Name: visualizing dna damage repair proteins in patient-derived ovarian cancer organoids via immunofluorescence assays
Uploaded: 2023-02-24T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays at JoVE.com

Estamos agradecidos por la orientación de Pavel Lobachevsky, PhD en el establecimiento de este protocolo. También nos gustaría reconocer a la Facultad de Medicina de la Universidad de Washington en el Departamento de Obstetricia y Ginecología de St. Louis y la División de Oncología Ginecológica, el Programa de Becarios del Decano de la Universidad de Washington, la Fundación del Grupo de Oncología Ginecológica y el Programa de Desarrollo de Científicos Reproductivos por su apoyo a este proyecto.

El tejido tumoral y la ascitis se obtuvieron después de obtener el consentimiento del paciente como parte de un biorepositorio de oncología ginecológica que fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional (IRB) de la Universidad de Washington en St. Louis. Las pacientes se incluyeron si tenían cáncer de ovario seroso de grado alto (HGSOC) en estadio avanzado. Todos los procedimientos se realizaron a temperatura ambiente en el banco a menos que se especifique lo contrario. Todos los reactivos se prepararon a tem...

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	<li>Lheureux, S., Gourley, C., Vergote, I., Oza, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+ovarian+cancer.">Epithelial ovarian cancer.</a> Lancet Oncology. 393 (10177), 1240-1253 (2019).</li><li>Tew, W. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP+inhibitors+in+the+management+of+ovarian+cancer:+ASCO+guideline.">PARP inhibitors in the management of ovarian cancer: ASCO guideline.</a> Journal of Clinical Oncology. 38 (30), 3468-3493 (2020).</li><li>Tomasova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+repair+and+ovarian+carcinogenesis:+impact+on+risk,+prognosis+and+therapy+outcome.">DNA repair and ovarian carcinogenesis: impact on risk, prognosis and therapy outcome.</a> Cancers. 12 (7), 1713 (2020).</li><li>Mukhopadhyay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+functional+assay+for+homologous+recombination+status+in+primary+cultures+of+epithelial+ovarian+tumor+and+correlation+with+sensitivity+to+poly(ADP-Ribose)+polymerase+inhibitors.">Development of a functional assay for homologous recombination status in primary cultures of epithelial ovarian tumor and correlation with sensitivity to poly(ADP-Ribose) polymerase inhibitors.</a> Clinical Cancer Research. 16 (8), 2344-2351 (2010).</li><li>Graeser, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+marker+of+homologous+recombination+predicts+pathologic+complete+response+to+neoadjuvant+chemotherapy+in+primary+breast+cancer.">A marker of homologous recombination predicts pathologic complete response to neoadjuvant chemotherapy in primary breast cancer.</a> Clinical Cancer Research. 16 (24), 6159-6168 (2010).</li><li>Hill, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+DNA+repair+inhibitor+response+in+short-term+patient-derived+ovarian+cancer+organoids.">Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids.</a> Cancer Discovery. 8 (11), 1404-1421 (2018).</li><li>Naipal, K. A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+ex+vivo+assay+to+select+homologous+recombination-deficient+breast+tumors+for+PARP+inhibitor+treatment.">Functional ex vivo assay to select homologous recombination-deficient breast tumors for PARP inhibitor treatment.</a> Clinical Cancer Research. 20 (18), 4816-4826 (2014).</li><li>Tumiati, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+homologous+recombination+assay+predicts+primary+chemotherapy+response+and+long-term+survival+in+ovarian+cancer+patients.">A functional homologous recombination assay predicts primary chemotherapy response and long-term survival in ovarian cancer patients.</a> Clinical Cancer Research. 24 (18), 4482-4493 (2018).</li><li>Mukhopadhyay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinicopathological+features+of+homologous+recombination-deficient+epithelial+ovarian+cancers:+sensitivity+to+PARP+inhibitors,+platinum,+and+survival.">Clinicopathological features of homologous recombination-deficient epithelial ovarian cancers: sensitivity to PARP inhibitors, platinum, and survival.</a> Cancer Research. 72 (22), 5675-5682 (2012).</li><li>Johnson, S. W., Laub, P. B., Beesley, J. S., Ozols, R. F., Hamilton, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+platinum-DNA+damage+tolerance+is+associated+with+cisplatin+resistance+and+cross-resistance+to+various+chemotherapeutic+agents+in+unrelated+human+ovarian+cancer+cell+lines.">Increased platinum-DNA damage tolerance is associated with cisplatin resistance and cross-resistance to various chemotherapeutic agents in unrelated human ovarian cancer cell lines.</a> Cancer Research. 57 (5), 850-856 (1997).</li><li>Stefanou, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+DNA+damage+response+pathways+may+predict+the+outcome+of+platinum+chemotherapy+in+ovarian+cancer.">Aberrant DNA damage response pathways may predict the outcome of platinum chemotherapy in ovarian cancer.</a> PLoS One. 10 (2), 0117654 (2015).</li><li>Helleday, T., Petermann, E., Lundin, C., Hodgson, B., Sharma, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+repair+pathways+as+targets+for+cancer+therapy.">DNA repair pathways as targets for cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 8 (3), 193-204 (2008).</li><li>Ivashkevich, A., Redon, C. E., Nakamura, A. J., Martin, R. F., Martin, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+&#947;-H2AX+assay+to+monitor+DNA+damage+and+repair+in+translational+cancer+research.">Use of the &#947;-H2AX assay to monitor DNA damage and repair in translational cancer research.</a> Cancer Letters. 327 (1-2), 123-133 (2012).</li><li>Fuh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologous+recombination+deficiency+real-time+clinical+assays,+ready+or+not.">Homologous recombination deficiency real-time clinical assays, ready or not.</a> Gynecologic Oncology. 159 (3), 877-886 (2020).</li><li>Cong, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+gaps+are+a+key+determinant+of+PARP+inhibitor+synthetic+lethality+with+BRCA+deficiency.">Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency.</a> Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).</li><li>Lee, E. K., Matulonis, U. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP+inhibitor+resistance+mechanisms+and+implications+for+post-progression+combination+therapies.">PARP inhibitor resistance mechanisms and implications for post-progression combination therapies.</a> Cancers. 12 (8), 2054 (2020).</li><li>Panzarino, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+gaps+underlie+BRCA+deficiency+and+therapy+response.">Replication gaps underlie BRCA deficiency and therapy response.</a> Cancer Research. 81 (5), 1388-1397 (2021).</li><li>Yee, C., Dickson, K. A., Muntasir, M. N., Ma, Y., Marsh, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+modelling+of+ovarian+cancer:+from+cell+lines+to+organoids+for+discovery+and+personalized+medicine.">Three-dimensional modelling of ovarian cancer: from cell lines to organoids for discovery and personalized medicine.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 836984 (2022).</li><li>Regan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+staining+of+colorectal+cancer+patient-derived+organoids.">Immunofluorescence staining of colorectal cancer patient-derived organoids.</a> Methods Cell Biology. 171, 163-171 (2022).</li><li>Graham, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+culturing+of+high-grade+serous+ovarian+cancer+patient+derived+organoids.">Generation and culturing of high-grade serous ovarian cancer patient derived organoids.</a> Journal of Visualized Experiments. (191), (2023).</li><li>Jakl, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+JCountPro+software+for+efficient+assessment+of+ionizing+radiation-induced+foci+in+human+lymphocytes.">Validation of JCountPro software for efficient assessment of ionizing radiation-induced foci in human lymphocytes.</a> International Journal of Radiation Biology. 92 (12), 766-773 (2016).</li><li>Mullen, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAS6/AXL+inhibition+enhances+ovarian+cancer+sensitivity+to+chemotherapy+and+PARP+inhibition+through+increased+DNA+damage+and+enhanced+replication+stress.">GAS6/AXL inhibition enhances ovarian cancer sensitivity to chemotherapy and PARP inhibition through increased DNA damage and enhanced replication stress.</a> Molecular Cancer Research. 20 (2), 265-279 (2022).</li><li>van Ineveld, R. L., Ariese, H. C. R., Wehrens, E. J., Dekkers, J. F., Rios, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+resolution+three-dimensional+imaging+of+intact+organoids.">Single-cell resolution three-dimensional imaging of intact organoids.</a> Journal of Visualized Experiments. (160), e60709 (2020).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids.">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).</li><li>O'Rourke, K. P., Dow, L. E., Lowe, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescent+staining+of+mouse+intestinal+stem+cells.">Immunofluorescent staining of mouse intestinal stem cells.</a> Bio Protocols. 6 (4), 1732 (2016).</li><li>Nwani, N. G., Sima, L. E., Nieves-Neira, W., Matei, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+microenvironment+in+high+grade+serous+ovarian+cancer.">Targeting the microenvironment in high grade serous ovarian cancer.</a> Cancers. 10 (8), 266 (2018).</li><li>Ghoneum, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+clinical+value+of+tumor+microenvironment+in+platinum-resistant+ovarian+cancer.">Exploring the clinical value of tumor microenvironment in platinum-resistant ovarian cancer.</a> Seminars in Cancer Biology. 77, 83-98 (2021).</li><li>Yang, Y., Yang, Y., Yang, J., Zhao, X., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+microenvironment+in+ovarian+cancer:+function+and+therapeutic+strategy.">Tumor microenvironment in ovarian cancer: function and therapeutic strategy.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 758 (2020).</li><li>van de Wetering, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+derivation+of+a+living+organoid+biobank+of+colorectal+cancer+patients.">Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients.</a> Cell. 161 (4), 933-945 (2015).</li><li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+primary+liver+cancer-derived+organoid+cultures+for+disease+modeling+and+drug+screening.">Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening.</a> Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).</li><li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li><li>Cybulla, E., Vindigni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leveraging+the+replication+stress+response+to+optimize+cancer+therapy.">Leveraging the replication stress response to optimize cancer therapy.</a> Nature Reviews. , (2022).</li></ol>

La respuesta al daño del ADN juega un papel integral tanto en el desarrollo del cáncer de ovario como en la resistencia a la quimioterapia. Por lo tanto, es imperativo una comprensión profunda de los mecanismos de reparación del ADN. Aquí, se presenta una metodología para estudiar las proteínas de reparación del daño del ADN en organoides 3D intactos. Se desarrolla un protocolo reproducible y confiable que utiliza anticuerpos distintivos para evaluar el daño del ADN, la recombinación homóloga, la unión final...

El cáncer de ovario es la principal causa de muerte por neoplasia maligna ginecológica. La mayoría de los pacientes son tratados con fármacos que dañan el ADN, como el carboplatino, y aquellos con tumores deficientes en reparación por recombinación homóloga (HRR) pueden recibir inhibidores de la poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) 1,2. Sin embargo, la mayoría de los pacientes desarrollan resistencia a estas terapias y mueren dentro de los 5 años posteriores al diagnóstico. La desregulación de la respuesta al daño del ADN (DDR) se ha asociado con el desarrollo de cáncer de ovario y resistencia tanto a la quimioterapia como a los inhibidores de PARP3. Por lo tanto, el estudio de la DDR es imprescindible para comprender la fisiopatología del cáncer de ovario, los posibles biomarcadores y las nuevas terapias dirigidas.
Los métodos actuales para evaluar la DDR utilizan inmunofluorescencia (IF), ya que esto permite la identificación y localización precisas de proteínas de daño al ADN y análogos de nucleótidos. Una vez que hay una ruptura de doble cadena (DSB) en el ADN, la proteína histona H2AX se fosforila rápidamente, formando un foco donde las proteínas de reparación del daño del ADN se congregan4. Esta fosforilación se puede identificar fácilmente utilizando IF; de hecho, el ensayo ɣ-H2AX se ha empleado comúnmente para confirmar la inducción de un DSB 5,6,7,8,9. El aumento del daño en el ADN se ha asociado con la sensibilidad al platino y la eficacia de los agentes dañinos del ADN 10,11,12, y ɣ-H2AX se ha propuesto como un biomarcador asociado con la respuesta a la quimioterapia en otros tratamientos contra el cáncer 13. Tras un DSB, una célula competente en HRR realiza una serie de eventos que conducen a BRCA1 y BRCA2 a reclutar RAD51 para reemplazar la proteína de replicación A (RPA) y unirse al ADN. HRR repair utiliza una plantilla de ADN para reparar fielmente el DSB. Sin embargo, cuando los tumores son deficientes en HRR, dependen de vías de reparación alternativas, como la unión de extremos no homólogos (NHEJ). Se sabe que NHEJ es propenso a errores y crea una alta carga mutacional en la célula, que utiliza 53BP1 como regulador positivo14. Todas estas proteínas de daño en el ADN se pueden identificar con precisión como focos utilizando IF. Además de la tinción de proteínas, el AI se puede usar para estudiar la protección de la horquilla y la formación de brechas de ADN monocatenario. La capacidad de tener horquillas estables se ha correlacionado con la respuesta al platino, y recientemente, los ensayos de brecha han demostrado el potencial para predecir la respuesta a los inhibidores de PARP 6,15,16,17. Por lo tanto, la tinción de los análogos de nucleótidos después de la introducción en el genoma es otra forma de estudiar la DDR.
Hasta la fecha, la evaluación de la DDR en el cáncer de ovario se ha limitado en gran medida a líneas celulares 2D homogéneas que no recapitulan la heterogeneidad clonal, el microambiente o la arquitectura de los tumores in vivo 18,19. Investigaciones recientes sugieren que los organoides son superiores a las líneas celulares 2D en el estudio de procesos biológicos complejos como los mecanismos DDR6. La presente metodología evalúa RAD51, ɣ-H2AX, 53BP1, RPA y geminina en DOP. Estos métodos evalúan el organoide intacto y permiten el estudio de los mecanismos DDR en un entorno más similar al microambiente tumoral in vivo. Junto con la microscopía confocal y el conteo automatizado de focos, esta metodología puede ayudar a comprender la vía DDR en el cáncer de ovario y personalizar los planes de tratamiento para las pacientes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x phosphate buffered saline with calcium and magnesium (PBS++)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>14-040-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x phosphate buffered saline without calcium and magnesium (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>ICN1860454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ant-53BP1 Antibody&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>612522</td>
			<td>diluted to 1:500 in staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ant-Geminin Antibody&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab104306</td>
			<td>diluted to 1:200 in staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Geminin Antibody&#160;</td>
			<td>ProteinTech</td>
			<td>10802-1-AP</td>
			<td>diluted to 1:400 in staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-RAD51 Antibody&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab133534</td>
			<td>diluted to 1:1000 in staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-yH2AX Antibody&#160;</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>05-636</td>
			<td>diluted to 1:500 in staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ant-phospho-RPA32 (S4/S8) Antibody</td>
			<td>Bethyl Laboratories&#160;</td>
			<td>A300-245A-M</td>
			<td>diluted to 1:200 in staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>BP1605 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge; Sorvall St 16R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>75004240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope, Leica SP5 confocal system DMI4000</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>389584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tubes, 15 mL</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess 3 FL Automated Cell Counter (Cell Counting Machine)&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>AMQAF2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slip</td>
			<td>LA Colors</td>
			<td></td>
			<td>Any clear nail polish will suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex&#160;RGF Basement Membrane Extract, Type 2</td>
			<td>&#160;R&#38;D Systems&#160;</td>
			<td>3533-010-02</td>
			<td>Could probably use Matrigel or other BME Matrix&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>&#160;R37606</td>
			<td>NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent, Diluted in 1x PBS&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>NC0756056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JCountPro</td>
			<td>JCountPro</td>
			<td></td>
			<td>For access to the software, Email: jcountpro@gmail.com&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>07-000-243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail Polish&#160;</td>
			<td>StatLab</td>
			<td>SL102450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafomraldehyde (PFA), 2%&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences&#160;</td>
			<td>157-4</td>
			<td>Dilute to 4% PFA in PBS++ to obtain 2% PFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permeabilization Buffer</td>
			<td>Made in Lab</td>
			<td></td>
			<td>0.2% X-100 Triton in PBS++&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips&#160;</td>
			<td>Rainin&#160;</td>
			<td>17014967</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>&#160;P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining Buffer&#160;</td>
			<td>Made in Lab</td>
			<td></td>
			<td>0.5% BSA, 0.15% Glycine, 0.1% X-100 Triton in PBS++&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>12-565-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Alderich&#160;</td>
			<td>11332481001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12604013</td>
			<td>animal origin-free, recombinant enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-RAD 320 Biological Irradiator&#160;</td>
			<td>Precision X-Ray Irradiation&#160;</td>
			<td>X-RAD320</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing dna damage repair proteins in patient-derived ovarian cancer organoids via immunofluorescence assays

La inmunofluorescencia es una de las técnicas más utilizadas para visualizar antígenos diana con alta sensibilidad y especificidad, lo que permite la identificación y localización precisa de proteínas, glicanos y moléculas pequeñas. Si bien esta técnica está bien establecida en el cultivo celular bidimensional (2D), se sabe menos sobre su uso en modelos celulares tridimensionales (3D). Los organoides del cáncer de ovario son modelos tumorales 3D que recapitulan la heterogeneidad clonal de las células tumorales, el microambiente tumoral y las interacciones célula-célula y célula-matriz. Por lo tanto, son superiores a las líneas celulares para la evaluación de la sensibilidad a los medicamentos y los biomarcadores funcionales. Por lo tanto, la capacidad de utilizar la inmunofluorescencia en organoides primarios de cáncer de ovario es extremadamente beneficiosa para comprender la biología de este cáncer. El estudio actual describe la técnica de inmunofluorescencia para detectar proteínas de reparación del daño del ADN en organoides de cáncer de ovario (DOP) serosos de alto grado derivados de pacientes. Después de exponer los PDO a la radiación ionizante, la inmunofluorescencia se realiza en organoides intactos para evaluar las proteínas nucleares como focos. Las imágenes se recopilan utilizando imágenes z-stack en microscopía confocal y se analizan utilizando un software automatizado de conteo de focos. Los métodos descritos permiten el análisis del reclutamiento temporal y especial de proteínas de reparación del daño del ADN y la colocalización de estas proteínas con marcadores del ciclo celular.

El protocolo presentado puede teñir, visualizar y cuantificar con éxito las proteínas de reparación del daño del ADN nuclear en organoides. Esta técnica se utilizó para teñir y evaluar las DOP antes y después de la irradiación. Los PDO se expusieron a 10 Gy de radiación y se evaluaron los siguientes biomarcadores: ɣ-H2AX (Figura 1), un marcador de daño en el ADN; RAD51 (Figura 2), un marcador para HRR; 53BP1, un marcador de NHEJ; RPA, un marcador de...

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Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

El presente protocolo describe métodos para evaluar las proteínas de reparación del daño del ADN en organoides de cáncer de ovario derivados de pacientes. Aquí se incluyen métodos integrales de recubrimiento y tinción, así como procedimientos de cuantificación detallados y objetivos.

Visualización de proteínas de reparación del daño del ADN en organoides de cáncer de ovario derivados de pacientes a través de ensayos de inmunofluorescencia

Immunofluorescence is one of the most widely used techniques to visualize target antigens with high sensitivity and specificity, allowing for the accurate ...

El estudio de la respuesta al daño del ADN es necesario para comprender la fisiopatología de los biomarcadores potenciales del cáncer de ovario en la nueva terapia dirigida. Esta técnica permite que la muestra permanezca intacta y permite el examen de antígenos en su lugar de acción. Este protocolo es rápido y se puede adaptar a cualquier antígeno susceptible de inmunofluorescencia.Este método proporciona información sobre el cáncer de ovario y los procesos de reparación del daño del ADN involucrados en la resistencia quimioterapéutica y a los inhibidores de PARP. Estos métodos se pueden aplicar a otras áreas de estudio que implican el uso de cultivos 3D y organoides. Para empezar, aspire los medios de los organoides irradiados e incubados sin interrumpir la matriz 3D.Luego lavar con 300 microlitros de PBS. Fijar los organoides en 300 microlitros de paraformaldehído al 2% durante 10 minutos. Después de la fijación, lave los organoides con 300 microlitros de tampón de tinción y colóquelos en una coctelera durante cinco minutos.Luego permeabilice el organoide agregando suavemente 300 microlitros de tampón de permeabilización. Después de 20 minutos de incubación, retire el tampón y lave con 300 microlitros de tampón de tinción. Coloque los organoides en una coctelera durante cinco minutos.A continuación, agregue 300 microlitros de tampón de tinción para bloquear el paso de permeabilización. Colocar en el agitador durante 30 minutos y aspirar el tampón de tinción con una pipeta. Luego agregue 300 microlitros de anticuerpos primarios diluidos en tampón de tinción.Incubar a cuatro grados centígrados durante 16 horas. Después de la incubación, retire la solución primaria de anticuerpos. Realice tres lavados con 300 microlitros de tampón de tinción durante cinco minutos cada uno en la coctelera.Agregue 300 microlitros de solución de anticuerpos secundarios diluidos en tampón de tinción e incube durante una hora en la oscuridad. Después de una hora, aspire la solución de anticuerpos secundarios y agregue 300 microlitros de DAPI diluido. Colocar en la coctelera durante cinco minutos.Realice tres lavados con 300 microlitros de tampón de tinción durante cinco minutos cada uno en la coctelera. Retire el tampón de tinción y separe las cámaras utilizando el kit de extracción incluido con las guías de la cámara. Corte la punta de una pipeta P200 y utilícela para agregar medio de montaje para cubrir cada pocillo que contenga una lengüeta organoide.Coloque un deslizamiento de cubierta sobre la muestra mientras evita las burbujas. Tome esmalte de uñas transparente y píntelo en los lados del vidrio de la cubierta para sellar el portaobjetos. Deja que se endurezca durante una hora y luego colócalo a 20 grados centígrados.Adquiera imágenes utilizando un microscopio confocal utilizando un objetivo 63X con aceite de inmersión. Usando este protocolo, los organoides de cáncer de ovario derivados de pacientes se tiñeron para detectar proteínas de reparación del daño del ADN antes y después de la irradiación, y se evaluaron biomarcadores como gamma H2AX, un marcador de daño en el ADN, y RAD51, un marcador para la reparación de recombinación homóloga. RPA, un marcador de estrés de replicación, 53BP1, un marcador de unión no homóloga, y Geminin, un marcador del ciclo celular de fase GS2 también se evaluaron utilizando esta técnica.Las pestañas BME tienden a despolimerizarse, por lo que prestar mucha atención después de la fijación y aspiración es vital. El análisis de los antígenos para determinar el daño de los organoides y la capacidad de montar una respuesta al daño del ADN podría ayudar en la evaluación de la resistencia quimioterapéutica.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

Evaluar In Vitro el daño de ADN utilizando el ensayo cometa

DNA damage is a common phenomenon for each cell during its lifespan, and is defined as an alteration of the chemical structure of genomic DNA. Cancer ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

Characterizing DNA Repair Processes at Transient and Long-lasting Double-strand DNA Breaks by Immunofluorescence Microscopy

Caracterización de procesos de reparación del ADN en transitoria y duradera doble cadena DNA roturas por microscopia de la inmunofluorescencia

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair ...

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

Pruebas de terapias dirigidas en cáncer mediante análisis de alteración estructural del ADN y xenoinjertos derivados del paciente

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

Imágenes de inmunofluorescencia de daños en el ADN y dosis de focos en células de cáncer de colon humano

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

Ensayo in vitro de alto rendimiento utilizando organoides tumorales derivados del paciente

Patient-derived tumor organoids (PDOs) are expected to be a preclinical cancer model with better reproducibility of disease than traditional cell culture ...

Profiling Sensitivity to Targeted Therapies in EGFR-Mutant NSCLC Patient-Derived Organoids

Perfil de la sensibilidad a las terapias dirigidas en organoides derivados de pacientes con NSCLC con mutación de EGFR

Novel 3D cancer organoid cultures derived from clinical patient specimens represent an important model system to evaluate intratumor heterogeneity and ...

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

Generación y cultivo de organoides derivados de pacientes con cáncer de ovario seroso de alto grado

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...

Quantifying Replication Stress in Ovarian Cancer Cells Using Single-Stranded DNA Immunofluorescence

Cuantificación del estrés de replicación en células de cáncer de ovario mediante inmunofluorescencia de ADN monocatenario

Replication stress is a hallmark of several ovarian cancers. Replication stress can emerge from multiple sources, including double-strand breaks, ...

Establishment and Culture of Patient-Derived Breast Organoids

Establecimiento y cultivo de organoides mamarios derivados de pacientes

Breast cancer is a complex disease that has been classified into several different histological and molecular subtypes. Patient-derived breast tumor ...

Ovarian Cancer Patient-Derived Organoid Models for Pre-Clinical Drug Testing

Modelos de organoides derivados de pacientes con cáncer de ovario para pruebas preclínicas de medicamentos

Ovarian cancer is a fatal gynecologic cancer and the fifth leading cause of cancer death among women in the United States. Developing new drug treatments ...