Name: determination of vaccine immunogenicity using bovine monocyte-derived dendritic cells
Uploaded: 2023-05-19T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells at JoVE.com

Vi tackar Dr. Eveline Wodak och Dr. Angelika Loistch (AGES) för deras stöd för att bestämma djurens hälsotillstånd och för att tillhandahålla BTV, Dr. Bernhard Reinelt för att tillhandahålla bovint blod och Dr. Bharani Settypalli och Dr. William Dundon från IAEA för användbara råd om PCR-experiment i realtid respektive språkredigering.

Blodinsamling utförs av en certifierad veterinärtjänst i enlighet med de etiska riktlinjerna från den österrikiska myndigheten för hälsa och livsmedelssäkerhet (AGES) och i enlighet med de godkända djurskyddsnormerna32. Studien fick etiskt godkännande från det österrikiska jordbruksministeriet. Den experimentella designen för MoDCs generering och dess efterföljande tillämpning illustreras i figur 1.
1. Produktion av nai...

Denna studie visar en standardiserad in vitro-metod för att generera och fenotypa bovina MoDCs och deras efterföljande användning vid mätning av vaccinimmunogeniciteten hos ett kommersiellt vaccin (t.ex. RV). Bovina MoDCs kan användas som ett verktyg för screening av potentiella vaccinantigener mot nötkreatursjukdomar och förutsäga deras potentiella kliniska inverkan baserat på immunsvar innan man går vidare mot in vivo-djurförsök . De genererade MoDC identifierades baserat på deras morfol...

Veterinärvaccinering är en viktig aspekt av djurhållning och hälsa, eftersom den bidrar till att förbättra livsmedelstryggheten och djurskyddet genom att ge skydd mot sjukdomar som påverkar djurhållningssektorn globalt1. En effektiv in vitro-metod för att bedöma immunogeniciteten hos möjliga vaccinkandidater skulle bidra till att påskynda processen för utveckling och produktion av vaccin. Det är därför nödvändigt att utöka området immunanalyser med innovativa metoder baserade på in vitro-studier , eftersom detta skulle bidra till att avslöja komplexiteten i immunprocesserna relaterade till immunisering och patogeninfektion. För närvarande används in vivo-immuniserings - och provokationsstudier på djur, som kräver periodisk provtagning (t.ex. blod och mjälte), för att mäta immunogeniciteten hos kandidatvacciner och adjuvanser. Dessa analyser är dyra, tidskrävande och har etiska konsekvenser, eftersom i de flesta fall utförs avlivning av djur i slutet av försöken.
Som ett alternativ till in vivo-analyser har mononukleära celler i perifert blod (PBMC) använts för att utvärdera vaccininducerade immunsvar in vitro2. PBMC är en heterogen population av celler som består av 70% -90% lymfocyter, 10% -20% monocyter och ett begränsat antal dendritiska celler (DCs, 1% -2%)3. PBMCs har antigenpresenterande celler (APC) såsom B-celler, monocyter och DC, som ständigt patrullerar organismen som söker efter tecken på infektion eller vävnadsskada. Lokalt utsöndrade kemokiner underlättar rekrytering och aktivering av APC till dessa platser genom att binda till cellytereceptorer. När det gäller monocyter styr kemokiner sitt öde att antingen differentiera till DC eller makrofager4. Så snart DCs stöter på och fångar en patogen migrerar de till sekundära lymfoida organ, där de kan presentera de bearbetade patogenpeptidantigenerna med användning av MHC (Major Histocompatibility Complex) klass I eller klass II ytproteiner till CD8 + T-celler respektive CD4 + T-celler, vilket utlöser ett immunsvar 5,6.
Den nyckelroll som DCs spelar för att orkestrera ett skyddande immunsvar mot olika patogener gör dem till ett intressant forskningsmål för att förstå intracellulära immunmekanismer, särskilt vid utformning av vacciner och adjuvans mot smittämnen7. Eftersom andelen DCs som kan erhållas från PBMCs är ganska liten (1% -2%), har monocyter istället använts för att generera DCs in vitro 8. Dessa monocyt-härledda DCs (MoDCs) utvecklades initialt som en möjlig behandlingsstrategi vid cancerimmunterapi9. På senare tid har MoDC använts för vaccinforskning 10,11,12, och klassiska monocyter är den dominerande subtypen (89%) för MoDC-produktion 13. Produktionen av MoDCs in vitro har tidigare uppnåtts genom tillägg av granulocyt-makrofagkolonistimulerande faktor (GM-CSF) som ges i kombination med andra cytokiner såsom interleukin-4 (IL-4), tumörnekrosfaktor α (TNF-α) eller IL-1314,15,16.
Framgången för en in vitro MoDC-analys beror på förmågan hos antigenstimulerade mogna MoDCs att modulera omfattningen och typen av immunsvaret specifikt för den typ av antigen som detekteras17. Den typ av patogen som känns igen och presenteras av MoDCs bestämmer differentieringen av CD4 + T-hjälparceller (Th) i antingen Th1-, Th2- eller Th17-effektorceller och kännetecknas av en patogenspecifik sekretorisk cytokinprofil. Ett Th1-svar framkallas mot intracellulära patogener och resulterar i utsöndring av interferon-gamma (IFN-γ) och tumörnekrosfaktor beta (TNF-β), vilket modulerar fagocytberoende skydd. Ett Th2-svar utlöses mot parasitiska organismer och kännetecknas av IL-4, IL-5, IL-10 och IL-13-utsöndring, vilket initierar fagocytoberoende humoralt skydd. Th17 erbjuder neutrofilberoende skydd mot extracellulära bakterie- och svampinfektioner medierade av utsöndringen av IL-17, IL-17F, IL-6, IL-22 och TNF-α 18,19,20,21. Baserat på tidigare studier har det noterats att inte alla patogener faller inom den förväntade cytokinprofilen. Till exempel stimulerar dermala MoDCs, som svar på Leishmania parasitisk infektion, IFN-γ-utsöndring från CD4 + T-celler och CD8 + T-celler, vilket inducerar ett skyddande proinflammatoriskt Th1-svar22.
Det har också visats att i kyckling MoDCs primad med Salmonellalipopolysackarid (LPS), kan inducera ett variabelt svar mot Salmonella typhimurium genom att aktivera både Th1- och Th2-svar, medan Salmonella gallinarum inducerar ett Th2-svar ensamt, vilket kan förklara den högre resistensen hos den senare mot MoDC-clearance23. Aktivering av MoDCs mot Brucella canis (B. canis) har också rapporterats i både hund och humana MoDCs, vilket innebär att detta kan representera en zoonotisk infektionsmekanism24. Humana MoDCs grundade med B. canis inducerar ett starkt Th1-svar som ger resistens mot allvarlig infektion, medan hundens MoDCs inducerar ett dominerande Th17-svar med ett reducerat Th1-svar, vilket leder till etablering av kronisk infektion25. Bovint MoDC uppvisar en ökad affinitet för mul- och klövsjukevirus (FMDV) konjugerat med immunglobulin G (IgG) jämfört med icke-konjugerat FMDV ensamt, eftersom MoDC bildar ett virus-antikroppskomplex som svar på de tidigare10. Sammantaget visar dessa studier hur MoDCs har använts för att analysera komplexiteten hos immunsvar under patogeninfektion. Det adaptiva immunsvaret kan utvärderas genom kvantifiering av specifika markörer associerade med lymfocytproliferation. Ki-67, ett intracellulärt protein som endast detekteras i delande celler, betraktas som en tillförlitlig markör för proliferationsstudier26, och på samma sätt motsvarar CD25 uttryckt på ytan av T-celler under den sena aktiveringsfasen lymfocytproliferation27,28.
Denna studie visar en standardiserad metod för in vitro-generering av MoDCs hos nötkreatur följt av deras tillämpning i en in vitro-immunanalys som används för att testa immunogeniciteten hos vacciner. Ett kommersiellt tillgängligt rabiesvaccin (RV) användes för att validera effekten av denna analys. T-lymfocytaktivering och proliferation mättes med flödescytometri, kvantitativ polymeraskedjereaktion i realtid (qPCR) och enzymkopplad immunosorbentanalys (ELISA) genom analys av väletablerade cellaktiveringsmarkörer såsom Ki-67 och CD25 och utsöndringen av IFN-γ 28,29,30,31. Inga djur- eller humanförsök utförs under MoDC-analysen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher</td>
			<td>A1049201</td>
			<td>Ammonium-Chloride-Potassium buffer for lysis of residual RBCs in harvested PBMC Fraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Heparin Tubes</td>
			<td>Becton, Dickinson (BD) and Company</td>
			<td>366480</td>
			<td>10 mL, additive sodium heparin 158 USP units, glass tube, 16 x 100 mm size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Dendritic Cell Growth Kit</td>
			<td>Bio-Rad, UK</td>
			<td>PBP015KZZ</td>
			<td>Cytokine cocktail composed of recombinant bovine IL-4 and GM-CSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine IFN-&#947; ELISA Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA5638KZZ</td>
			<td>Kit use for measuring IFN-&#947; expression in culture supernatant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA2678F</td>
			<td>Mouse anti-bovine CD14 monoclonal antibody, clone CC-G33, isotype IgG1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD25 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA2430PE</td>
			<td>Mouse anti bovine CD25 monoclonal antibody, clone IL-A11, isotype IgG1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA1653A647</td>
			<td>Mouse anti bovine CD4 monoclonal antibody, clone CC8, isotype IgG2a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD40 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA2431F</td>
			<td>Mouse anti-bovine CD40 monoclonal antibody, clone IL-A156, isotype IgG1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA837F</td>
			<td>Mouse anti bovine CD8 monoclonal antibody, clone CC63, isotype IgG2a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD86 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA2437PE</td>
			<td>Mouse anti-bovine CD86 monoclonal antibody, clone IL-A190, isotype IgG1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>-</td>
			<td>Thermal cycler PCR machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Centrifuge Tube</td>
			<td>Falcon Corning&#160;</td>
			<td>352096 &#38; 352070</td>
			<td>15 mL and 50 mL, high-clarity poypropylene conical bottom, graduated, sterial, seal screw cap, falcon tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix/Cytoperm Plus</td>
			<td>BD Bio Sciences</td>
			<td>555028</td>
			<td>Fixation/permeabilization kit with BD golgiPlug, use for flow cytometer cell staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1009832500</td>
			<td>Absolute for analysis EMSURE&#160;ACS,ISO, Reag. Ph Eur</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher</td>
			<td>10500064</td>
			<td>Qualified, heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll Plaque PLUS</td>
			<td>GE Health care Life Sciences, USA</td>
			<td>341691</td>
			<td>Lymphocyte-isolation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowClean Cleaning Agent</td>
			<td>Beckman Coulter, Life Sciences</td>
			<td>A64669</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>FlowJo, Becton, Dickinson (BD) and Company, LLC, USA</td>
			<td>-</td>
			<td>Flow cytometer Histogram software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowTubes/ FACS&#160; (Fluorescence-activated single-cell sorting) Tube</td>
			<td>Falcon Corning&#160;</td>
			<td>352235</td>
			<td>5 mL, sterial, round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap, use in flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresceinisothiocynat-Dextran</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>60842-46-8</td>
			<td>FITC-dextran MW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallios Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>-</td>
			<td>Flow cytometer machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard-Shell 96-Well PCR Plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSP9601</td>
			<td>96 well, low profile, thin wall, skirted, white/clear</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human CD14 MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi Bioteck, Germany</td>
			<td>130-050-201</td>
			<td>2 mL microbeads conjugated to monoclonal anti-human CD14 antibody isotype IgG2a, used for selection of bovine monocytes from PBMCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaluza</td>
			<td>Beckman Coulter, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>Flow cytometer multicolor data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Column</td>
			<td>Miltenyi Bioteck, Germany</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Magnetic activated cell sorting or immune magentic cell separation colum for separation of various CD14 cell population based on cell surface antigens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC Class II DQ DR Polymorphic Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA2228F</td>
			<td>Mouse anti-sheep MHC Class II DQ DR Polymorphic:FITC, clone 49.1, isotype IgG2a, cross reactive with bovine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>HS4325</td>
			<td>1.5 mL, conical bottom, graduated, sterial tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Power Point</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>-</td>
			<td>The graphical illustrations of experimental design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 Negative Control:FITC for CD14, CD40 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA928F</td>
			<td>Isotype control CD14 and CD40 monoclonal antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 Negative Control:PE for CD86 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA928PE</td>
			<td>Isotype control CD86 monoclonal antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 Negative Control:RPE for CD25 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA928PE</td>
			<td>Isotype control CD25 monoclonal antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG2a Negative Control:FITC for MHC Class II Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA929F</td>
			<td>Isotype control for MHC class II monoclonal antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nobivac Rabies</td>
			<td>MSD Animal Health, UK</td>
			<td>-</td>
			<td>1 &#181;L/mL of cell cultured inactivated vaccine containing &#62; 2 I.U./mL Rabies virus strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical seals</td>
			<td>Bi0-Rad</td>
			<td>TCS0803</td>
			<td>0.2 mL flat PCR tube 8-cap strips, optical, ultraclear, compatible for qPCR machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td>pH 7.4, 1x concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism - GraphPad 5 Software&#160;</td>
			<td>Dotmatics</td>
			<td>-</td>
			<td>Statistical software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Anti-human Ki-67 antibody</td>
			<td>Biolegend, USA</td>
			<td>350501</td>
			<td>Monoclonal antibody, cross reactive with cow, clone ki-67</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Mouse IgG1 k Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>400101</td>
			<td>Isotype control for Ki-67 monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>READIDROP Propidium Iodide</td>
			<td>BD Bio Sciences</td>
			<td>1351101</td>
			<td>Live/dead cell marker used for flow cytometry, amine reactive dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-2 Protein</td>
			<td>R&#38;D System, USA</td>
			<td>202-IL-010/CF</td>
			<td>Interleukin-2, 20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74106</td>
			<td>Kit use for extraction of total RNA; RLT buffer = lysis buffer; RW1 buffer = stringent guanidine-containing washing buffer; RDD buffer = DNase buffer; RPE buffer = mild wash buffer; RNaseOUT = RNase inhibitor.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td>Cell culture media with L-glutamine and sodium bicarbonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMART-servier medical art&#160;</td>
			<td>Les Laboratories Servier</td>
			<td>-</td>
			<td>Licensed under a creative commons attribution 3.0 unported license</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>172-5270</td>
			<td>2x qPCR mix conatins dNTPs, Ss07d fusion polymerase, MgCl2, SYBR Green I supermix = supermix, ROX normalization dyes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III First-Strand Synthesis System</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher</td>
			<td>18080051</td>
			<td>Kit for cDNA synthsis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Test plate 24</td>
			<td>TPP, Switzerland</td>
			<td>92024</td>
			<td>24 well plate, sterilized by radiation , growth enhanced treated, volume 3.18 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher</td>
			<td>15250061</td>
			<td>0.4%, 100 mL, dye to assess cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher</td>
			<td>10977023</td>
			<td>0.1 &#181;m membrane filtered distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15206067</td>
			<td>VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes have a green top and contain spray-dried lithium, sodium or ammonium heparin on the inner walls and are usedin clinical chemistry, immunology and serology. The anticoagulant heparin activates antithrombin, which blocks the clotting cascade and thus produces a whole blood/plasma sample.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W3500-1L</td>
			<td>Sterile-filtered, bioReagent suitable for cell culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of vaccine immunogenicity using bovine monocyte-derived dendritic cells

Dendritiska celler (DC) är de mest potenta antigenpresenterande cellerna (APC) i immunsystemet. De patrullerar organismen och letar efter patogener och spelar en unik roll inom immunsystemet genom att länka de medfödda och adaptiva immunsvaren. Dessa celler kan fagocytera och sedan presentera fångade antigener till effektorimmunceller, vilket utlöser ett brett spektrum av immunsvar. Denna artikel demonstrerar en standardiserad metod för in vitro-generering av bovint monocyt-härledda dendritiska celler (MoDCs) isolerade från perifera mononukleära celler från nötkreatur (PBMC) och deras tillämpning vid utvärdering av vaccinimmunogenicitet.
Magnetbaserad cellsortering användes för att isolera CD14 + -monocyter från PBMC, och tillskott av komplett odlingsmedium med interleukin (IL) -4 och granulocyt-makrofagkolonistimulerande faktor (GM-CSF) användes för att inducera differentieringen av CD14 + -monocyter till naiva MoDC. Genereringen av omogna MoDCs bekräftades genom detektering av uttrycket av stora histokompatibilitetskomplex II (MHC II), CD86 och CD40 cellytmarkörer. Ett kommersiellt tillgängligt rabiesvaccin användes för att pulsa de omogna MoDC, som därefter samodlades med naiva lymfocyter.
Flödescytometrianalysen av antigenpulsade MoDCs och lymfocytsamodling avslöjade stimulering av T-lymfocytproliferation genom uttryck av Ki-67-, CD25-, CD4- och CD8-markörer. Analysen av mRNA-uttrycket av IFN-γ och Ki-67, med kvantitativ PCR, visade att MoDCs kunde inducera antigenspecifik priming av lymfocyter i detta in vitro-samodlingssystem . Dessutom visade IFN-γ-sekretion bedömd med ELISA en signifikant högre titer (**p < 0,01) i den rabiesvaccinpulsade MoDC-lymfocytsamkulturen än i den icke-antigenpulsade MoDC-lymfocytsamkulturen. Dessa resultat visar validiteten av denna in vitro MoDC-analys för att mäta vaccinimmunogenicitet, vilket innebär att denna analys kan användas för att identifiera potentiella vaccinkandidater för nötkreatur innan man fortsätter med in vivo-studier , liksom i vaccinimmunogenicitetsbedömningar av kommersiella vacciner.

Denna metod beskriver in vitro-generering av MoDC för nötkreatur för utvärdering av vaccinkandidatantigener innan in vivo-studier utförs. Figur 1 illustrerar försöksschemat för generering av MoDC från nötkreatur och tillämpningen av MoDC för in vitro-testet. Med hjälp av den magnetbaserade cellsorteringstekniken var det möjligt att samla in cirka 26 miljoner CD14 + myocyter från de skördade PBMC: erna, som tidigare isolerades från 50 ml ...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells at JoVE.com

Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells

Metoden beskriver genereringen av dendritiska celler som härrör från bovina monocyter (MoDC) och deras tillämpning för in vitro-utvärdering av antigena kandidater under utvecklingen av potentiella veterinärvacciner hos nötkreatur.

Bestämning av vaccinimmunogenicitet med hjälp av dendritiska celler härledda från nötkreatur

Dendritic cells (DCs) are the most potent antigen-presenting cells (APCs) within the immune system. They patrol the organism looking for pathogens and ...

Detta protokoll representerar en funktionell in vitro-analys med hjälp av dendritiska celler som härrör från bovina monocyter för att mäta vaccinimmunogenicitet före in vivo-studier. Därför fyller ett befintligt gap i boskapsvaccinologi. Det är generering och applicering av dendritiska celler.Som de mest potenta antigenpresenterande cellerna har dendritiska celler blivit ett viktigt forskningsmål för att förstå intracellulära immunmekanismer inklusive vaccineffektivitet. Denna analys kan implementeras som ett verktyg för screening av vaccinkandidater, som ett kvalitetskontrolltillstånd för vaccinproduktion och för val av antigen och adjuvans. Demonstrerar proceduren kommer att vara Richard Kangethe, forskare i djurproduktions- och hälsolaboratoriet.Börja med att invertera och blanda blodet som erhålls från kalvens halsvenpunktion med hepariniserade vacutainers. Överför sedan 20 ml hepariniserat blod till ett sterilt 50 ml rör och späd det med 10 ml fosfatbuffrad saltlösning eller PBS. Pipettera 15 ml lymfocytisoleringsmedium till ett sterilt 50 ml rör och luta röret till ett 45 graders läge.Lägg försiktigt 30 ml PBS-medium i blodet ovanpå lymfocytisoleringen med en 25 ml pipett och sätt långsamt tillbaka röret till vertikalt läge innan du centrifugerar det. Samla sedan det tunna vita lagret av mononukleära celler i perifert blod eller PBMC-skikt med en pasteurpipett och överför det till ett nytt 50 ml rör. Tvätta de skördade PBMC: erna två gånger med 40 ml PBS per tvätt och blanda det noggrant.Efter centrifugering, suspendera pelleten i 15 ml ammoniumkloridkaliumbuffert eller ACK-buffert. Efter 10 till 15 minuters inkubation vid rumstemperatur, tillsätt upp till 40 ml PBS och centrifugera röret med maximal acceleration och retardation. Återsuspendera pelleten i 10 ml komplett odlingsmedium.Tillsätt sedan fem mikroliter CD14 MicroBead-buffert per 10 miljoner celler och blanda noggrant med en pipett. För flödescytometrianalys, tillsätt 10 mikroliter CD14-fluoresceinisotiocyanat eller FITC-färgningsantikropp till PBMC: erna och inkubera den i 15 minuter vid fyra till åtta grader Celsius innan du fortsätter med flödescytometrin. Till de ofärgade PBMC: erna, tillsätt en milliliter faxbuffert och centrifugera den i sju minuter vid 500 g och fyra grader Celsius.Återsuspendera sedan pelleten i 500 mikroliter faxbuffert per 100 miljoner celler. Sätt sedan in den immunomagnetiska cellseparationskolonnen i separatorn och placera ett 50 ml uppsamlingsrör under kolonnutloppet för att samla genomströmningen. Efter tvättning av kolonnen med en milliliter avgasad faxbuffert, byt ut det använda 15 ml röret med ett nytt.Pipettera hundra miljoner celler i 500 mikroliter buffert åt gången, så att cellsuspensionen kan passera genom kolonnen. Skölj sedan kolonnen tre gånger med tre milliliter avgasad faxbuffert varje gång. Efter insamling av genomströmningen, märk den första eluerade naiva lymfocytfraktionen som den CD14-negativa cellfraktionen.Ta bort kolonnen från separatorn och placera ett nytt sterilt 15 ml rör under kolonnen för uppsamling av avloppsvatten. Tillsätt fem milliliter faxbuffert i kolonnen och tryck omedelbart igenom den med kolven. Samla in och märk den andra genomströmningen eller den naiva monocytfraktionen som den CD14-positiva cellfraktionen.Lägg till komplett odlingsmedium till de skördade CD14-positiva monocyterna för att uppnå 1 miljon celler per milliliter. Tillsätt sedan en milliliter cellsuspension till varje brunn på en steril 24-brunnsplatta innan du kompletterar varje brunn med 40 mikroliter cytokincocktail som finns i satsen. På dag två, överför hälften av varje brunns innehåll till enskilda 1,5 milliliter rör med hjälp av en pipett.Efter centrifugering av 1,5 milliliterrören vid 500 g i sju minuter, kassera supernatanten och återsuspendera pelleten i 500 mikroliter färskt komplett odlingsmedium. Överför 500 mikroliter av denna återsuspenderade cellsuspension tillbaka till motsvarande brunnar så att den slutliga volymen i brunnen blir en milliliter. Berika varje brunn med 20 mikroliter cytokincocktail.För att generera antigenpulsade MoDC, tillsätt en mikroliter per milliliter rabiesvirusvaccin eller RV-suspension till en milliliter naiv MoDC-kultur i 24-brunnsplattan och inkubera plattan i 48 timmar vid 5% koldioxid och 37 grader Celsius. På dag sju, håll 24-brunnsplattan som innehåller de antigenpulsade MoDC: erna på is i 10 minuter innan du tillsätter en milliliter iskall PBS per brunn och blandar den noggrant. Överför suspensionen till ett 15 ml rör.Tvätta brunnarna med två milliliter iskall PBS. Samla kvarvarande celler i varje brunn och överför det tvättade innehållet till sina respektive rör. Centrifugera cellsuspensionen vid 500 g i sju minuter.Efter kassering av supernatanten, resuspendera den antigenpulserade MoDCs-cellpelleten i ett komplett odlingsmedium för att justera den slutliga koncentrationen av 100 000 celler per milliliter. För samodling av MoDC-lymfocyter, ympa brunnarna på en steril platta med 24 brunnar med en milliliter naiv lymfocytcellsuspension och en milliliter antigenpulsad eller icke-antigenpulsad MoDC-suspension på antigenpulsens sjunde dag. Efter två dagars inkubation, komplettera varje brunn med 20 nanogram per milliliter rekombinant interleukin-2 och fortsätt inkubationen i ytterligare 120 timmar.På dag 14, överför en milliliter av samkulturen till ett sterilt 1,5 ml rör och centrifugera röret. Resuspendera sedan cellpelleten med en milliliter antigenpulsad eller icke-pulsad MoDC. Blanda väl och överför cellsuspensionerna till motsvarande brunnar.Efter färgning av cellytan av PBMC och naiva lymfocyter och monocyter, överför en milliliter av cellsuspensionen till ett sterilt 1,5 ml rör med pipett och centrifugera i 10 minuter vid 500 g. Återsuspendera sedan pelleten i en milliliter PBS och överför den till ett 15 ml rör. Samla också restcellerna och motsvarande rör med en milliliter PBS.Tillsätt sedan 10 ml PBS till 15 ml röret som innehåller cellerna och blanda genom pipettering. Efter centrifugering av röret i sju minuter vid 850 g, avlägsna supernatanten och suspendera försiktigt cellpelleten med kvarvarande suspension kvar efter dekantering av supernatanten. Överför cellsuspensionen till en V-botten 96-brunnsplatta och täta brunnarna för att undvika spill.När färgningen är klar, utför flödescytometeranalysen. Från förhandsgranskningen i realtid justerar du tröskeln för fluorescens inklusive spänning och förstärkning och cellstorlek för att så småningom rita grindar runt den önskade cellpopulationen samtidigt som eventuella cellulära skräp utesluts. CD14-cellfärgning och flödescytometri visade att den naiva monocytfraktionen omfattade 98% CD14-positiva monocytceller och var funktionellt kapabel till antigenupptag.De naiva MoDCs fenotypiskt karakteriserade genom att bedöma uttrycket av MHC klass 2 och co-stimulerande CD86 och CD40 cellytmarkörer validerade dendritiska celler eller DC-liknande fenotyp. Under samkulturen av MoDC-lymfocyter på dag nio observerades en morfologisk förändring som visade dendritförlängning i RV-pulsen till MoDCs. Jämfört med den icke-pulsade MoDC-lymfocytkulturen visades en signifikant ökning av lymfocytproliferation genom uppreglering av Ki67- och CD25-aktiveringsmarkörerna på CD4-positiva och CD8-positiva T-celler på dag 16 i den pulsade MoDC-lymfocytsamkulturen.De CD8-positiva T-cellerna från de mogna RV-pulsade MoDC-samkulturerna uppvisade en åttafaldig uppreglering av Ki67 jämfört med den icke-specifika gruppen. De CD4-positiva cellerna i samma samkultur visade en sjufaldig ökning av Ki67 jämfört med kontroller, vilket visar förmågan hos RV-grundade MoDCs att presentera RV-antigenet för naiva lymfocyter och aktivera dem i ett in vitro-tillstånd. qPCR-kvantifieringen av samkulturer visade mer än 30% ökning av interferon gammauttryck och mer än 5% ökning av Ki67-uttryck i alla samkulturer som använde GAPDH som kalibrator.En signifikant högre koncentration av utsöndrat interferon gamma observerades i RV-pulsad samodling av MoDC-lymfocyter jämfört med den icke-specifika behandlingsgruppen. Utför skiktningssteget mycket långsamt och noggrant, se till att blod läggs ovanpå lymfocytisoleringsmediet. Var extra noga med att samla in alla PBMC utan att samla in för mycket material från de andra lagren.Andra metoder såsom flödescytometri, ELISA och kvantitativ PCR, bland andra, kan tillämpas efter denna procedur för att utvärdera aktiveringen av immunmarkörer.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Isolering av Dendritiska Mouse lungceller

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells

Generering av ett nytt dendritiskt cellvaccin med melanom och skivepitelcancerstamceller

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H ...

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â² in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Aktivering och Mätning av NLRP3 inflamma aktivitet med användning av IL-1β i human monocyt-härledda dendritiska celler

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Kultur av makrofag kolonistimulerande faktor Differentierad Human Monocyte-härledda makrofager

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

Karakterisering av mänskliga monocythärledda dendritiska celler från Imaging Flow Cytometry: en jämförelse mellan två monocyt Isoleringsprotokoll

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Generation av mänskliga monocythärledda dendritiska celler från helblod

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

Utveckling och validering av en Ultrasensitive enda molekyl Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay för humant Interferon-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

siRNA Electroporation to Modulate Autophagy in Herpes Simplex Virus Type 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells

siRNA elektroporation att modulera autofagi i herpes simplex virus typ 1-infekterade Monocyte-derived dendritiska celler

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) induces autophagy in both, immature dendritic cells (iDCs) as well as mature dendritic cells (mDCs), whereas ...

In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

In vitro-stimulering och visualisering av extracellulär fälla release i differentierade humana Monocyte-derived makrofager

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic ...

Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages

Visualisering av inflammatorisk kaspas inducerad närhet i humana monocyt-härledda makrofager

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct ...