Génération et culture d’organoïdes dérivés de patients atteints d’un cancer de l’ovaire séreux de haut grade

Les modèles organoïdes de conduite de patients représentent génétiquement et fonctionnellement leurs tumeurs parentes et sont donc des modèles fiables pour l’étude de nouvelles thérapies et de processus biologiques complexes dans le cancer de l’ovaire. En récapitulant l’hétérogénéité clonale, le microenvironnement tumoral et les interactions in vitro de cellule à cellule, ces modèles surmontent les limites des lignées cellulaires cancéreuses et des xénogreffes dérivées de patients. Les organoïdes dérivés de patients offrent des capacités d’expansion et de stockage à long terme et imitent la physiologie tumorale.

En conséquence, ils sont des modèles idéaux pour l’étude de nouveaux traitements et biomarqueurs prédictifs. Commencez la récolte des organoïdes en plaçant les échantillons tumoraux dans une boîte de culture tissulaire de 10 centimètres et en hachant le tissu pour créer un mélange homogène à l’aide d’un scalpel jetable. Placer le mélange tissulaire homogène dans un tube de dissociation à l’aide d’une pince.

Pour chaque millilitre à deux millilitres de tissu homogénéisé, ajoutez sept à huit millilitres de solution de collagénase de type deux d’un milligramme par millilitre dans un milieu de base organoïde et un millilitre de solution de DNase One. Vortex la solution à 458 G.Liquéfier le tissu pendant qu’il est dans la solution de collagénase à l’aide de la machine de dissociation. Exécutez le programme 37 C underscore H underscore TDK trois une heure jusqu’à ce qu’il s’agisse d’une suspension à une seule cellule.

Une fois cela fait, transférer le mélange homogénéisé dans un nouveau tube conique de 50 millilitres. Ajouter 20 à 40 millilitres de milieu de base organoïde et vortex la solution à 458 G.Puis filtrer la solution à travers une crépine cellulaire de 100 micromètres dans un tube conique de 50 millilitres nouvellement étiqueté. Ensuite, centrifuger le mélange filtré à 1 650 g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et aspirer le surnageant à l’aide d’une pipette de pâturage en verre.

Préparez 100 microgrammes par millilitre de Dnase One et remettez les cellules en suspension dans un millilitre de solution de Dnase One en ajoutant goutte à goutte DNase One solution. Après 15 minutes d’incubation à température ambiante, ajoutez 25 millilitres de milieu de base organoïde aux cellules et inversez pour mélanger. Ensuite, centrifugez les cellules à 1 650 g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et aspirez soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette de pâturage en verre.

Remettez en suspension la pastille cellulaire nouvellement formée dans cinq millilitres de globules rouges préchauffés ou de tampon de lyse des globules rouges. Vortex les solutions dans chaque tube conique à 458 G et incuber pendant cinq minutes. Encore une fois, centrifuger la pastille en suspension dans un tampon de lyse de globule rouge et aspirer le surnageant à l’aide d’une pipette de pâturage en verre.

Lavez la pastille avec 10 millilitres de PBS et faites tourbillonner les cellules avant la centrifugation des cellules. Pour une pastille de grande cellule, aspirez le PBS et ajoutez un millilitre du milieu de base organoïde sur le dessus de la pastille. Après avoir vortex la solution, transférer 300 à 400 microlitres de la suspension cellulaire dans un tube microcentrifugé.

Après cinq minutes de centrifugation, aspirer le surnageant et le remettre en suspension dans un extrait de membrane basale, ou BME, et un milieu de base organoïde à l’aide de pointes froides. Plaquer la solution cellulaire remise en suspension dans une plaque à six puits dans des aliquotes de 40 microlitres. Plaquer jusqu’à cinq aliquotes par puits.

Placez immédiatement la plaque de puits dans l’incubateur pendant 20 minutes et, après l’incubation, ajoutez doucement deux millilitres du milieu organoïde complet dans chaque puits. Ajouter un millilitre de milieu de base organoïde à chaque puits et pipeter le média de haut en bas directement sur les languettes organoïdes pour la dissociation. Recueillir tout le milieu contenant les granulés remis en suspension dans un tube conique de 15 millilitres.

Ensuite, centrifuger le tube conique de 15 millilitres contenant le mélange pendant cinq minutes avant d’aspirer le surnageant. Ajouter un millilitre d’enzyme recombinante libre d’origine animale à la pastille cellulaire. Mélanger par vortex et transférer la suspension dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre.

Après 15 minutes d’incubation dans un bain-marie de 37 degrés Celsius et cinq minutes de centrifugation, aspirez le surnageant. Remettez la pastille en suspension dans un milieu de base BME et organoïde et plaquez la solution cellulaire remise en suspension dans une plaque à six puits dans des aliquotes de 40 microlitres. Plaquer jusqu’à cinq aliquotes par puits.

Après 20 minutes d’incubation, ajoutez doucement deux millilitres du milieu organoïde complet dans chaque puits. Remettez en suspension la pastille de cellule organoïde de passage dans 0,5 à un millilitre de milieu de congélation de culture cellulaire de récupération et transférez un millilitre dans chaque flacon cryogénique avant de les transférer à moins 80 degrés et réservoir d’azote liquide pour un stockage à long terme. Décongeler les organoïdes en transférant les flacons cryogéniques stockés dans de l’azote liquide au bain-marie de 37 degrés Celsius.

Une fois décongelés, transférer les organoïdes dans un tube conique de 15 millilitres et les centrifuger avant d’aspirer le surnageant. Ensuite, ajoutez un millilitre de PBS à la pastille et transférez la pastille remise en suspension dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre Après centrifugation à 1 650 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius, aspirez soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette de pâturage en verre. Resuspendre la pastille dans un milieu de base BME et organoïde et plaquer les cellules en suspension sur une plaque à six puits dans des aliquotes de 40 microlitres.

Placez jusqu’à cinq aliquotes par puits. Placez immédiatement la plaque dans l’incubateur pendant 20 minutes avant d’ajouter deux millilitres de milieu organoïde complet aux puits. Les organoïdes ont été établis en 10 jours, après quoi ils ont démontré des organoïdes discrets en culture.

Les cultures organoïdes dérivées de patients ont été évaluées en les incorporant dans de l’agarose et en les évaluant avec une coloration à l’hématoxyline et à l’éosine. Il est important de tenir compte des défis liés à la collaboration avec BME. La remise en suspension de la pastille cellulaire et du BME doit être effectuée sur de la glace en veillant à ce qu’aucune bulle ne se forme au cours du processus.

Cette technique permet d’approfondir les recherches sur l’impact de la chimiothérapie sur la génération et le développement des organoïdes en raison des problèmes rencontrés par les patients ayant subi une chimiothérapie néoadjuvante.