Name: visualizing dna damage repair proteins in patient-derived ovarian cancer organoids via immunofluorescence assays
Uploaded: 2023-02-24T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays at JoVE.com

Bu protokolün oluşturulmasında Pavel Lobachevsky, PhD'nin rehberliği için minnettarız. Ayrıca, St. Louis'in Kadın Hastalıkları ve Doğum Bölümü ve Jinekolojik Onkoloji Bölümü'ndeki Washington Üniversitesi Tıp Fakültesi'ne, Washington Üniversitesi Dekan'ın Akademik Programına, Jinekolojik Onkoloji Grubu Vakfı'na ve Üreme Bilim İnsanı Geliştirme Programı'na bu projeye verdikleri destek için teşekkür ederiz.

Tümör dokusu ve asit, St. Louis Kurumsal İnceleme Kurulu'ndaki (IRB) Washington Üniversitesi tarafından onaylanan jinekolojik onkoloji biyodeposunun bir parçası olarak hasta onayı alındıktan sonra elde edildi. İleri evre yüksek dereceli seröz over kanseri (HGSOC) olan hastalar dahil edildi. Tüm prosedürler aksi belirtilmedikçe tezgahta oda sıcaklığında gerçekleştirilmiştir. Tüm reaktifler oda sıcaklığında (aksi belirtilmedikçe) hazırlandı ve 4 ° C'de saklandı.
<s...

<ol>
	<li>Lheureux, S., Gourley, C., Vergote, I., Oza, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+ovarian+cancer.">Epithelial ovarian cancer.</a> Lancet Oncology. 393 (10177), 1240-1253 (2019).</li><li>Tew, W. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP+inhibitors+in+the+management+of+ovarian+cancer:+ASCO+guideline.">PARP inhibitors in the management of ovarian cancer: ASCO guideline.</a> Journal of Clinical Oncology. 38 (30), 3468-3493 (2020).</li><li>Tomasova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+repair+and+ovarian+carcinogenesis:+impact+on+risk,+prognosis+and+therapy+outcome.">DNA repair and ovarian carcinogenesis: impact on risk, prognosis and therapy outcome.</a> Cancers. 12 (7), 1713 (2020).</li><li>Mukhopadhyay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+functional+assay+for+homologous+recombination+status+in+primary+cultures+of+epithelial+ovarian+tumor+and+correlation+with+sensitivity+to+poly(ADP-Ribose)+polymerase+inhibitors.">Development of a functional assay for homologous recombination status in primary cultures of epithelial ovarian tumor and correlation with sensitivity to poly(ADP-Ribose) polymerase inhibitors.</a> Clinical Cancer Research. 16 (8), 2344-2351 (2010).</li><li>Graeser, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+marker+of+homologous+recombination+predicts+pathologic+complete+response+to+neoadjuvant+chemotherapy+in+primary+breast+cancer.">A marker of homologous recombination predicts pathologic complete response to neoadjuvant chemotherapy in primary breast cancer.</a> Clinical Cancer Research. 16 (24), 6159-6168 (2010).</li><li>Hill, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+DNA+repair+inhibitor+response+in+short-term+patient-derived+ovarian+cancer+organoids.">Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids.</a> Cancer Discovery. 8 (11), 1404-1421 (2018).</li><li>Naipal, K. A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+ex+vivo+assay+to+select+homologous+recombination-deficient+breast+tumors+for+PARP+inhibitor+treatment.">Functional ex vivo assay to select homologous recombination-deficient breast tumors for PARP inhibitor treatment.</a> Clinical Cancer Research. 20 (18), 4816-4826 (2014).</li><li>Tumiati, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+homologous+recombination+assay+predicts+primary+chemotherapy+response+and+long-term+survival+in+ovarian+cancer+patients.">A functional homologous recombination assay predicts primary chemotherapy response and long-term survival in ovarian cancer patients.</a> Clinical Cancer Research. 24 (18), 4482-4493 (2018).</li><li>Mukhopadhyay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinicopathological+features+of+homologous+recombination-deficient+epithelial+ovarian+cancers:+sensitivity+to+PARP+inhibitors,+platinum,+and+survival.">Clinicopathological features of homologous recombination-deficient epithelial ovarian cancers: sensitivity to PARP inhibitors, platinum, and survival.</a> Cancer Research. 72 (22), 5675-5682 (2012).</li><li>Johnson, S. W., Laub, P. B., Beesley, J. S., Ozols, R. F., Hamilton, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+platinum-DNA+damage+tolerance+is+associated+with+cisplatin+resistance+and+cross-resistance+to+various+chemotherapeutic+agents+in+unrelated+human+ovarian+cancer+cell+lines.">Increased platinum-DNA damage tolerance is associated with cisplatin resistance and cross-resistance to various chemotherapeutic agents in unrelated human ovarian cancer cell lines.</a> Cancer Research. 57 (5), 850-856 (1997).</li><li>Stefanou, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+DNA+damage+response+pathways+may+predict+the+outcome+of+platinum+chemotherapy+in+ovarian+cancer.">Aberrant DNA damage response pathways may predict the outcome of platinum chemotherapy in ovarian cancer.</a> PLoS One. 10 (2), 0117654 (2015).</li><li>Helleday, T., Petermann, E., Lundin, C., Hodgson, B., Sharma, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+repair+pathways+as+targets+for+cancer+therapy.">DNA repair pathways as targets for cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 8 (3), 193-204 (2008).</li><li>Ivashkevich, A., Redon, C. E., Nakamura, A. J., Martin, R. F., Martin, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+&#947;-H2AX+assay+to+monitor+DNA+damage+and+repair+in+translational+cancer+research.">Use of the &#947;-H2AX assay to monitor DNA damage and repair in translational cancer research.</a> Cancer Letters. 327 (1-2), 123-133 (2012).</li><li>Fuh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologous+recombination+deficiency+real-time+clinical+assays,+ready+or+not.">Homologous recombination deficiency real-time clinical assays, ready or not.</a> Gynecologic Oncology. 159 (3), 877-886 (2020).</li><li>Cong, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+gaps+are+a+key+determinant+of+PARP+inhibitor+synthetic+lethality+with+BRCA+deficiency.">Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency.</a> Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).</li><li>Lee, E. K., Matulonis, U. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP+inhibitor+resistance+mechanisms+and+implications+for+post-progression+combination+therapies.">PARP inhibitor resistance mechanisms and implications for post-progression combination therapies.</a> Cancers. 12 (8), 2054 (2020).</li><li>Panzarino, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+gaps+underlie+BRCA+deficiency+and+therapy+response.">Replication gaps underlie BRCA deficiency and therapy response.</a> Cancer Research. 81 (5), 1388-1397 (2021).</li><li>Yee, C., Dickson, K. A., Muntasir, M. N., Ma, Y., Marsh, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+modelling+of+ovarian+cancer:+from+cell+lines+to+organoids+for+discovery+and+personalized+medicine.">Three-dimensional modelling of ovarian cancer: from cell lines to organoids for discovery and personalized medicine.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 836984 (2022).</li><li>Regan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+staining+of+colorectal+cancer+patient-derived+organoids.">Immunofluorescence staining of colorectal cancer patient-derived organoids.</a> Methods Cell Biology. 171, 163-171 (2022).</li><li>Graham, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+culturing+of+high-grade+serous+ovarian+cancer+patient+derived+organoids.">Generation and culturing of high-grade serous ovarian cancer patient derived organoids.</a> Journal of Visualized Experiments. (191), (2023).</li><li>Jakl, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+JCountPro+software+for+efficient+assessment+of+ionizing+radiation-induced+foci+in+human+lymphocytes.">Validation of JCountPro software for efficient assessment of ionizing radiation-induced foci in human lymphocytes.</a> International Journal of Radiation Biology. 92 (12), 766-773 (2016).</li><li>Mullen, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAS6/AXL+inhibition+enhances+ovarian+cancer+sensitivity+to+chemotherapy+and+PARP+inhibition+through+increased+DNA+damage+and+enhanced+replication+stress.">GAS6/AXL inhibition enhances ovarian cancer sensitivity to chemotherapy and PARP inhibition through increased DNA damage and enhanced replication stress.</a> Molecular Cancer Research. 20 (2), 265-279 (2022).</li><li>van Ineveld, R. L., Ariese, H. C. R., Wehrens, E. J., Dekkers, J. F., Rios, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+resolution+three-dimensional+imaging+of+intact+organoids.">Single-cell resolution three-dimensional imaging of intact organoids.</a> Journal of Visualized Experiments. (160), e60709 (2020).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids.">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).</li><li>O'Rourke, K. P., Dow, L. E., Lowe, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescent+staining+of+mouse+intestinal+stem+cells.">Immunofluorescent staining of mouse intestinal stem cells.</a> Bio Protocols. 6 (4), 1732 (2016).</li><li>Nwani, N. G., Sima, L. E., Nieves-Neira, W., Matei, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+microenvironment+in+high+grade+serous+ovarian+cancer.">Targeting the microenvironment in high grade serous ovarian cancer.</a> Cancers. 10 (8), 266 (2018).</li><li>Ghoneum, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+clinical+value+of+tumor+microenvironment+in+platinum-resistant+ovarian+cancer.">Exploring the clinical value of tumor microenvironment in platinum-resistant ovarian cancer.</a> Seminars in Cancer Biology. 77, 83-98 (2021).</li><li>Yang, Y., Yang, Y., Yang, J., Zhao, X., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+microenvironment+in+ovarian+cancer:+function+and+therapeutic+strategy.">Tumor microenvironment in ovarian cancer: function and therapeutic strategy.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 758 (2020).</li><li>van de Wetering, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+derivation+of+a+living+organoid+biobank+of+colorectal+cancer+patients.">Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients.</a> Cell. 161 (4), 933-945 (2015).</li><li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+primary+liver+cancer-derived+organoid+cultures+for+disease+modeling+and+drug+screening.">Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening.</a> Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).</li><li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li><li>Cybulla, E., Vindigni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leveraging+the+replication+stress+response+to+optimize+cancer+therapy.">Leveraging the replication stress response to optimize cancer therapy.</a> Nature Reviews. , (2022).</li></ol>

DNA hasarı yanıtı hem yumurtalık kanseri gelişiminde hem de kemoterapi direncinde ayrılmaz bir rol oynar. Bu nedenle, DNA onarım mekanizmalarının tam olarak anlaşılması zorunludur. Burada, DNA hasarı onarım proteinlerini 3D, bozulmamış organoidlerde incelemek için bir metodoloji sunulmaktadır. DNA hasarını, homolog rekombinasyonu, homolog olmayan uç birleştirmeyi ve replikasyon stresini değerlendirmek için ayırt edici antikorlar kullanılarak tekrarlanabilir, güvenilir bir protokol geliştirilmi...

Yumurtalık kanseri jinekolojik maligniteye bağlı ölümlerin önde gelen nedenidir. Hastaların çoğunluğu karboplatin gibi DNA'ya zarar veren ilaçlarla tedavi edilir ve homolog rekombinasyon onarımı (HRR) eksikliği olan tümörleri olanlara poli (ADP-riboz) polimeraz (PARP) inhibitörleriverilebilir 1,2. Bununla birlikte, çoğu hasta bu tedavilere direnç geliştirir ve tanıdan sonraki 5 yıl içinde ölür. DNA hasar yanıtının (DDR) düzensizliği, yumurtalık kanseri gelişimi ve hem kemoterapi hem de PARP inhibitörü direnci ile ilişkilendirilmiştir3. Bu nedenle, DDR'nin incelenmesi, yumurtalık kanserinin patofizyolojisini, potansiyel biyobelirteçleri ve yeni hedefe yönelik tedavileri anlamada zorunludur.
DDR'yi değerlendirmek için mevcut yöntemler, DNA hasar proteinlerinin ve nükleotid analoglarının doğru tanımlanmasına ve lokalizasyonuna izin verdiği için immünofloresan (IF) kullanır. DNA'da çift sarmallı bir kırılma (DSB) olduğunda, histon proteini H2AX hızla fosforile edilir ve DNA hasarı onarım proteinlerinin4'ü bir araya getirdiği bir odak oluşturur. Bu fosforilasyon, IF kullanılarak kolayca tanımlanabilir; Aslında, ɣ-H2AX testi, bir DSB 5,6,7,8,9'un indüksiyonunu doğrulamak için yaygın olarak kullanılmıştır. Artmış DNA hasarı, DNA'ya zarar veren ajanların platin duyarlılığı ve etkinliği ile ilişkilendirilmiştir 10,11,12 ve ɣ-H2AX, diğer kanser tedavilerinde kemoterapi yanıtı ile ilişkili bir biyobelirteç olarak önerilmiştir13. Bir DSB üzerine, HRR'de yetkin bir hücre, BRCA1 ve BRCA2'nin replikasyon proteini A'nın (RPA) yerini alması ve DNA'ya bağlanması için RAD51'i işe almasına yol açan bir dizi olay gerçekleştirir. HRR onarımı, DSB'yi sadık bir şekilde onarmak için bir DNA şablonu kullanır. Bununla birlikte, tümörler HRR'de eksik olduğunda, homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) gibi alternatif onarım yollarına güvenirler. NHEJ'nin hataya eğilimli olduğu bilinmektedir ve hücre üzerinde yüksek mutasyonel bir yük oluşturur, bu da 53BP1'i pozitif bir düzenleyici14 olarak kullanır. Bu DNA hasarı proteinlerinin hepsi IF kullanılarak odaklar olarak doğru bir şekilde tanımlanabilir. Proteinler için boyamaya ek olarak, IF çatal korumasını ve tek sarmallı DNA boşluğu oluşumunu incelemek için kullanılabilir. Stabil çatallara sahip olma yeteneği platin yanıtı ile ilişkilendirilmiştir ve son zamanlarda, boşluk testleri PARP inhibitörlerine 6,15,16,17 yanıtını tahmin etme potansiyelini göstermiştir. Bu nedenle, genoma girdikten sonra nükleotid analogları için boyama, DDR'yi incelemenin başka bir yoludur.
Bugüne kadar, yumurtalık kanserinde DDR'nin değerlendirilmesi büyük ölçüde klonal heterojenliği, mikroçevreyi veya in vivo tümörlerin mimarisini özetlemeyen homojen 2D hücre hatları ile sınırlandırılmıştır18,19. Son zamanlarda yapılan araştırmalar, organoidlerin DDRmekanizmaları 6 gibi karmaşık biyolojik süreçleri incelemede 2D hücre hatlarından daha üstün olduğunu göstermektedir. Mevcut metodoloji PDO'larda RAD51, ɣ-H2AX, 53BP1, RPA ve geminin'i değerlendirmektedir. Bu yöntemler bozulmamış organoidi değerlendirir ve DDR mekanizmalarının in vivo tümör mikroçevresine daha benzer bir ortamda incelenmesine izin verir. Konfokal mikroskopi ve otomatik odak sayımı ile birlikte, bu metodoloji yumurtalık kanserinde DDR yolunun anlaşılmasına ve hastalar için tedavi planlarının kişiselleştirilmesine yardımcı olabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x phosphate buffered saline with calcium and magnesium (PBS++)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>14-040-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x phosphate buffered saline without calcium and magnesium (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>ICN1860454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ant-53BP1 Antibody&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>612522</td>
			<td>diluted to 1:500 in staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ant-Geminin Antibody&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab104306</td>
			<td>diluted to 1:200 in staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Geminin Antibody&#160;</td>
			<td>ProteinTech</td>
			<td>10802-1-AP</td>
			<td>diluted to 1:400 in staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-RAD51 Antibody&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab133534</td>
			<td>diluted to 1:1000 in staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-yH2AX Antibody&#160;</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>05-636</td>
			<td>diluted to 1:500 in staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ant-phospho-RPA32 (S4/S8) Antibody</td>
			<td>Bethyl Laboratories&#160;</td>
			<td>A300-245A-M</td>
			<td>diluted to 1:200 in staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>BP1605 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge; Sorvall St 16R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>75004240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope, Leica SP5 confocal system DMI4000</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>389584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tubes, 15 mL</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess 3 FL Automated Cell Counter (Cell Counting Machine)&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>AMQAF2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slip</td>
			<td>LA Colors</td>
			<td></td>
			<td>Any clear nail polish will suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex&#160;RGF Basement Membrane Extract, Type 2</td>
			<td>&#160;R&#38;D Systems&#160;</td>
			<td>3533-010-02</td>
			<td>Could probably use Matrigel or other BME Matrix&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>&#160;R37606</td>
			<td>NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent, Diluted in 1x PBS&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>NC0756056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JCountPro</td>
			<td>JCountPro</td>
			<td></td>
			<td>For access to the software, Email: jcountpro@gmail.com&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>07-000-243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail Polish&#160;</td>
			<td>StatLab</td>
			<td>SL102450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafomraldehyde (PFA), 2%&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences&#160;</td>
			<td>157-4</td>
			<td>Dilute to 4% PFA in PBS++ to obtain 2% PFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permeabilization Buffer</td>
			<td>Made in Lab</td>
			<td></td>
			<td>0.2% X-100 Triton in PBS++&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips&#160;</td>
			<td>Rainin&#160;</td>
			<td>17014967</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>&#160;P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining Buffer&#160;</td>
			<td>Made in Lab</td>
			<td></td>
			<td>0.5% BSA, 0.15% Glycine, 0.1% X-100 Triton in PBS++&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>12-565-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Alderich&#160;</td>
			<td>11332481001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12604013</td>
			<td>animal origin-free, recombinant enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-RAD 320 Biological Irradiator&#160;</td>
			<td>Precision X-Ray Irradiation&#160;</td>
			<td>X-RAD320</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing dna damage repair proteins in patient-derived ovarian cancer organoids via immunofluorescence assays

İmmünofloresan, proteinlerin, glikanların ve küçük moleküllerin doğru tanımlanmasına ve lokalizasyonuna olanak sağlayan, yüksek duyarlılık ve özgüllüğe sahip hedef antijenleri görselleştirmek için en yaygın kullanılan tekniklerden biridir. Bu teknik iki boyutlu (2D) hücre kültüründe iyi kurulmuş olsa da, üç boyutlu (3D) hücre modellerinde kullanımı hakkında daha az şey bilinmektedir. Yumurtalık kanseri organoidleri, tümör hücresi klonal heterojenliğini, tümör mikroçevresini ve hücre-hücre ve hücre-matris etkileşimlerini özetleyen 3D tümör modelleridir. Bu nedenle, ilaç duyarlılığının ve fonksiyonel biyobelirteçlerin değerlendirilmesinde hücre hatlarından üstündürler. Bu nedenle, primer yumurtalık kanseri organoidlerinde immünofloresan kullanma yeteneği, bu kanserin biyolojisini anlamada son derece faydalıdır. Bu çalışmada, yüksek dereceli seröz hasta kaynaklı yumurtalık kanseri organoidlerinde (PDO'lar) DNA hasarı onarım proteinlerini tespit etmek için immünofloresan tekniği açıklanmaktadır. PDO'ları iyonlaştırıcı radyasyona maruz bıraktıktan sonra, nükleer proteinleri odak olarak değerlendirmek için sağlam organoidler üzerinde immünofloresan yapılır. Görüntüler konfokal mikroskopide z-yığın görüntüleme kullanılarak toplanır ve otomatik odak sayım yazılımı kullanılarak analiz edilir. Tarif edilen yöntemler, DNA hasar onarım proteinlerinin zamansal ve özel olarak işe alınmasının analizine ve bu proteinlerin hücre döngüsü belirteçleri ile kolokalizasyonuna izin verir.

Sunulan protokol, organoidlerdeki nükleer DNA hasar onarım proteinlerini başarılı bir şekilde boyayabilir, görselleştirebilir ve ölçebilir. Bu teknik, ışınlamadan önce ve sonra PDO'ları boyamak ve değerlendirmek için kullanıldı. PDO'lar 10 Gy radyasyona maruz bırakıldı ve aşağıdaki biyobelirteçler için değerlendirildi: ɣ-H2AX (Şekil 1), DNA hasarının bir belirteci; HRR için bir belirteç olan RAD51 (Şekil 2); 53BP1, NHEJ'nin bir...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays at JoVE.com

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

Bu protokol, hasta kaynaklı yumurtalık kanseri organoidlerinde DNA hasarı onarım proteinlerini değerlendirme yöntemlerini açıklamaktadır. Burada kapsamlı kaplama ve boyama yöntemlerinin yanı sıra ayrıntılı, objektif niceleme prosedürleri de bulunmaktadır.

İmmünofloresan Tahlilleri ile Hasta Kaynaklı Yumurtalık Kanseri Organoidlerinde DNA Hasar Onarım Proteinlerinin Görselleştirilmesi

Immunofluorescence is one of the most widely used techniques to visualize target antigens with high sensitivity and specificity, allowing for the accurate ...

DNA hasarı yanıtının incelenmesi, yeni hedefe yönelik tedavide yumurtalık kanseri potansiyel biyobelirteçlerinin patofizyolojisinin anlaşılmasında gereklidir. Bu teknik, numunenin bozulmadan kalmasına izin verir ve antijenlerin etki yerlerinde incelenmesine izin verir. Bu protokol hızlıdır ve immünofloresana uygun herhangi bir antijene uyarlanabilir.Bu yöntem, kemoterapötik ve PARP inhibitörü direncinde rol oynayan yumurtalık kanseri ve DNA hasarı onarım süreçleri hakkında fikir verir. Bu yöntemler, 3D kültürlerin ve organoidlerin kullanımını içeren diğer çalışma alanlarına uygulanabilir. Başlamak için, 3B matrisini bozmadan medyayı ışınlanmış ve inkübe edilmiş organoidlerden aspire edin.Daha sonra 300 mikrolitre PBS ile yıkayın. Organoidleri 10 dakika boyunca 300 mikrolitre% 2 paraformaldehit içinde sabitleyin. Sabitledikten sonra, organoidleri 300 mikrolitre boyama tamponu ile yıkayın ve beş dakika boyunca bir çalkalayıcıya yerleştirin.Daha sonra 300 mikrolitre geçirgenlik tamponu ekleyerek organoidi geçirgenleştirin. 20 dakikalık inkübasyondan sonra, tamponu çıkarın ve 300 mikrolitre boyama tamponu ile yıkayın. Organoidleri beş dakika boyunca bir çalkalayıcıya yerleştirin.Ardından, geçirgenlik adımını engellemek için 300 mikrolitre boyama tamponu ekleyin. Çalkalayıcıya 30 dakika boyunca yerleştirin ve bir pipet kullanarak boyama tamponunu aspire edin. Daha sonra boyama tamponunda seyreltilmiş 300 mikrolitre birincil antikor ekleyin.16 saat boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Kuluçkadan sonra, birincil antikor çözeltisini çıkarın. Çalkalayıcıda her biri beş dakika boyunca 300 mikrolitre boyama tamponu ile üç yıkama yapın.Boyama tamponunda seyreltilmiş 300 mikrolitre ikincil antikor çözeltisi ekleyin ve karanlıkta bir saat boyunca inkübe edin. Bir saat sonra, ikincil antikor çözeltisini aspire edin ve 300 mikrolitre seyreltilmiş DAPI ekleyin. Çalkalayıcıya beş dakika boyunca yerleştirin.Çalkalayıcıda her biri beş dakika boyunca 300 mikrolitre boyama tamponu ile üç yıkama yapın. Boyama tamponunu çıkarın ve hazne kızaklarıyla birlikte verilen sökme kitini kullanarak odaları ayırın. P200 pipet ucunun ucunu kesin ve organoid tırnak içeren her bir kuyuyu kaplayacak montaj ortamı eklemek için bunu kullanın.Kabarcıklardan kaçınırken numunenin üzerine bir kapak kayması yerleştirin. Şeffaf oje alın ve slaytı kapatmak için kapak camının kenarlarına boyayın. Bir saat sertleşmesine izin verin ve ardından 20 santigrat dereceye yerleştirin.Daldırma yağı ile 63X objektif kullanarak konfokal mikroskop kullanarak görüntüler elde edin. Bu protokolü kullanarak, hasta kaynaklı yumurtalık kanseri organoidleri, ışınlamadan önce ve sonra DNA hasarı onarım proteinleri için boyandı ve DNA hasarının bir belirteci olan gama H2AX ve homolog rekombinasyon onarımı için bir belirteç olan RAD51 gibi biyobelirteçler için değerlendirildi. Replikasyon stresinin bir belirteci olan RPA, homolog olmayan enjonktüre edici bir belirteç olan 53BP1 ve GS2 faz hücre döngüsü belirteci Geminin de bu teknik kullanılarak değerlendirildi.BME tırnakları depolimerize olma eğilimindedir, bu nedenle sabitleme ve aspirasyondan sonra çok dikkat etmek hayati önem taşır. Organoidlerin hasarını ve DNA hasar yanıtını monte etme yeteneğini belirlemek için antijenlerin analiz edilmesi, kemoterapötik direncin değerlendirilmesinde yardımcı olabilir.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

Vitro DNA hasarı kuyruklu yıldız tahlil kullanarak değerlendirmek

DNA damage is a common phenomenon for each cell during its lifespan, and is defined as an alteration of the chemical structure of genomic DNA. Cancer ...

Kanser Araştırmaları

Characterizing DNA Repair Processes at Transient and Long-lasting Double-strand DNA Breaks by Immunofluorescence Microscopy

DNA onarım işlemleri, Darbe Gerilimlerinden ve uzun süreli iki iplikçikli DNA sonları ayirt mikroskobu ile karakterize

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair ...

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

Yapısal DNA Alterasyon Analizi ve Hasta Kaynaklı Ksenogreftler Kullanılarak Kanserde Hedefli Tedavilerin Test Edilmesi

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

İnsan Kolon Kanseri Hücrelerinde DNA Hasarı ve Onarım Foci İmmünofloresan Görüntüleme

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

Hasta Kaynaklı Tümör Organoidleri Kullanılarak Yüksek Verimli In Vitro Tahlil

Patient-derived tumor organoids (PDOs) are expected to be a preclinical cancer model with better reproducibility of disease than traditional cell culture ...

Profiling Sensitivity to Targeted Therapies in EGFR-Mutant NSCLC Patient-Derived Organoids

EGFR-Mutant NSCLC Hasta Kaynaklı Organoidlerde Hedefe Yönelik Tedavilere Duyarlılığın Profillenmesi

Novel 3D cancer organoid cultures derived from clinical patient specimens represent an important model system to evaluate intratumor heterogeneity and ...

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

Yüksek Dereceli Seröz Yumurtalık Kanseri Hasta Kaynaklı Organoidlerin Üretimi ve Kültürlenmesi

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...

Quantifying Replication Stress in Ovarian Cancer Cells Using Single-Stranded DNA Immunofluorescence

Tek Sarmallı DNA İmmünofloresan Kullanarak Yumurtalık Kanseri Hücrelerinde Replikasyon Stresinin Ölçülmesi

Replication stress is a hallmark of several ovarian cancers. Replication stress can emerge from multiple sources, including double-strand breaks, ...

Establishment and Culture of Patient-Derived Breast Organoids

Hasta kaynaklı meme organoidlerinin kurulması ve kültürü

Breast cancer is a complex disease that has been classified into several different histological and molecular subtypes. Patient-derived breast tumor ...

Ovarian Cancer Patient-Derived Organoid Models for Pre-Clinical Drug Testing

Klinik Öncesi İlaç Testi için Yumurtalık Kanseri Hasta Kaynaklı Organoid Modeller

Ovarian cancer is a fatal gynecologic cancer and the fifth leading cause of cancer death among women in the United States. Developing new drug treatments ...