IgG2a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD86 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA2437PE</td>
			<td>Mouse anti-bovine CD86 monoclonal antibody, clone IL-A190, isotype IgG1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>-</td>
			<td>Thermal cycler PCR machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Centrifuge Tube</td>
			<td>Falcon Corning&#160;</td>
			<td>352096 &#38; 352070</td>
			<td>15 mL and 50 mL, high-clarity poypropylene conical bottom, graduated, sterial, seal screw cap, falcon tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix/Cytoperm Plus</td>
			<td>BD Bio Sciences</td>
			<td>555028</td>
			<td>Fixation/permeabilization kit with BD golgiPlug, use for flow cytometer cell staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1009832500</td>
			<td>Absolute for analysis EMSURE&#160;ACS,ISO, Reag. Ph Eur</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher</td>
			<td>10500064</td>
			<td>Qualified, heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll Plaque PLUS</td>
			<td>GE Health care Life Sciences, USA</td>
			<td>341691</td>
			<td>Lymphocyte-isolation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowClean Cleaning Agent</td>
			<td>Beckman Coulter, Life Sciences</td>
			<td>A64669</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>FlowJo, Becton, Dickinson (BD) and Company, LLC, USA</td>
			<td>-</td>
			<td>Flow cytometer Histogram software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowTubes/ FACS&#160; (Fluorescence-activated single-cell sorting) Tube</td>
			<td>Falcon Corning&#160;</td>
			<td>352235</td>
			<td>5 mL, sterial, round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap, use in flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresceinisothiocynat-Dextran</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>60842-46-8</td>
			<td>FITC-dextran MW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallios Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>-</td>
			<td>Flow cytometer machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard-Shell 96-Well PCR Plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSP9601</td>
			<td>96 well, low profile, thin wall, skirted, white/clear</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human CD14 MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi Bioteck, Germany</td>
			<td>130-050-201</td>
			<td>2 mL microbeads conjugated to monoclonal anti-human CD14 antibody isotype IgG2a, used for selection of bovine monocytes from PBMCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaluza</td>
			<td>Beckman Coulter, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>Flow cytometer multicolor data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Column</td>
			<td>Miltenyi Bioteck, Germany</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Magnetic activated cell sorting or immune magentic cell separation colum for separation of various CD14 cell population based on cell surface antigens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC Class II DQ DR Polymorphic Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA2228F</td>
			<td>Mouse anti-sheep MHC Class II DQ DR Polymorphic:FITC, clone 49.1, isotype IgG2a, cross reactive with bovine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>HS4325</td>
			<td>1.5 mL, conical bottom, graduated, sterial tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Power Point</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>-</td>
			<td>The graphical illustrations of experimental design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 Negative Control:FITC for CD14, CD40 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA928F</td>
			<td>Isotype control CD14 and CD40 monoclonal antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 Negative Control:PE for CD86 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA928PE</td>
			<td>Isotype control CD86 monoclonal antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 Negative Control:RPE for CD25 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA928PE</td>
			<td>Isotype control CD25 monoclonal antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG2a Negative Control:FITC for MHC Class II Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA929F</td>
			<td>Isotype control for MHC class II monoclonal antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nobivac Rabies</td>
			<td>MSD Animal Health, UK</td>
			<td>-</td>
			<td>1 &#181;L/mL of cell cultured inactivated vaccine containing &#62; 2 I.U./mL Rabies virus strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical seals</td>
			<td>Bi0-Rad</td>
			<td>TCS0803</td>
			<td>0.2 mL flat PCR tube 8-cap strips, optical, ultraclear, compatible for qPCR machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td>pH 7.4, 1x concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism - GraphPad 5 Software&#160;</td>
			<td>Dotmatics</td>
			<td>-</td>
			<td>Statistical software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Anti-human Ki-67 antibody</td>
			<td>Biolegend, USA</td>
			<td>350501</td>
			<td>Monoclonal antibody, cross reactive with cow, clone ki-67</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Mouse IgG1 k Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>400101</td>
			<td>Isotype control for Ki-67 monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>READIDROP Propidium Iodide</td>
			<td>BD Bio Sciences</td>
			<td>1351101</td>
			<td>Live/dead cell marker used for flow cytometry, amine reactive dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-2 Protein</td>
			<td>R&#38;D System, USA</td>
			<td>202-IL-010/CF</td>
			<td>Interleukin-2, 20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74106</td>
			<td>Kit use for extraction of total RNA; RLT buffer = lysis buffer; RW1 buffer = stringent guanidine-containing washing buffer; RDD buffer = DNase buffer; RPE buffer = mild wash buffer; RNaseOUT = RNase inhibitor.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td>Cell culture media with L-glutamine and sodium bicarbonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMART-servier medical art&#160;</td>
			<td>Les Laboratories Servier</td>
			<td>-</td>
			<td>Licensed under a creative commons attribution 3.0 unported license</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>172-5270</td>
			<td>2x qPCR mix conatins dNTPs, Ss07d fusion polymerase, MgCl2, SYBR Green I supermix = supermix, ROX normalization dyes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III First-Strand Synthesis System</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher</td>
			<td>18080051</td>
			<td>Kit for cDNA synthsis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Test plate 24</td>
			<td>TPP, Switzerland</td>
			<td>92024</td>
			<td>24 well plate, sterilized by radiation , growth enhanced treated, volume 3.18 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher</td>
			<td>15250061</td>
			<td>0.4%, 100 mL, dye to assess cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher</td>
			<td>10977023</td>
			<td>0.1 &#181;m membrane filtered distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15206067</td>
			<td>VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes have a green top and contain spray-dried lithium, sodium or ammonium heparin on the inner walls and are usedin clinical chemistry, immunology and serology. The anticoagulant heparin activates antithrombin, which blocks the clotting cascade and thus produces a whole blood/plasma sample.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W3500-1L</td>
			<td>Sterile-filtered, bioReagent suitable for cell culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of vaccine immunogenicity using bovine monocyte-derived dendritic cells

Las células dendríticas (DC) son las células presentadoras de antígeno (APC) más potentes dentro del sistema inmunitario. Patrullan el organismo en busca de patógenos y desempeñan un papel único dentro del sistema inmune al vincular las respuestas inmunes innatas y adaptativas. Estas células pueden fagocitar y luego presentar antígenos capturados a las células inmunes efectoras, desencadenando una amplia gama de respuestas inmunes. Este documento demuestra un método estandarizado para la generación in vitro de células dendríticas derivadas de monocitos bovinos (MoDC) aisladas de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de ganado y su aplicación en la evaluación de la inmunogenicidad de la vacuna.
Se utilizó la clasificación celular magnética para aislar monocitos CD14+ de PBMC, y se utilizó la suplementación de medio de cultivo completo con interleucina (IL)-4 y factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) para inducir la diferenciación de monocitos CD14+ en MoDC naïve. La generación de MoDC inmaduros se confirmó mediante la detección de la expresión de marcadores de superficie celular del complejo mayor de histocompatibilidad II (MHC II), CD86 y CD40. Se utilizó una vacuna contra la rabia disponible comercialmente para pulsar los MoDC inmaduros, que posteriormente se cocultivaron con linfocitos naïve.
El análisis de citometría de flujo de las MoDC pulsadas por antígeno y el cocultivo de linfocitos reveló la estimulación de la proliferación de linfocitos T a través de la expresión de marcadores Ki-67, CD25, CD4 y CD8. El análisis de la expresión de ARNm de IFN-γ y Ki-67, utilizando PCR cuantitativa, mostró que los MoDCs podrían inducir el cebado específico de antígeno de linfocitos en este sistema de cocultivo in vitro . Además, la secreción de IFN-γ evaluada mediante ELISA mostró un título significativamente mayor (**p < 0,01) en el cocultivo de linfocitos MoDC pulsado por la vacuna antirrábica que en el cocultivo de linfocitos MoDC sin antígeno. Estos resultados muestran la validez de este ensayo in vitro MoDC para medir la inmunogenicidad de la vacuna, lo que significa que este ensayo se puede utilizar para identificar posibles candidatos a vacunas para el ganado antes de proceder con ensayos in vivo , así como en evaluaciones de inmunogenicidad de vacunas comerciales.

Esta metodología describe la generación in vitro de MoDCs de ganado para la evaluación de antígenos vacunales candidatos antes de realizar estudios in vivo. La Figura 1 ilustra el esquema experimental de generación de MoDC bovino y la aplicación de los MoDC para el ensayo in vitro. Utilizando la técnica de clasificación celular de base magnética, fue posible recolectar aproximadamente 26 millones de miocitos CD14 + de las PBMC recolectadas, que ...

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Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells

La metodología describe la generación de células dendríticas derivadas de monocitos bovinos (MoDC) y su aplicación para la evaluación in vitro de candidatos antigénicos durante el desarrollo de posibles vacunas veterinarias en bovinos.

Determinación de la inmunogenicidad de la vacuna utilizando células dendríticas derivadas de monocitos bovinos

Dendritic cells (DCs) are the most potent antigen-presenting cells (APCs) within the immune system. They patrol the organism looking for pathogens and ...

Este protocolo representa un ensayo funcional in vitro utilizando células dendríticas derivadas de monocitos bovinos para medir la inmunogenicidad de la vacuna antes de los estudios in vivo. Por lo tanto, llenar un vacío existente en la vacunología del ganado. Es la generación y aplicación de células dendríticas.Como las células presentadoras de antígeno más potentes, las células dendríticas se han convertido en un objetivo de investigación clave para comprender los mecanismos inmunes intracelulares, incluida la eficacia de la vacuna. Este ensayo se puede implementar como una herramienta para la detección de vacunas candidatas, como un estado de control de calidad para la producción de vacunas y para la selección de antígenos y adyuvantes. Demostrando el procedimiento estará Richard Kangethe, científico del laboratorio de producción y salud animal.Comience invirtiendo y mezclando la sangre obtenida de la punción de la vena yugular de la pantorrilla con vacutainers heparinizados. Luego transfiera 20 mililitros de sangre heparinizada a un tubo estéril de 50 mililitros y dilúyalo con 10 mililitros de solución salina tamponada con fosfato o PBS. Pipetear 15 mililitros de medio de aislamiento de linfocitos a un tubo estéril de 50 mililitros e inclinar el tubo a una posición de 45 grados.Coloque cuidadosamente 30 mililitros de medio PBS en sangre sobre el aislamiento de linfocitos con una pipeta de 25 mililitros y devuelva lentamente el tubo a una posición vertical antes de centrifugarlo. Luego recolecte la fina capa blanca de células mononucleares de sangre periférica o capa de PBMC usando una pipeta Pasteur y transfiérala a un nuevo tubo de 50 mililitros. Lave los PBMC cosechados dos veces usando 40 mililitros de PBS por lavado y mezcle bien.Después de la centrifugación, vuelva a suspender el pellet en 15 mililitros de tampón de potasio de cloruro de amonio o tampón ACK. Después de 10 a 15 minutos de incubación a temperatura ambiente, agregue hasta 40 mililitros de PBS y centrifugue el tubo con la máxima aceleración y desaceleración. Resuspender el pellet en 10 mililitros de medio de cultivo completo.Luego agregue cinco microlitros de tampón CD14 MicroBead por cada 10 millones de células y mezcle bien con una pipeta. Para el análisis de citometría de flujo, agregue 10 microlitros de isotiocianato de fluoresceína CD14 o anticuerpo de tinción FITC a las PBMC e incube durante 15 minutos a cuatro a ocho grados centígrados antes de proceder con la citometría de flujo. A los PBMC sin teñir, agregue un mililitro de tampón de fax y centrifugarlo durante siete minutos a 500 g y cuatro grados centígrados.Luego vuelva a suspender el pellet en 500 microlitros de tampón de fax por cada 100 millones de células. A continuación, inserte la columna de separación de células inmunomagnéticas en el separador y coloque un tubo de recolección de 50 mililitros debajo de la salida de la columna para recoger el flujo. Después de lavar la columna con un tampón de fax desgasificado de un mililitro, reemplace el tubo de 15 mililitros usado por uno nuevo.Pipetear cien millones de células en 500 microlitros de tampón a la vez permitiendo que la suspensión celular pase a través de la columna. Luego enjuague la columna tres veces con tres mililitros de tampón de fax desgasificado cada vez. Después de recolectar el flujo continuo, marque la primera fracción de linfocitos naïve eluyentes como la fracción de células CD14 negativas.Retire la columna del separador y coloque un nuevo tubo estéril de 15 mililitros debajo de la columna para la recolección de efluentes. Agregue cinco mililitros de búfer de fax en la columna e inmediatamente empújelo usando el émbolo. Recoja y etiquete el segundo flujo a través o la fracción de monocitos naïve como la fracción de células CD14 positivas.Agregue un medio de cultivo completo a los monocitos CD14 positivos cosechados para alcanzar 1 millón de células por mililitro. A continuación, agregue una suspensión de células de mililitros a cada pocillo de una placa estéril de 24 pocillos antes de complementar cada pocillo con 40 microlitros del cóctel de citoquinas proporcionado en el kit. En el segundo día, transfiera la mitad del contenido de cada pozo a tubos individuales de 1,5 mililitros con una pipeta.Después de centrifugar los tubos de 1,5 mililitros a 500 g durante siete minutos, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 500 microlitros de medio de cultivo completo fresco. Transfiera 500 microlitros de esta suspensión celular resuspendida a los pocillos correspondientes para que el volumen final en el pozo se convierta en un mililitro. Enriquece cada pozo con 20 microlitros de cóctel de citoquinas.Para generar MoDC pulsados por antígeno, agregue un microlitro por mililitro de vacuna contra el virus de la rabia o suspensión de RV a un mililitro de cultivo de MoDC ingenuo en la placa de 24 pocillos e incube la placa durante 48 horas al 5% de dióxido de carbono y 37 grados centígrados. En el séptimo día, mantenga la placa de 24 pocillos que contiene los MoDC pulsados por antígeno en hielo durante 10 minutos antes de agregar un mililitro de PBS helado por pocillo y mezclarlo bien. Transfiera la suspensión a un tubo de 15 mililitros.Lave los pozos con dos mililitros de PBS helado. Recoger las células residuales dentro de cada pocillo y transferir el contenido lavado a sus respectivos tubos. Centrifugar la suspensión celular a 500g durante siete minutos.Después de desechar el sobrenadante, resuspenda el pellet de células MoDCs pulsadas por antígeno en un medio de cultivo completo para ajustar la concentración final de 100, 000 células por mililitro. Para el cultivo conjunto de linfocitos MoDC, siembre los pocillos de una placa estéril de 24 pocillos con un mililitro de suspensión de células linfocitarias naïve y un mililitro de suspensión de MoDC pulsada por antígeno o no pulsada por antígeno en el séptimo día del pulso de antígeno. Después de dos días de incubación, complementar cada pocillo con 20 nanogramos por mililitro de interleucina-2 recombinante y continuar la incubación durante otras 120 horas.El día 14, transfiera un mililitro del cocultivo a un tubo estéril de 1,5 mililitros y centrifugar el tubo. Luego resuspenda el pellet celular con un mililitro de MoDC pulsados o no pulsados por antígeno. Mezclar bien y transferir las suspensiones celulares a sus pocillos correspondientes.Después de la tinción de la superficie celular de las PBMC y los linfocitos y monocitos naïve, transfiera un mililitro de la suspensión celular a un tubo estéril de 1,5 mililitros con una pipeta y una centrífuga durante 10 minutos a 500 g. Luego vuelva a suspender el pellet en un mililitro de PBS y transfiéralo a un tubo de 15 mililitros. También recoger las células residuales y los tubos correspondientes utilizando un mililitro de PBS.Luego agregue 10 mililitros de PBS al tubo de 15 mililitros que contiene las celdas y mezcle por pipeteo. Después de centrifugar el tubo durante siete minutos a 850 g, retire el sobrenadante y vuelva a suspender cuidadosamente el pellet celular con la suspensión residual que queda después de decantar el sobrenadante. Transfiera la suspensión celular a una placa de 96 pocillos con fondo en V y selle los pocillos para evitar derrames.Una vez que se complete la tinción, realice el análisis del citómetro de flujo. Desde la vista previa en tiempo real, ajuste el umbral de fluorescencia, incluido el voltaje y la ganancia y el tamaño de la celda, para eventualmente dibujar puertas alrededor de la población celular deseada mientras excluye cualquier residuo celular. La tinción de células CD14 y la citometría de flujo mostraron que la fracción de monocitos naïve comprendía 98% de células de monocitos CD14 positivas y era funcionalmente capaz de captación de antígenos.Los MoDC ingenuos caracterizados fenotípicamente por evaluar la expresión de MHC Clase 2 y marcadores de superficie celular CD86 y CD40 coestimuladores validaron las células dendríticas o el fenotipo tipo DC. Durante el cocultivo de linfocitos MoDC en el día nueve, se observó un cambio morfológico que muestra la extensión de la dendrita en el pulso del VD a los MoDC. En comparación con el cultivo de linfocitos MoDC no pulsados, se demostró un aumento significativo en la proliferación de linfocitos mediante la regulación positiva de los marcadores de activación Ki67 y CD25 en las células T CD4 positivas y CD8 positivas el día 16 en el cocultivo de linfocitos MoDC pulsados.Las células T CD8 positivas de los cocultivos maduros de MoDC pulsados de RV exhibieron una regulación positiva de Ki67 ocho veces en comparación con el grupo no específico. Las células CD4 positivas en el mismo cocultivo mostraron un aumento de siete veces en Ki67 en comparación con los controles, lo que demuestra la capacidad de los MoDC preparados para RV para presentar el antígeno RV a los linfocitos naïve y activarlos en una condición in vitro. La cuantificación de qPCR de cocultivos mostró un aumento de más del 30% en la expresión de interferón gamma y más del 5% de aumento en la expresión de Ki67 en todos los cocultivos utilizando GAPDH como calibrador.Se observó una concentración significativamente mayor de interferón gamma secretada en el cocultivo de linfocitos MoDC pulsados por RV en comparación con el grupo de tratamiento no específico. Realice el paso de estratificación muy lenta y cuidadosamente, asegurándose de que la sangre se coloque sobre el medio de aislamiento de linfocitos. Tenga mucho cuidado de recolectar todos los PBMC sin recolectar demasiado material de las otras capas.Otros métodos como la citometría de flujo, ELISA y PCR cuantitativa, entre otros, se pueden aplicar después de este procedimiento para evaluar la activación de marcadores inmunes.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Aislamiento de células dendríticas del pulmón de ratón

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Investigación

Inmunología e Infección

Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells

Generación de una nueva vacuna de células dendríticas usando melanoma y células madre escamosas del cáncer

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H ...

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â² in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Activación y Medición de NLRP3 inflamasoma Actividad Usando IL-1β en las células dendríticas derivadas de monocitos humanos

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

La cultura de los macrófagos derivados de monocitos-macrófagos factor estimulante de colonia humana diferenciada

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

Caracterización de las células dendríticas derivadas de monocitos humanos mediante imágenes de Citometría de Flujo: una comparación entre dos protocolos de aislamiento de monocitos

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Generación de células dendríticas derivadas de monocitos humanos de sangre entera

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

Desarrollo y validación de una sola molécula ultrasensible matriz Digital análisis de enzima-ligado del inmunosorbente para interferón-α humano

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

siRNA Electroporation to Modulate Autophagy in Herpes Simplex Virus Type 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells

electroporación de siRNA para modular la autofagia en el virus del herpes simple tipo 1-Células dendríticas derivadas de monocitos infectados

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) induces autophagy in both, immature dendritic cells (iDCs) as well as mature dendritic cells (mDCs), whereas ...

In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Estimulación in Vitro y visualización de la liberación de trampas extracelulares en macrófagos derivados de monocitos humanos diferenciados

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic ...

Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages

Visualización de la proximidad inducida por caspasas inflamatorias en macrófagos derivados de monocitos humanos

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct ...