Name: determination of vaccine immunogenicity using bovine monocyte-derived dendritic cells
Uploaded: 2023-05-19T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells at JoVE.com

Hayvanların sağlık durumlarını belirleme ve BTV'yi sağlama konusundaki destekleri için Dr. Eveline Wodak ve Dr. Angelika Loistch (AGES), sığır kanı sağladığı için Dr. Bernhard Reinelt'e ve IAEA'dan Dr. Bharani Settypalli ve Dr. William Dundon'a gerçek zamanlı PCR deneyleri ve dil düzenleme konusunda yararlı tavsiyeler için teşekkür ederiz.

Kan alımı, Avusturya Sağlık ve Gıda Güvenliği Ajansı'nın (AGES) etik kurallarına ve kabul edilen hayvan refahı standartlarına uygun olarak sertifikalı bir veteriner servisi tarafından gerçekleştirilir32. Çalışma Avusturya Tarım Bakanlığı'ndan etik onay aldı. MoDC'lerin üretimi için deneysel tasarım ve sonraki uygulamaları Şekil 1'de gösterilmiştir.
1. Naif MoDC'lerin üretimi
<p class="jove_...

Bu çalışma, sığır MoDC'lerinin üretilmesi ve fenotiplenmesi için standartlaştırılmış bir in vitro yöntemi ve bunların ticari bir aşının (örneğin, RV) aşı immünojenitesini ölçmede daha sonraki kullanımlarını göstermektedir. Sığır MoDC'leri, sığır hastalıklarına karşı potansiyel aşı antijenlerini taramak ve in vivo hayvan deneylerine geçmeden önce bağışıklık tepkilerine dayanarak potansiyel klinik etkilerini tahmin etmek için bir araç olarak kullanılabili...

Veteriner aşılaması, hayvancılık sektörünü küresel olarak etkileyen hastalıklara karşı koruma sağlayarak gıda güvenliğinin ve hayvan refahının iyileştirilmesine katkıda bulunduğundan, hayvancılık ve sağlığın çok önemli bir yönünü temsil etmektedir1. Olası aşı adaylarının immünojenisitesini değerlendirmek için etkili bir in vitro yöntem, aşı geliştirme ve üretim sürecini hızlandırmaya yardımcı olacaktır. Bu nedenle, immün tahliller alanını in vitro çalışmalara dayanan yenilikçi metodolojilerle genişletmek gereklidir, çünkü bu, bağışıklama ve patojen enfeksiyonu ile ilgili bağışıklık süreçlerinin karmaşıklığını ortaya çıkarmaya yardımcı olacaktır. Şu anda, periyodik örnekleme gerektiren in vivo hayvan bağışıklaması ve meydan okuma çalışmaları (örneğin, kan ve dalak), aday aşıların ve adjuvanların immünojenisitesini ölçmek için kullanılmaktadır. Bu tahliller pahalı, zaman alıcı ve etik etkileri vardır, çünkü çoğu durumda hayvan ötenazisi denemelerin sonunda gerçekleştirilir.
İn vivo testlere alternatif olarak, in vitro2'de aşı kaynaklı immün yanıtları değerlendirmek için periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC'ler) kullanılmıştır. PBMC'ler %70-90 lenfositler, %10-20 monositler ve sınırlı sayıda dendritik hücreden (DC'ler, %1-%2)3 oluşan heterojen bir hücre popülasyonudur. PBMC'ler, B hücreleri, monositler ve DC'ler gibi antijen sunan hücreleri (APC'ler) barındırır ve bunlar enfeksiyon veya doku hasarı belirtileri arayan organizmada sürekli devriye gezer. Lokal olarak salgılanan kemokinler, hücre yüzey reseptörlerine bağlanarak APC'lerin bu bölgelere alınmasını ve aktivasyonunu kolaylaştırır. Monositler söz konusu olduğunda, kemokinler kaderlerini DC'lere veya makrofajlara farklılaşmayayönlendirir 4. DC'ler bir patojenle karşılaşıp yakaladıkları anda, sekonder lenfoid organlara göç ederler, burada işlenmiş patojen peptid antijenlerini majör histokompatibilite kompleksi (MHC) sınıf I veya sınıf II yüzey proteinlerini kullanarak sırasıyla CD8 + T hücrelerine veya CD4 + T hücrelerine sunabilirler, böylece bir bağışıklık tepkisini tetiklerler 5,6.
DC'lerin çeşitli patojenlere karşı koruyucu bir bağışıklık tepkisi düzenlemede oynadığı kilit rol, özellikle enfeksiyöz ajanlara karşı aşılar ve adjuvanlar tasarlarken, onları hücre içi bağışıklık mekanizmalarını anlamak için ilginç bir araştırma hedefi haline getirmektedir7. PBMC'lerden elde edilebilecek DC'lerin fraksiyonu oldukça küçük olduğundan (% 1 -% 2), bunun yerine in vitro8'de DC'ler üretmek için monositler kullanılmıştır. Bu monosit türevi DC'ler (MoDC'ler) başlangıçta kanser immünoterapisinde olası bir tedavi stratejisi olarak geliştirilmiştir9. Daha yakın zamanlarda, MoDC'ler aşı araştırmaları için kullanılmıştır10,11,12 ve klasik monositler MoDC üretimi için baskın alt tiptir (% 89) 13. MoDC'lerin in vitro üretimi daha önce interlökin-4 (IL-4), tümör nekroz faktörü α (TNF-α) veya IL-1314,15,16 gibi diğer sitokinlerle kombinasyon halinde verilen granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktörün (GM-CSF) eklenmesiyle sağlanmıştır.
Bir in vitro MoDC testinin başarısı, antijenle uyarılmış olgun MoDC'lerin, tespit edilen antijen tipine özgü immün yanıtın kapsamını ve tipini modüle etme kapasitesine dayanır17. MoDC'ler tarafından tanınan ve sunulan patojen tipi, CD4 + T yardımcı (Th) hücrelerinin Th1, Th2 veya Th17 efektör hücrelerine farklılaşmasını belirler ve patojene özgü bir sekretuar sitokin profili ile karakterize edilir. Hücre içi patojenlere karşı bir Th1 yanıtı ortaya çıkar ve fagositik bağımlı korumayı modüle eden interferon-gama (IFN-γ) ve tümör nekroz faktörü beta'nın (TNF-β) salgılanmasıyla sonuçlanır. Paraziter organizmalara karşı bir Th2 yanıtı tetiklenir ve fagositik bağımsız humoral korumayı başlatan IL-4, IL-5, IL-10 ve IL-13 sekresyonu ile karakterizedir. Th17, IL-17, IL-17F, IL-6, IL-22 ve TNF-18,19,20,21 salgılanmasının aracılık ettiği hücre dışı bakteriyel ve fungal enfeksiyonlara karşı nötrofil bağımlı koruma sağlar α. Önceki çalışmalara dayanarak, tüm patojenlerin beklenen sitokin profiline girmediği belirtilmiştir. Örneğin, dermal MoDC'ler, Leishmania paraziter enfeksiyonuna yanıt olarak, CD4 + T hücrelerinden ve CD8 + T hücrelerinden IFN-γ sekresyonunu uyarır, böylece koruyucu bir proinflamatuar Th1 yanıtını indükler22.
Ayrıca, Salmonella lipopolisakkarit (LPS) ile astarlanmış tavuk MoDC'lerinde, hem Th1 hem de Th2 yanıtlarını aktive ederek Salmonella typhimurium'a karşı değişken bir yanıt indükleyebileceği, oysa Salmonella gallinarum'un tek başına bir Th2 yanıtını indüklediği gösterilmiştir, bu da ikincisinin MoDC klirensi23'e karşı daha yüksek direncini açıklayabilir. MoDC'lerin Brucella canis'e (B. canis) karşı aktivasyonu hem köpek hem de insan MoDC'lerinde de bildirilmiştir, yani bu zoonotik bir enfeksiyon mekanizmasını temsil edebilir24. B. canis ile astarlanan insan MoDC'leri, şiddetli enfeksiyona direnç kazandıran güçlü bir Th1 yanıtını indüklerken, köpek MoDC'leri, azaltılmış bir Th1 yanıtı ile baskın bir Th17 yanıtını indükler ve daha sonra kronik enfeksiyonun kurulmasına yol açar25. Sığır MoDC'leri, immünoglobulin G (IgG) ile konjuge edilmiş ayak ve ağız hastalığı virüsü (FMDV) için, tek başına konjuge olmayan FMDV'ye kıyasla gelişmiş bir afinite gösterir, çünkü MoDC'ler önceki10'a yanıt olarak bir viral-antikor kompleksi oluşturur. Birlikte ele alındığında, bu çalışmalar MoDC'lerin patojen enfeksiyonu sırasında bağışıklık tepkilerinin karmaşıklığını analiz etmek için nasıl kullanıldığını göstermektedir. Adaptif immün yanıtlar, lenfosit proliferasyonu ile ilişkili spesifik belirteçlerin nicelleştirilmesi ile değerlendirilebilir. Sadece bölünen hücrelerde tespit edilen hücre içi bir protein olan Ki-67, proliferasyon çalışmaları için güvenilir bir belirteç olarak kabul edilir 26 ve benzer şekilde, aktivasyonun geç fazı sırasında T hücrelerinin yüzeyinde eksprese edilen CD25, lenfosit proliferasyonunakarşılık gelir 27,28.
Bu çalışma, sığır MoDC'lerinin in vitro jenerasyonu için standartlaştırılmış bir yöntem ve ardından aşıların immünojenisitesini test etmek için kullanılan in vitro immün tahlilde uygulanmasını göstermektedir. Bu tahlilin etkinliğini doğrulamak için ticari olarak temin edilebilen bir kuduz aşısı (RV) kullanılmıştır. T lenfosit aktivasyonu ve proliferasyonu, Ki-67 ve CD25 gibi iyi bilinen hücre aktivasyon belirteçlerinin analizi ve IFN-γ28,29,30,31 sekresyonu yoluyla akım sitometrisi, gerçek zamanlı kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) ve enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) ile ölçüldü. MoDC testi sırasında hiçbir hayvan veya insan deney denemesi yapılmaz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher</td>
			<td>A1049201</td>
			<td>Ammonium-Chloride-Potassium buffer for lysis of residual RBCs in harvested PBMC Fraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Heparin Tubes</td>
			<td>Becton, Dickinson (BD) and Company</td>
			<td>366480</td>
			<td>10 mL, additive sodium heparin 158 USP units, glass tube, 16 x 100 mm size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Dendritic Cell Growth Kit</td>
			<td>Bio-Rad, UK</td>
			<td>PBP015KZZ</td>
			<td>Cytokine cocktail composed of recombinant bovine IL-4 and GM-CSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine IFN-&#947; ELISA Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA5638KZZ</td>
			<td>Kit use for measuring IFN-&#947; expression in culture supernatant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA2678F</td>
			<td>Mouse anti-bovine CD14 monoclonal antibody, clone CC-G33, isotype IgG1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD25 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA2430PE</td>
			<td>Mouse anti bovine CD25 monoclonal antibody, clone IL-A11, isotype IgG1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA1653A647</td>
			<td>Mouse anti bovine CD4 monoclonal antibody, clone CC8, isotype IgG2a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD40 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA2431F</td>
			<td>Mouse anti-bovine CD40 monoclonal antibody, clone IL-A156, isotype IgG1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA837F</td>
			<td>Mouse anti bovine CD8 monoclonal antibody, clone CC63, isotype IgG2a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD86 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA2437PE</td>
			<td>Mouse anti-bovine CD86 monoclonal antibody, clone IL-A190, isotype IgG1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>-</td>
			<td>Thermal cycler PCR machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Centrifuge Tube</td>
			<td>Falcon Corning&#160;</td>
			<td>352096 &#38; 352070</td>
			<td>15 mL and 50 mL, high-clarity poypropylene conical bottom, graduated, sterial, seal screw cap, falcon tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix/Cytoperm Plus</td>
			<td>BD Bio Sciences</td>
			<td>555028</td>
			<td>Fixation/permeabilization kit with BD golgiPlug, use for flow cytometer cell staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1009832500</td>
			<td>Absolute for analysis EMSURE&#160;ACS,ISO, Reag. Ph Eur</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher</td>
			<td>10500064</td>
			<td>Qualified, heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll Plaque PLUS</td>
			<td>GE Health care Life Sciences, USA</td>
			<td>341691</td>
			<td>Lymphocyte-isolation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowClean Cleaning Agent</td>
			<td>Beckman Coulter, Life Sciences</td>
			<td>A64669</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>FlowJo, Becton, Dickinson (BD) and Company, LLC, USA</td>
			<td>-</td>
			<td>Flow cytometer Histogram software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowTubes/ FACS&#160; (Fluorescence-activated single-cell sorting) Tube</td>
			<td>Falcon Corning&#160;</td>
			<td>352235</td>
			<td>5 mL, sterial, round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap, use in flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresceinisothiocynat-Dextran</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>60842-46-8</td>
			<td>FITC-dextran MW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallios Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>-</td>
			<td>Flow cytometer machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard-Shell 96-Well PCR Plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSP9601</td>
			<td>96 well, low profile, thin wall, skirted, white/clear</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human CD14 MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi Bioteck, Germany</td>
			<td>130-050-201</td>
			<td>2 mL microbeads conjugated to monoclonal anti-human CD14 antibody isotype IgG2a, used for selection of bovine monocytes from PBMCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaluza</td>
			<td>Beckman Coulter, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>Flow cytometer multicolor data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Column</td>
			<td>Miltenyi Bioteck, Germany</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Magnetic activated cell sorting or immune magentic cell separation colum for separation of various CD14 cell population based on cell surface antigens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC Class II DQ DR Polymorphic Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA2228F</td>
			<td>Mouse anti-sheep MHC Class II DQ DR Polymorphic:FITC, clone 49.1, isotype IgG2a, cross reactive with bovine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>HS4325</td>
			<td>1.5 mL, conical bottom, graduated, sterial tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Power Point</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>-</td>
			<td>The graphical illustrations of experimental design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 Negative Control:FITC for CD14, CD40 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA928F</td>
			<td>Isotype control CD14 and CD40 monoclonal antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 Negative Control:PE for CD86 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA928PE</td>
			<td>Isotype control CD86 monoclonal antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 Negative Control:RPE for CD25 Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA928PE</td>
			<td>Isotype control CD25 monoclonal antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG2a Negative Control:FITC for MHC Class II Antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA929F</td>
			<td>Isotype control for MHC class II monoclonal antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nobivac Rabies</td>
			<td>MSD Animal Health, UK</td>
			<td>-</td>
			<td>1 &#181;L/mL of cell cultured inactivated vaccine containing &#62; 2 I.U./mL Rabies virus strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical seals</td>
			<td>Bi0-Rad</td>
			<td>TCS0803</td>
			<td>0.2 mL flat PCR tube 8-cap strips, optical, ultraclear, compatible for qPCR machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td>pH 7.4, 1x concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism - GraphPad 5 Software&#160;</td>
			<td>Dotmatics</td>
			<td>-</td>
			<td>Statistical software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Anti-human Ki-67 antibody</td>
			<td>Biolegend, USA</td>
			<td>350501</td>
			<td>Monoclonal antibody, cross reactive with cow, clone ki-67</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Mouse IgG1 k Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>400101</td>
			<td>Isotype control for Ki-67 monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>READIDROP Propidium Iodide</td>
			<td>BD Bio Sciences</td>
			<td>1351101</td>
			<td>Live/dead cell marker used for flow cytometry, amine reactive dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-2 Protein</td>
			<td>R&#38;D System, USA</td>
			<td>202-IL-010/CF</td>
			<td>Interleukin-2, 20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74106</td>
			<td>Kit use for extraction of total RNA; RLT buffer = lysis buffer; RW1 buffer = stringent guanidine-containing washing buffer; RDD buffer = DNase buffer; RPE buffer = mild wash buffer; RNaseOUT = RNase inhibitor.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td>Cell culture media with L-glutamine and sodium bicarbonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMART-servier medical art&#160;</td>
			<td>Les Laboratories Servier</td>
			<td>-</td>
			<td>Licensed under a creative commons attribution 3.0 unported license</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>172-5270</td>
			<td>2x qPCR mix conatins dNTPs, Ss07d fusion polymerase, MgCl2, SYBR Green I supermix = supermix, ROX normalization dyes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III First-Strand Synthesis System</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher</td>
			<td>18080051</td>
			<td>Kit for cDNA synthsis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Test plate 24</td>
			<td>TPP, Switzerland</td>
			<td>92024</td>
			<td>24 well plate, sterilized by radiation , growth enhanced treated, volume 3.18 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher</td>
			<td>15250061</td>
			<td>0.4%, 100 mL, dye to assess cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher</td>
			<td>10977023</td>
			<td>0.1 &#181;m membrane filtered distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15206067</td>
			<td>VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes have a green top and contain spray-dried lithium, sodium or ammonium heparin on the inner walls and are usedin clinical chemistry, immunology and serology. The anticoagulant heparin activates antithrombin, which blocks the clotting cascade and thus produces a whole blood/plasma sample.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W3500-1L</td>
			<td>Sterile-filtered, bioReagent suitable for cell culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of vaccine immunogenicity using bovine monocyte-derived dendritic cells

Dendritik hücreler (DC'ler), bağışıklık sistemi içindeki en güçlü antijen sunan hücrelerdir (APC'ler). Patojen arayan organizmayı devriye gezerler ve doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık tepkilerini birbirine bağlayarak bağışıklık sistemi içinde benzersiz bir rol oynarlar. Bu hücreler fagositleşebilir ve daha sonra yakalanan antijenleri efektör bağışıklık hücrelerine sunarak çeşitli immün yanıtları tetikleyebilir. Bu yazıda, sığır periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC'ler) izole edilen sığır monosit türevi dendritik hücrelerin (MoDC'ler) in vitro jenerasyonu ve aşı immünojenitesinin değerlendirilmesinde uygulanması için standartlaştırılmış bir yöntem gösterilmektedir.
CD14 + monositlerini PBMC'lerden izole etmek için manyetik bazlı hücre sıralama kullanıldı ve CD14 + monositlerin naif MoDC'lere farklılaşmasını indüklemek için interlökin (IL)-4 ve granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) ile tam kültür ortamının takviyesi kullanıldı. Olgunlaşmamış MoDC'lerin oluşumu, majör histokompatibilite kompleksi II (MHC II), CD86 ve CD40 hücre yüzey belirteçlerinin ekspresyonu tespit edilerek doğrulandı. Ticari olarak temin edilebilen bir kuduz aşısı, daha sonra naif lenfositlerle birlikte kültürlenen olgunlaşmamış MoDC'lerin nabzını tutmak için kullanıldı.
Antijen atımlı MoDC'lerin ve lenfosit ko-kültürünün akım sitometri analizi, Ki-67, CD25, CD4 ve CD8 belirteçlerinin ekspresyonu yoluyla T lenfosit proliferasyonunun uyarıldığını ortaya koydu. IFN-γ ve Ki-67'nin mRNA ekspresyonunun kantitatif PCR kullanılarak analizi, MoDC'lerin bu in vitro ko-kültür sisteminde lenfositlerin antijene özgü astarlanmasını indükleyebileceğini göstermiştir. Ayrıca, ELISA kullanılarak değerlendirilen IFN-γ sekresyonu, kuduz aşısı darbeli MoDC-lenfosit ko-kültüründe, antijen darbeli olmayan MoDC-lenfosit ko-kültürüne göre anlamlı derecede daha yüksek bir titre (**p < 0.01) göstermiştir. Bu sonuçlar, aşı immünojenitesini ölçmek için bu in vitro MoDC testinin geçerliliğini göstermektedir, yani bu tahlil, in vivo denemelere devam etmeden önce sığırlar için potansiyel aşı adaylarını tanımlamak ve ticari aşıların aşı immünojenisite değerlendirmelerinde kullanılabilir.

Bu metodoloji, in vivo çalışmalar yapılmadan önce aday aşı antijenlerinin değerlendirilmesi için sığır MoDC'lerinin in vitro jenerasyonunu açıklamaktadır. Şekil 1, sığır MoDC üretiminin deneysel şemasını ve MoDC'lerin in vitro tahlil için uygulanmasını göstermektedir. Manyetik bazlı hücre sıralama tekniğini kullanarak, daha önce 50 mL sığır kanından izole edilen hasat edilen PBMC'lerden yaklaşık 26 milyon CD14 + miyo...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells at JoVE.com

Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells

Metodoloji, sığır monosit kaynaklı dendritik hücrelerin (MoDC'ler) oluşumunu ve sığırlarda potansiyel veteriner aşılarının geliştirilmesi sırasında antijenik adayların in vitro değerlendirilmesi için uygulamalarını açıklamaktadır.

Sığır Monosit Kaynaklı Dendritik Hücreler Kullanılarak Aşı İmmünojenitesinin Belirlenmesi

Dendritic cells (DCs) are the most potent antigen-presenting cells (APCs) within the immune system. They patrol the organism looking for pathogens and ...

Bu protokol, in vivo çalışmalardan önce aşı immünojenitesini ölçmek için sığır monosit türevi dendritik hücrelerin kullanıldığı fonksiyonel bir in vitro tahlili temsil eder. Bu nedenle, hayvancılık aşısında mevcut bir boşluğu doldurmak. Dendritik hücrelerin üretilmesi ve uygulanmasıdır.En güçlü antijen sunan hücreler olan dendritik hücreler, aşı etkinliği de dahil olmak üzere hücre içi bağışıklık mekanizmalarını anlamak için kilit bir araştırma hedefi haline gelmiştir. Bu tahlil, aşı adaylarının taranmasında bir araç olarak, aşı üretimi için bir kalite kontrol durumu olarak ve antijen ve adjuvan seçimi için uygulanabilir. Prosedürü gösteren, hayvansal üretim ve sağlık laboratuvarında bilim adamı Richard Kangethe olacak.Baldırın juguler ven delinmesinden elde edilen kanı heparinize vakumerlerle ters çevirerek ve karıştırarak başlayın. Daha sonra 20 mililitre heparinize kanı steril 50 mililitrelik bir tüpe aktarın ve 10 mililitre fosfat tamponlu salin veya PBS ile seyreltin. Pipet, 15 mililitre lenfosit izolasyon ortamını steril 50 mililitrelik bir tüpe yerleştirin ve tüpü 45 derecelik bir konuma getirin.25 mililitrelik bir pipet kullanarak lenfosit izolasyonunun üzerine 30 mililitre kan PBS ortamını dikkatlice katlayın ve santrifüj etmeden önce tüpü yavaşça dikey konuma getirin. Daha sonra bir Pasteur pipeti kullanarak ince beyaz periferik kan mononükleer hücre tabakasını veya PBMC tabakasını toplayın ve yeni bir 50 mililitrelik tüpe aktarın. Hasat edilen PBMC'leri yıkama başına 40 mililitre PBS kullanarak iki kez yıkayın ve iyice karıştırın.Santrifüjlemeden sonra, pelet 15 mililitre amonyum klorür potasyum tamponu veya ACK tamponunda tekrar askıya alın. Oda sıcaklığında 10 ila 15 dakikalık inkübasyondan sonra, 40 mililitreye kadar PBS ekleyin ve tüpü maksimum hızlanma ve yavaşlama ile santrifüj edin. Peleti 10 mililitre tam kültür ortamında tekrar askıya alın.Daha sonra 10 milyon hücre başına beş mikrolitre CD14 MicroBead tamponu ekleyin ve bir pipet kullanarak iyice karıştırın. Akış sitometri analizi için, PBMC'lere 10 mikrolitre CD14 floresein izotiyosiyanat veya FITC boyama antikoru ekleyin ve akış sitometrisine devam etmeden önce dört ila sekiz santigrat derecede 15 dakika boyunca inkübe edin. Lekesiz PBMC'lere, bir mililitre faks arabelleği ekleyin ve 500 g ve dört santigrat derecede yedi dakika boyunca santrifüj edin.Daha sonra peleti 100 milyon hücre başına 500 mikrolitre faks tamponunda yeniden askıya alın. Daha sonra, immünomanyetik hücre ayırma kolonunu separatöre yerleştirin ve akışı toplamak için kolon çıkışının altına 50 mililitrelik bir toplama tüpü yerleştirin. Kolonu bir mililitre gazdan arındırılmış faks tamponu ile yıkadıktan sonra, kullanılmış 15 mililitrelik tüpü yenisiyle değiştirin.Bir seferde 500 mikrolitre tamponda yüz milyon hücreyi pipetleyin, hücre süspansiyonunun kolondan geçmesine izin verin. Ardından, her seferinde üç mililitre gazdan arındırılmış faks arabelleği ile sütunu üç kez durulayın. Akış boyunca toplandıktan sonra, ilk salınımlı naif lenfosit fraksiyonunu CD14 negatif hücre fraksiyonu olarak etiketleyin.Kolonu separatörden çıkarın ve atık su toplama için kolonun altına yeni bir steril 15 mililitrelik tüp yerleştirin. Sütuna beş mililitre faks arabelleği ekleyin ve pistonu kullanarak hemen itin. İkinci akış veya naif monosit fraksiyonunu CD14 pozitif hücre fraksiyonu olarak toplayın ve etiketleyin.Mililitre başına 1 milyon hücreye ulaşmak için hasat edilen CD14 pozitif monositlere tam kültür ortamı ekleyin. Daha sonra, steril 24 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna, her bir kuyucuğu kit içinde sağlanan 40 mikrolitre sitokin kokteyli ile takviye etmeden önce bir mililitre hücre süspansiyonu ekleyin. İkinci günde, her bir kuyucuğun içeriğinin yarısını bir pipet kullanarak ayrı ayrı 1,5 mililitrelik tüplere aktarın.1.5 mililitrelik tüpleri yedi dakika boyunca 500g'de santrifüj ettikten sonra, süpernatantı atın ve peleti 500 mikrolitre taze tam kültür ortamında yeniden askıya alın. Bu yeniden askıya alınmış hücre süspansiyonunun 500 mikrolitresini karşılık gelen kuyucuklara geri aktarın, böylece kuyudaki son hacim bir mililitre olur. Her bir kuyucuğu 20 mikrolitre sitokin kokteyli ile zenginleştirin.Antijen darbeli MoDC'ler üretmek için, 24 kuyucuklu plakadaki bir mililitre naif MoDC kültürüne mililitre kuduz virüsü aşısı veya RV süspansiyonu başına bir mikrolitre ekleyin ve plakayı% 5 karbondioksit ve 37 santigrat derecede 48 saat boyunca inkübe edin. Yedinci günde, antijen darbeli MoDC'leri içeren 24 kuyucuklu plakayı, kuyu başına bir mililitre buz gibi soğuk PBS eklemeden ve iyice karıştırmadan önce 10 dakika boyunca buz üzerinde tutun. Süspansiyonu 15 mililitrelik bir tüpe aktarın.Kuyucukları iki mililitre buz gibi PBS ile yıkayın. Her bir kuyucuktaki artık hücreleri toplayın ve yıkanmış içeriği kendi tüplerine aktarın. Hücre süspansiyonunu yedi dakika boyunca 500g'de santrifüj edin.Süpernatanı attıktan sonra, mililitre başına 100.000 hücrenin nihai konsantrasyonunu ayarlamak için antijen darbeli MoDCs hücre peletini tam bir kültür ortamında yeniden askıya alın. MoDC-lenfosit ko-kültürü için, antijen nabzının yedinci gününde steril 24 delikli bir plakanın kuyularını, bir mililitre naif lenfosit hücre süspansiyonu ve bir mililitre antijen darbeli veya antijen darbeli olmayan MoDC süspansiyonu ile tohumlayın. İki günlük inkübasyondan sonra, her bir kuyucuğu mililitre rekombinant interlökin-2 başına 20 nanogram ile destekleyin ve inkübasyona 120 saat daha devam edin.14. günde, ortak kültürün bir mililitresini steril 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve tüpü santrifüj edin. Daha sonra hücre peletini bir mililitre antijen darbeli veya darbesiz MoDC'lerle yeniden askıya alın. İyice karıştırın ve hücre süspansiyonlarını karşılık gelen kuyucuklarına aktarın.PBMC'lerin ve naif lenfositlerin ve monositlerin hücre yüzeyinde boyanmasından sonra, hücre süspansiyonunun bir mililitresini bir pipet ve santrifüj kullanarak 500 g'da 10 dakika boyunca steril 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Daha sonra peleti bir mililitre PBS'de tekrar askıya alın ve 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Ayrıca artık hücreleri ve ilgili tüpleri bir mililitre PBS kullanarak toplayın.Daha sonra hücreleri içeren 15 mililitrelik tüpe 10 mililitre PBS ekleyin ve pipetleme ile karıştırın. Tüpü 850g'de yedi dakika boyunca santrifüj ettikten sonra, süpernatantı çıkarın ve süpernatanı boşalttıktan sonra kalan artık süspansiyonla hücre peletini dikkatlice yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonunu V tabanlı 96 delikli bir plakaya aktarın ve dökülmeyi önlemek için kuyucukları kapatın.Boyama tamamlandıktan sonra, akış sitometresi analizini gerçekleştirin. Gerçek zamanlı önizlemeden, voltaj, kazanç ve hücre boyutu dahil olmak üzere floresan eşiğini ayarlayarak sonunda herhangi bir hücresel enkazı hariç tutarken istenen hücre popülasyonunun etrafına kapılar çizin. CD14 hücre boyama ve akım sitometrisi, naif monosit fraksiyonunun %98 CD14 pozitif monosit hücreden oluştuğunu ve fonksiyonel olarak antijen alımı yapabildiğini göstermiştir.MHC Sınıf 2 ve yardımcı uyarıcı CD86 ve CD40 hücre yüzey belirteçlerinin ekspresyonunu değerlendirerek fenotipik olarak karakterize edilen naif MoDC'ler, dendritik hücreleri veya DC benzeri fenotipi doğruladı. Dokuzuncu günde MoDC lenfosit ko-kültürü sırasında, RV darbesinde MoDC'lere dendrit yayılımını gösteren morfolojik bir değişiklik gözlendi. Darbeli olmayan MoDC lenfosit kültürü ile karşılaştırıldığında, pulse MoDC lenfosit ko-kültüründe 16. günde CD4 pozitif ve CD8 pozitif T-hücreleri üzerindeki Ki67 ve CD25 aktivasyon belirteçlerinin upregülasyonu ile lenfosit proliferasyonunda anlamlı bir artış gösterilmiştir.Olgun RV darbeli MoDC ko-kültürlerinden CD8 pozitif T hücreleri, spesifik olmayan gruba kıyasla Ki67'nin sekiz kat yukarı regülasyonunu sergiledi. Aynı kokültürdeki CD4 pozitif hücreler, kontrollere kıyasla Ki67'de yedi kat artış gösterdi, bu da RV astarlanmış MoDC'lerin RV antijenini naif lenfositlere sunma ve bunları in vitro bir durumda aktive etme yeteneğini gösterdi. Ko-kültürlerin qPCR ölçümü, GAPDH'yi kalibratör olarak kullanan tüm ko-kültürlerde interferon gama ekspresyonunda% 30'dan fazla artış ve Ki67 ekspresyonunda% 5'ten fazla artış göstermiştir.RV darbeli MoDC lenfosit ko-kültüründe, spesifik olmayan tedavi grubuna kıyasla anlamlı derecede daha yüksek salgılanan interferon gama konsantrasyonu gözlendi. Katmanlama adımını çok yavaş ve dikkatli bir şekilde gerçekleştirin, kanın lenfosit izolasyon ortamının üzerine serilmesini sağlayın. Diğer katmanlardan çok fazla malzeme toplamadan tüm PBMC'leri toplamak için ekstra dikkatli olun.Flow sitometri, ELISA ve kantitatif PCR gibi diğer yöntemler, diğerlerinin yanı sıra, immün belirteçlerin aktivasyonunu değerlendirmek için bu işlemden sonra uygulanabilir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Fare Akciğer Dendritik Hücrelerinin İzolasyonu

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells

Melanom ve Skuamöz Kanser Kök Hücreleri Kullanılarak Yeni Bir Dendritik Hücre aşısının Üretilmesi

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H ...

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â² in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Aktivasyon ve İnsan monosit türevli dendritik hücreler, IL-1β kullanarak NLRP3 Inflammasome Aktivitenin Ölçümü

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Makrofaj koloni stimüle edici faktör farklılaştırılmış insan monosit türevli makrofajlar Kültür

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

Görüntüleme Sitometrisi ile İnsan Monosit türetilmiş dendritik hücrelerle Karakterizasyonu: İki Monosit İzolasyon Protokoller Arasında Bir Karşılaştırma

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Tüm kan İnsan monosit türevli dendritik hücrelerin oluşumu

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

Geliştirme ve doğrulama vericiyi bir tek molekül dijital enzim bağlı Immunosorbent Assay insan Interferon-α için dizi

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

siRNA Electroporation to Modulate Autophagy in Herpes Simplex Virus Type 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells

Herpes Simpleks Virüs Tip 1-Enfekte Monosit Türetilmiş Dendritik Hücrelerde Otofaji Modüle siRNA Elektroporasyon

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) induces autophagy in both, immature dendritic cells (iDCs) as well as mature dendritic cells (mDCs), whereas ...

In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Diferansiye İnsan Monosit türevi Makrofajlarda Hücre Dışı Tuzak Salınımının İn Vitro Stimülasyon ve Görselleştirilmesi

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic ...

Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages

İnsan Monosit Kaynaklı Makrofajlarda İnflamatuar Kaspazların İndüklenen Yakınlığının Görselleştirilmesi

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct ...