Name: visualizing dna damage repair proteins in patient-derived ovarian cancer organoids via immunofluorescence assays
Uploaded: 2023-02-24T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays at JoVE.com

אנו אסירי תודה על הדרכתו של פאבל לובצ'בסקי, PhD בהקמת פרוטוקול זה. ברצוננו גם להודות לבית הספר לרפואה של אוניברסיטת וושינגטון במחלקה למיילדות וגינקולוגיה בסנט לואיס ולמחלקה לאונקולוגיה גינקולוגית, לתוכנית מלגות הדיקן של אוניברסיטת וושינגטון, לקרן קבוצת אונקולוגיה גינקולוגית ולתוכנית לפיתוח מדעני פוריות על תמיכתם בפרויקט זה.

רקמת הגידול ומיימת התקבלו לאחר קבלת הסכמת המטופל כחלק ממאגר ביולוגי אונקולוגי אונקולוגי שאושר על ידי אוניברסיטת וושינגטון בסנט לואיס ועדת הביקורת המוסדית (IRB). המטופלות נכללו אם היה להן סרטן שחלות סרוסי בדרגה גבוהה בשלב מתקדם (HGSOC). כל ההליכים בוצעו בטמפרטורת החדר על הספסל, אלא אם כן צוין א?...

<ol>
	<li>Lheureux, S., Gourley, C., Vergote, I., Oza, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+ovarian+cancer.">Epithelial ovarian cancer.</a> Lancet Oncology. 393 (10177), 1240-1253 (2019).</li><li>Tew, W. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP+inhibitors+in+the+management+of+ovarian+cancer:+ASCO+guideline.">PARP inhibitors in the management of ovarian cancer: ASCO guideline.</a> Journal of Clinical Oncology. 38 (30), 3468-3493 (2020).</li><li>Tomasova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+repair+and+ovarian+carcinogenesis:+impact+on+risk,+prognosis+and+therapy+outcome.">DNA repair and ovarian carcinogenesis: impact on risk, prognosis and therapy outcome.</a> Cancers. 12 (7), 1713 (2020).</li><li>Mukhopadhyay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+functional+assay+for+homologous+recombination+status+in+primary+cultures+of+epithelial+ovarian+tumor+and+correlation+with+sensitivity+to+poly(ADP-Ribose)+polymerase+inhibitors.">Development of a functional assay for homologous recombination status in primary cultures of epithelial ovarian tumor and correlation with sensitivity to poly(ADP-Ribose) polymerase inhibitors.</a> Clinical Cancer Research. 16 (8), 2344-2351 (2010).</li><li>Graeser, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+marker+of+homologous+recombination+predicts+pathologic+complete+response+to+neoadjuvant+chemotherapy+in+primary+breast+cancer.">A marker of homologous recombination predicts pathologic complete response to neoadjuvant chemotherapy in primary breast cancer.</a> Clinical Cancer Research. 16 (24), 6159-6168 (2010).</li><li>Hill, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+DNA+repair+inhibitor+response+in+short-term+patient-derived+ovarian+cancer+organoids.">Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids.</a> Cancer Discovery. 8 (11), 1404-1421 (2018).</li><li>Naipal, K. A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+ex+vivo+assay+to+select+homologous+recombination-deficient+breast+tumors+for+PARP+inhibitor+treatment.">Functional ex vivo assay to select homologous recombination-deficient breast tumors for PARP inhibitor treatment.</a> Clinical Cancer Research. 20 (18), 4816-4826 (2014).</li><li>Tumiati, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+homologous+recombination+assay+predicts+primary+chemotherapy+response+and+long-term+survival+in+ovarian+cancer+patients.">A functional homologous recombination assay predicts primary chemotherapy response and long-term survival in ovarian cancer patients.</a> Clinical Cancer Research. 24 (18), 4482-4493 (2018).</li><li>Mukhopadhyay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinicopathological+features+of+homologous+recombination-deficient+epithelial+ovarian+cancers:+sensitivity+to+PARP+inhibitors,+platinum,+and+survival.">Clinicopathological features of homologous recombination-deficient epithelial ovarian cancers: sensitivity to PARP inhibitors, platinum, and survival.</a> Cancer Research. 72 (22), 5675-5682 (2012).</li><li>Johnson, S. W., Laub, P. B., Beesley, J. S., Ozols, R. F., Hamilton, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+platinum-DNA+damage+tolerance+is+associated+with+cisplatin+resistance+and+cross-resistance+to+various+chemotherapeutic+agents+in+unrelated+human+ovarian+cancer+cell+lines.">Increased platinum-DNA damage tolerance is associated with cisplatin resistance and cross-resistance to various chemotherapeutic agents in unrelated human ovarian cancer cell lines.</a> Cancer Research. 57 (5), 850-856 (1997).</li><li>Stefanou, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+DNA+damage+response+pathways+may+predict+the+outcome+of+platinum+chemotherapy+in+ovarian+cancer.">Aberrant DNA damage response pathways may predict the outcome of platinum chemotherapy in ovarian cancer.</a> PLoS One. 10 (2), 0117654 (2015).</li><li>Helleday, T., Petermann, E., Lundin, C., Hodgson, B., Sharma, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+repair+pathways+as+targets+for+cancer+therapy.">DNA repair pathways as targets for cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 8 (3), 193-204 (2008).</li><li>Ivashkevich, A., Redon, C. E., Nakamura, A. J., Martin, R. F., Martin, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+&#947;-H2AX+assay+to+monitor+DNA+damage+and+repair+in+translational+cancer+research.">Use of the &#947;-H2AX assay to monitor DNA damage and repair in translational cancer research.</a> Cancer Letters. 327 (1-2), 123-133 (2012).</li><li>Fuh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologous+recombination+deficiency+real-time+clinical+assays,+ready+or+not.">Homologous recombination deficiency real-time clinical assays, ready or not.</a> Gynecologic Oncology. 159 (3), 877-886 (2020).</li><li>Cong, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+gaps+are+a+key+determinant+of+PARP+inhibitor+synthetic+lethality+with+BRCA+deficiency.">Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency.</a> Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).</li><li>Lee, E. K., Matulonis, U. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP+inhibitor+resistance+mechanisms+and+implications+for+post-progression+combination+therapies.">PARP inhibitor resistance mechanisms and implications for post-progression combination therapies.</a> Cancers. 12 (8), 2054 (2020).</li><li>Panzarino, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+gaps+underlie+BRCA+deficiency+and+therapy+response.">Replication gaps underlie BRCA deficiency and therapy response.</a> Cancer Research. 81 (5), 1388-1397 (2021).</li><li>Yee, C., Dickson, K. A., Muntasir, M. N., Ma, Y., Marsh, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+modelling+of+ovarian+cancer:+from+cell+lines+to+organoids+for+discovery+and+personalized+medicine.">Three-dimensional modelling of ovarian cancer: from cell lines to organoids for discovery and personalized medicine.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 836984 (2022).</li><li>Regan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+staining+of+colorectal+cancer+patient-derived+organoids.">Immunofluorescence staining of colorectal cancer patient-derived organoids.</a> Methods Cell Biology. 171, 163-171 (2022).</li><li>Graham, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+culturing+of+high-grade+serous+ovarian+cancer+patient+derived+organoids.">Generation and culturing of high-grade serous ovarian cancer patient derived organoids.</a> Journal of Visualized Experiments. (191), (2023).</li><li>Jakl, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+JCountPro+software+for+efficient+assessment+of+ionizing+radiation-induced+foci+in+human+lymphocytes.">Validation of JCountPro software for efficient assessment of ionizing radiation-induced foci in human lymphocytes.</a> International Journal of Radiation Biology. 92 (12), 766-773 (2016).</li><li>Mullen, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAS6/AXL+inhibition+enhances+ovarian+cancer+sensitivity+to+chemotherapy+and+PARP+inhibition+through+increased+DNA+damage+and+enhanced+replication+stress.">GAS6/AXL inhibition enhances ovarian cancer sensitivity to chemotherapy and PARP inhibition through increased DNA damage and enhanced replication stress.</a> Molecular Cancer Research. 20 (2), 265-279 (2022).</li><li>van Ineveld, R. L., Ariese, H. C. R., Wehrens, E. J., Dekkers, J. F., Rios, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+resolution+three-dimensional+imaging+of+intact+organoids.">Single-cell resolution three-dimensional imaging of intact organoids.</a> Journal of Visualized Experiments. (160), e60709 (2020).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids.">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).</li><li>O'Rourke, K. P., Dow, L. E., Lowe, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescent+staining+of+mouse+intestinal+stem+cells.">Immunofluorescent staining of mouse intestinal stem cells.</a> Bio Protocols. 6 (4), 1732 (2016).</li><li>Nwani, N. G., Sima, L. E., Nieves-Neira, W., Matei, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+microenvironment+in+high+grade+serous+ovarian+cancer.">Targeting the microenvironment in high grade serous ovarian cancer.</a> Cancers. 10 (8), 266 (2018).</li><li>Ghoneum, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+clinical+value+of+tumor+microenvironment+in+platinum-resistant+ovarian+cancer.">Exploring the clinical value of tumor microenvironment in platinum-resistant ovarian cancer.</a> Seminars in Cancer Biology. 77, 83-98 (2021).</li><li>Yang, Y., Yang, Y., Yang, J., Zhao, X., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+microenvironment+in+ovarian+cancer:+function+and+therapeutic+strategy.">Tumor microenvironment in ovarian cancer: function and therapeutic strategy.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 758 (2020).</li><li>van de Wetering, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+derivation+of+a+living+organoid+biobank+of+colorectal+cancer+patients.">Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients.</a> Cell. 161 (4), 933-945 (2015).</li><li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+primary+liver+cancer-derived+organoid+cultures+for+disease+modeling+and+drug+screening.">Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening.</a> Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).</li><li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li><li>Cybulla, E., Vindigni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leveraging+the+replication+stress+response+to+optimize+cancer+therapy.">Leveraging the replication stress response to optimize cancer therapy.</a> Nature Reviews. , (2022).</li></ol>

תגובת הנזק לדנ"א ממלאת תפקיד אינטגרלי הן בהתפתחות סרטן השחלות והן בעמידות לכימותרפיה. לכן, הבנה מעמיקה של מנגנוני תיקון DNA היא הכרחית. כאן מוצגת מתודולוגיה לחקר חלבונים לתיקון נזקי דנ"א באורגנואידים תלת-ממדיים שלמים. פרוטוקול אמין הניתן לשחזור פותח תוך שימוש בנוגדנים סימן היכר להערכת נזק ?...

סרטן השחלות הוא סיבת המוות המובילה עקב ממאירות גינקולוגית. רוב החולים מטופלים בתרופות הפוגעות בדנ"א כגון קרבופלטין, ואלה עם גידולים הומולוגיים עם תיקון רקומבינציה הומולוגית (HRR) יכולים לקבל מעכבי פולי (ADP-ריבוז) פולימראז (PARP) 1,2. עם זאת, רוב החולים מפתחים עמידות לטיפולים אלה ומתים תוך 5 שנים מהאבחון. חוסר ויסות של תגובת הנזק לדנ"א (DDR) נקשר להתפתחות סרטן השחלות ולכימותרפיה ולעמידות למעכבי PARP3. לפיכך, מחקר של DDR הוא הכרחי להבנת הפתופיזיולוגיה של סרטן השחלות, סמנים ביולוגיים פוטנציאליים, וטיפולים ממוקדים חדשניים.
השיטות הנוכחיות להערכת DDR משתמשות באימונופלואורסנציה (IF), מכיוון שהדבר מאפשר זיהוי מדויק ולוקליזציה של חלבונים הפוגעים בדנ"א ואנלוגים לנוקלאוטידים. ברגע שיש שבר דו-גדילי (DSB) בדנ"א, חלבון ההיסטון H2AX עובר זרחן מהיר, ויוצר מוקד שבו חלבונים לתיקון נזקי דנ"א מתכנסים4. זרחן זה ניתן לזהות בקלות באמצעות IF; למעשה, בדיקת ɣ-H2AX שימשה בדרך כלל כדי לאשר את האינדוקציה של DSB 5,6,7,8,9. נזק מוגבר לדנ"א נקשר לרגישות פלטינה וליעילות של חומרים המזיקים לדנ"א 10,11,12, ו-ɣ-H2AX הוצע כסמן ביולוגי הקשור לתגובה כימותרפית בטיפולים אחרים בסרטן 13. ב-DSB, תא המיומן ב-HRR מבצע סדרה של אירועים שמובילים לכך ש-BRCA1 ו-BRCA2 מגייסים את RAD51 כדי להחליף את חלבון השכפול A (RPA) ולהיקשר לדנ"א. תיקון HRR משתמש בתבנית DNA כדי לתקן נאמנה את DSB. עם זאת, כאשר גידולים חסרים HRR, הם מסתמכים על מסלולי תיקון חלופיים כגון חיבור קצה לא הומולוגי (NHEJ). NHEJ ידוע כנוטה לטעויות ויוצר עומס מוטציות גבוה על התא, המשתמש ב- 53BP1 כמווסת חיובי14. חלבונים אלה הפוגעים בדנ"א יכולים להיות מזוהים במדויק כמוקדים באמצעות IF. בנוסף לצביעה של חלבונים, ניתן להשתמש ב-IF כדי לחקור הגנה מפני מזלג והיווצרות פער DNA חד-גדילי. היכולת לקבל מזלגות יציבים נמצאה בקורלציה עם תגובת פלטינה, ולאחרונה, מבחני פער הראו את הפוטנציאל לחזות את התגובה למעכבי PARP 6,15,16,17. לכן, צביעה עבור אנלוגים נוקלאוטידים לאחר הקדמה לתוך הגנום היא דרך נוספת ללמוד את DDR.
עד כה, הערכת ה- DDR בסרטן השחלות הוגבלה במידה רבה לקווי תאים דו-ממדיים הומוגניים שאינם משחזרים את ההטרוגניות השבט, המיקרו-סביבה או הארכיטקטורה של גידולי in vivo 18,19. מחקרים אחרונים מצביעים על כך שאורגנואידים עדיפים על קווי תאים דו-ממדיים בחקר תהליכים ביולוגיים מורכבים כגון מנגנוני DDR6. המתודולוגיה הנוכחית מעריכה RAD51, ɣ-H2AX, 53BP1, RPA וגמינין במחשבי PDO. שיטות אלה מעריכות את האורגנואיד השלם ומאפשרות לחקור מנגנוני DDR בסביבה דומה יותר למיקרו-סביבה של הגידול in vivo. יחד עם מיקרוסקופ קונפוקלי וספירת מוקדים אוטומטית, מתודולוגיה זו יכולה לסייע בהבנת מסלול DDR בסרטן השחלות והתאמה אישית של תוכניות הטיפול למטופלות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x phosphate buffered saline with calcium and magnesium (PBS++)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>14-040-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x phosphate buffered saline without calcium and magnesium (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>ICN1860454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ant-53BP1 Antibody&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>612522</td>
			<td>diluted to 1:500 in staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ant-Geminin Antibody&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab104306</td>
			<td>diluted to 1:200 in staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Geminin Antibody&#160;</td>
			<td>ProteinTech</td>
			<td>10802-1-AP</td>
			<td>diluted to 1:400 in staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-RAD51 Antibody&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab133534</td>
			<td>diluted to 1:1000 in staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-yH2AX Antibody&#160;</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>05-636</td>
			<td>diluted to 1:500 in staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ant-phospho-RPA32 (S4/S8) Antibody</td>
			<td>Bethyl Laboratories&#160;</td>
			<td>A300-245A-M</td>
			<td>diluted to 1:200 in staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>BP1605 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge; Sorvall St 16R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>75004240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope, Leica SP5 confocal system DMI4000</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>389584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tubes, 15 mL</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess 3 FL Automated Cell Counter (Cell Counting Machine)&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>AMQAF2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slip</td>
			<td>LA Colors</td>
			<td></td>
			<td>Any clear nail polish will suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex&#160;RGF Basement Membrane Extract, Type 2</td>
			<td>&#160;R&#38;D Systems&#160;</td>
			<td>3533-010-02</td>
			<td>Could probably use Matrigel or other BME Matrix&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>&#160;R37606</td>
			<td>NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent, Diluted in 1x PBS&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>NC0756056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JCountPro</td>
			<td>JCountPro</td>
			<td></td>
			<td>For access to the software, Email: jcountpro@gmail.com&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>07-000-243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail Polish&#160;</td>
			<td>StatLab</td>
			<td>SL102450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafomraldehyde (PFA), 2%&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences&#160;</td>
			<td>157-4</td>
			<td>Dilute to 4% PFA in PBS++ to obtain 2% PFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permeabilization Buffer</td>
			<td>Made in Lab</td>
			<td></td>
			<td>0.2% X-100 Triton in PBS++&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips&#160;</td>
			<td>Rainin&#160;</td>
			<td>17014967</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>&#160;P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining Buffer&#160;</td>
			<td>Made in Lab</td>
			<td></td>
			<td>0.5% BSA, 0.15% Glycine, 0.1% X-100 Triton in PBS++&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>12-565-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Alderich&#160;</td>
			<td>11332481001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12604013</td>
			<td>animal origin-free, recombinant enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-RAD 320 Biological Irradiator&#160;</td>
			<td>Precision X-Ray Irradiation&#160;</td>
			<td>X-RAD320</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing dna damage repair proteins in patient-derived ovarian cancer organoids via immunofluorescence assays

Immunofluorescence היא אחת הטכניקות הנפוצות ביותר כדי לדמיין אנטיגנים המטרה עם רגישות גבוהה וספציפיות, המאפשר זיהוי מדויק לוקליזציה של חלבונים, גליקנים, מולקולות קטנות. בעוד טכניקה זו מבוססת היטב בתרבית תאים דו-ממדית (2D), פחות ידוע על השימוש בה במודלים תלת-ממדיים (3D) של תאים. אורגנואידים של סרטן השחלות הם מודלים תלת-ממדיים של גידולים המשחזרים הטרוגניות של תאי גידול, מיקרו-סביבה של הגידול ואינטראקציות תא-תא ומטריצת תאים. לפיכך, הם עדיפים על קווי תאים להערכת רגישות לתרופות וסמנים ביולוגיים פונקציונליים. לכן, היכולת לנצל אימונופלואורסנציה על אורגנואידים ראשוניים של סרטן השחלות מועילה ביותר בהבנת הביולוגיה של סרטן זה. המחקר הנוכחי מתאר את הטכניקה של אימונופלואורסנציה לזיהוי חלבונים לתיקון נזקי DNA באורגנואידים של סרטן השחלות (PDOs) שמקורם בחולה סרוס ברמה גבוהה. לאחר חשיפת PDOs לקרינה מייננת, immunofluorescence מבוצעת על אורגנואידים שלמים כדי להעריך חלבונים גרעיניים כמוקדים. התמונות נאספות באמצעות הדמיית z-stack במיקרוסקופ קונפוקלי ומנותחות באמצעות תוכנה אוטומטית לספירת מוקדים. השיטות המתוארות מאפשרות ניתוח של גיוס זמני ומיוחד של חלבונים לתיקון נזקי DNA וקולוקליזציה של חלבונים אלה עם סמנים של מחזור התא.

הפרוטוקול המוצג יכול להכתים, לדמיין ולכמת בהצלחה חלבונים לתיקון נזקי DNA גרעיניים באורגנואידים. טכניקה זו שימשה כדי להכתים ולהעריך PDOs הן לפני ואחרי הקרנה. PDOs נחשפו לקרינה של 10 Gy והוערכו עבור הסמנים הביולוגיים הבאים: ɣ-H2AX (איור 1), סמן של נזק לדנ"א; RAD51 (איור 2), סמ...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays at JoVE.com

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטות להערכת חלבונים לתיקון נזקי DNA באורגנואידים של סרטן השחלות שמקורם במטופלות. להלן שיטות ציפוי וצביעה מקיפות, כמו גם הליכי כימות מפורטים ואובייקטיביים.

הדמיה של חלבונים לתיקון נזקי DNA באורגנואידים של סרטן השחלות שמקורם במטופל באמצעות בדיקות אימונופלואורסנציה

Immunofluorescence is one of the most widely used techniques to visualize target antigens with high sensitivity and specificity, allowing for the accurate ...

חקר תגובת הנזק לדנ"א הכרחי להבנת הפתופיזיולוגיה של סמנים ביולוגיים פוטנציאליים לסרטן השחלות בטיפול ממוקד חדש. טכניקה זו מאפשרת לדגימה להישאר שלמה ומאפשרת בדיקה של אנטיגנים במיקום הפעולה שלהם. פרוטוקול זה הוא מהיר וניתן להתאים אותו לכל אנטיגן מקובל immunofluorescence.שיטה זו נותנת תובנה לגבי סרטן השחלות ותהליכי תיקון נזקי DNA המעורבים בעמידות לכימותרפיה ומעכבי PARP. שיטות אלה יכולות להיות מיושמות בתחומי מחקר אחרים הכוללים שימוש בתרבויות תלת ממדיות ואורגנואידים. כדי להתחיל, שאפו את המדיה מהאורגנואידים המוקרנים והמוגרים מבלי להפריע למטריצה התלת-ממדית.לאחר מכן לשטוף עם 300 מיקרוליטר של PBS. תקן את האורגנואידים ב 300 מיקרוליטר של 2% paraformaldehyde במשך 10 דקות. לאחר התיקון, שטפו את האורגנואידים עם 300 מיקרוליטר של חיץ מכתים והניחו אותם על שייקר למשך חמש דקות.לאחר מכן לחדור את האורגנואיד על ידי הוספה עדינה של 300 מיקרוליטר של מאגר חדירה. לאחר 20 דקות של דגירה, להסיר את החיץ ולשטוף עם 300 מיקרוליטר של חיץ צביעה. הניחו את האורגנואידים על שייקר למשך חמש דקות.לאחר מכן, הוסף 300 מיקרוליטר של חיץ צביעה כדי לחסום את שלב החדירה. מניחים על השייקר למשך 30 דקות ושאפו את חיץ הכתמים בעזרת פיפטה. לאחר מכן להוסיף 300 מיקרוליטר של נוגדנים ראשוניים מדוללים בחיץ צביעה.דוגרים בארבע מעלות צלזיוס למשך 16 שעות. לאחר הדגירה, הסר את תמיסת הנוגדנים העיקרית. בצעו שלוש שטיפות עם 300 מיקרוליטר של חיץ כתמים במשך חמש דקות כל אחת על השייקר.מוסיפים 300 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים משנית מדוללת בחיץ צביעה, ודגרים במשך שעה בחושך. לאחר שעה, לשאוף את פתרון נוגדנים משני ולהוסיף 300 מיקרוליטר של DAPI מדולל. מניחים על השייקר למשך חמש דקות.בצעו שלוש שטיפות עם 300 מיקרוליטר של חיץ כתמים במשך חמש דקות כל אחת על השייקר. הסר את חיץ הצביעה ונתק את התאים באמצעות ערכת ההסרה המצורפת לשקופיות התא. חתכו את קצה קצה פיפטה P200 והשתמשו בו כדי להוסיף אמצעי הרכבה שיכסה כל באר המכילה לשונית אורגנואידים.הניחו את החלקת הכיסוי מעל הדגימה תוך הימנעות מבועות. יש לקחת לק שקוף ולצבוע אותו על צידי זכוכית הכיסוי כדי לאטום את המגלשה. תן לו להתקשות במשך שעה ולאחר מכן מניחים אותו על 20 מעלות צלזיוס.קבל תמונות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי באמצעות מטרה 63X עם שמן טבילה. באמצעות פרוטוקול זה, אורגנואידים של סרטן השחלות שמקורם במטופלות הוכתמו עבור חלבונים לתיקון נזקי DNA לפני ואחרי הקרנה, והוערכו עבור סמנים ביולוגיים כגון גמא H2AX, סמן של נזק לדנ"א, ו- RAD51, סמן לתיקון רקומבינציה הומולוגית. RPA, סמן של לחץ שכפול, 53BP1, סמן של חיבור לא הומולוגי, וג'מינין, סמן מחזור תא פאזה GS2 הוערכו גם הם באמצעות טכניקה זו.כרטיסיות BME נוטות לדה-פולימריזציה, ולכן תשומת לב רבה לאחר תיקון ושאיפה היא חיונית. ניתוח האנטיגנים כדי לקבוע את נזקי האורגנואידים ואת היכולת להרכיב תגובת נזק לדנ"א יכול לסייע בהערכת עמידות כימותרפית.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

הערכת במבחנה נזק לדנ א שימוש Assay שביט

DNA damage is a common phenomenon for each cell during its lifespan, and is defined as an alteration of the chemical structure of genomic DNA. Cancer ...

Characterizing DNA Repair Processes at Transient and Long-lasting Double-strand DNA Breaks by Immunofluorescence Microscopy

אפיון תהליכי תיקון DNA-ארעי ומעברי DNA ארוך כפול-strand על ידי מיקרוסקופ Immunofluorescence

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair ...

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

בדיקת טיפולים ייעודיים בסרטן באמצעות ניתוח שינוי DNA מבנית והמטופל נגזר Xenografts

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

Immunofluorescence הדמיה של נזק לדנ א ותיקון Foci בתאי סרטן המעי הגס האנושי

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

תפוקה גבוהה במבחנה במבחנה באמצעות organoids גידול נגזר המטופל

Patient-derived tumor organoids (PDOs) are expected to be a preclinical cancer model with better reproducibility of disease than traditional cell culture ...

Profiling Sensitivity to Targeted Therapies in EGFR-Mutant NSCLC Patient-Derived Organoids

רגישות ליצירת פרופילים לטיפולים ממוקדים באורגנוידים שמקורם ב-EGFR-Mutant NSCLC

Novel 3D cancer organoid cultures derived from clinical patient specimens represent an important model system to evaluate intratumor heterogeneity and ...

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

יצירה וטיפוח של אורגנואידים שמקורם בסרטן השחלות הסרוסי ברמה גבוהה

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...

Quantifying Replication Stress in Ovarian Cancer Cells Using Single-Stranded DNA Immunofluorescence

כימות עקה שכפול בתאי סרטן השחלות באמצעות אימונופלואורסנציה של DNA חד-גדילי

Replication stress is a hallmark of several ovarian cancers. Replication stress can emerge from multiple sources, including double-strand breaks, ...

Establishment and Culture of Patient-Derived Breast Organoids

הקמה ותרבות של אורגנואידי שד שמקורם במטופל

Breast cancer is a complex disease that has been classified into several different histological and molecular subtypes. Patient-derived breast tumor ...

Ovarian Cancer Patient-Derived Organoid Models for Pre-Clinical Drug Testing

מודלים אורגנואידים שמקורם בחולות סרטן השחלות לבדיקת תרופות פרה-קליניות

Ovarian cancer is a fatal gynecologic cancer and the fifth leading cause of cancer death among women in the United States. Developing new drug treatments ...