따라서 전구 세포는 환경과 상호 작용하여 조직 항상성을 유지합니다. 그리고 이 프로토콜을 사용하여 섬유아세포가 식도 전구 세포 행동에 어떤 영향을 미치는지 이해하기 시작할 수 있습니다. 공동 배양 시스템은 정상적인 식도 전구체 틈새를 모방한 먼저 분리된 세포를 사용합니다.
이미징 전에 오가노이드를 제거하면 세포 상호 작용과 오가노이드 형태를 모두 분석할 수 있습니다. 이 방법은 인간 식도 오가노이드에 적용될 수 있습니다. 예를 들어, 건강한 환자나 암 환자의 재료를 사용합니다.
그렇게 함으로써 우리는 암 관련 섬유아세포의 특정 기능에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 상피 및 기질 세포의 해리는 생존 가능한 오가노이드를 얻는 데 중요합니다. 소화 중에는 세포 수율이 낮아지고, 과다 소화는 세포 생존력과 오가노이드 형성 능력을 감소시킵니다.
시작하려면 해부 현미경과 집게를 사용하여 식도의 근외근을 기계적으로 제거합니다. 한 쌍의 집게를 사용하여 해부된 식도의 말단부를 잡고 다른 집게를 사용하여 식도의 원위부에서 근위부까지 근육을 잡고 당깁니다. 근육층을 제거하고 버립니다.
식도를 세로로 열려면 식도의 한쪽 끝을 잡고 미세 해부 스프링 가위의 볼을 내강에 삽입하여 조직 손상을 방지합니다. 끝을 잡고 식도를 잘라내어 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브 또는 24 웰 플레이트에 넣습니다. 열린 식도를 HBSS에 밀리리터당 0.5밀리그램의 써모리진에 담그고 섭씨 37도에서 로커 셰이커에서 15분 동안 배양합니다.
thermolysin 용액에서 식도를 제거한 후 식도 상피를 간질에서 조심스럽게 분리하십시오. 상피 및 기질 층을 HBSS에서 200 마이크로리터의 해리 용액이 있는 두 개의 분리된 1.5 밀리리터 마이크로원심분리기 튜브로 옮기고, 이들을 얼음 위에 놓는다. 날카로운 메스를 사용하여 식도 상피를 다지고 200 마이크로 리터의 해리 용액으로 페트리 접시에서 다진 조직을 수집합니다.
1.5밀리리터 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 800 마이크로 리터의 신선한 해리 용액을 첨가하고 다진 상피층이있는 튜브를 섭씨 37도에서 60 분 동안 로커 셰이커에 놓습니다. 15분마다 200 마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 용액을 약 20회 위아래로 피펫팅합니다.
해부 가위를 사용하여 200 마이크로 리터의 해리 용액이 들어있는 1.5 밀리리터 튜브에서 기질 층을 미세한 조각으로 자르고 800 마이크로 리터의 신선한 해리 용액을 첨가한다. 튜브를 섭씨 37도의 로커 셰이커에 30분 동안 놓습니다. 기질 용액에 대해 30분 동안 인큐베이션하고 상피 용액에 대해 60분 동안 인큐베이션한 후, 용액을 추가로 20회 동안 위아래로 피펫팅합니다.
기질 용액을 70 마이크로미터 셀 스트레이너를 통과시키고, 상피 용액을 40 마이크로미터 셀 스트레이너를 통해 새로운 1.5 밀리미터 마이크로 원심분리 튜브에 통과시킨다. 섭씨 4도에서 10분 동안 300G에서 원심분리하고 1밀리리터 피펫으로 과잉 액체를 제거하여 상층액을 버립니다. 펠릿을 200 마이크로 리터의 항체 혼합물에 재현탁하십시오.
혼합물을 유세포 분석 튜브로 옮긴 후 섭씨 4도에서 30분 동안 세포를 배양합니다. 3밀리리터의 1% FBS를 추가하고 5분 동안 다시 원심분리합니다. 그런 다음 최소 200마이크로리터의 1%FBS에 세포를 다시 일시 중단합니다.
10, 000 희석된 죽은 세포 염색 마커를 팩스 분류 5분 전에 추가하여 살아있는 세포를 분리합니다. 분류된 상피 세포와 섬유아세포를 튜브에 1:2의 비율로 혼합합니다. 300G에서 5분 동안 원심분리한 후 200마이크로리터 피펫으로 상층액을 조심스럽게 제거하여 버립니다.
펠릿을 차가운 염기성 오가노이드 배지에 재현탁하고 5분 동안 다시 원심분리하여 세포를 한 번 세척합니다. 세포를 얼음 위에 놓고 200 마이크로 리터 피펫으로 조심스럽게 제거하여 상청액을 버립니다. 돔 당 10 마이크로 리터의 매트릭스 믹스로 세포를 재현탁하고 튜브를 다시 얼음 위에 놓습니다.
섭씨 37도 인큐베이터에서 예열 된 48 웰 플레이트를 가져 와서 웰 당 하나의 매트릭스 돔을 만듭니다. 20마이크로리터 피펫을 사용하여 오가노이드 공동 배양을 포함하는 매트릭스 돔에 200마이크로리터의 사전 예열된 ER 저 배지를 추가하고 상피 오가노이드만 포함하는 각 매트릭스 돔에 ENR 배지를 추가합니다. 접시를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%의 인큐베이터에 넣습니다.
그리고 처음 이틀 동안은 배지에 10 마이크로 몰 암석 억제제를 보충하십시오. 오가노이드 배지를 제거하고 200마이크로리터의 얼음처럼 차가운 PBS를 매트릭스 돔에 추가합니다. 플레이트를 5 내지 10분 동안 얼음 위에 놓은 후, 위아래로 피펫팅하고, 용액을 0.6 밀리리터의 비부착성 튜브로 옮긴다.
오가노이드가 바닥에 가라앉을 수 있도록 100G에서 30-60초 동안 잠시 원심분리합니다. 과잉 액체를 제거한 후 얼음처럼 차가운 PBS를 튜브에 넣고 30-60초 동안 다시 원심분리합니다. 앞서 그림과 같이 여분의 액체를 제거하고 얼음 위에서 200분 동안 PBS 용액에 4마이크로리터의 차가운 포름알데히드로 오가노이드를 30분 동안 고정합니다.
오가노이드가 가라앉도록 튜브를 똑바로 세우고 포름알데히드를 제거합니다. 500마이크로리터의 차가운 PBS를 첨가하여 남은 포름알데히드를 씻어냅니다. 과량의 PBS를 제거한 후, 500 마이크로리터의 블로킹 버퍼를 첨가한다.
튜브를 실온에서 60분 동안 로커 셰이커에 놓습니다. 블로킹 버퍼를 제거하고 1차 항체가 있는 200마이크로리터의 블로킹 버퍼에 오가노이드를 다시 현탁합니다. 오가노이드를 섭씨 4도에서 밤새 로커 셰이커에 다시 놓습니다.
1차 항체 혼합물을 제거하고 PBS에서 0.02% Triton X 100 500마이크로리터를 사용하여 실온에서 60분 동안 오가노이드를 세척합니다. 이것을 세 번 반복하십시오. 유사하게, 세척 완충액을 제거하고, 섭씨 4도에서 밤새 블로킹 완충액에 200 마이크로리터의 형광 접합 2차 항체를 첨가한다.
PBS에서 0.02% Triton X 100을 사용하여 오가노이드를 다시 세척한 다음 500마이크로리터의 PBS를 사용합니다. 과량의 액체를 모두 제거한 후 오가노이드에 10마이크로리터의 투명 용액을 넣고 실온에서 15분 동안 배양합니다. 현미경 슬라이드에 0.05mm 양면 끈적끈적한 4웰 스페이서를 놓습니다.
오가노이드와 함께 10마이크로리터의 세척 용액을 하나의 웰에 추가하고 스페이서 위에 커버 슬립을 놓습니다. 컨포칼 현미경 시스템을 사용하여 이미지를 획득합니다. 식도 전구 세포는 고도로 통합된 베타 4 및 e-cadherin 발현에 따라 분류됩니다.
상피 세포 분리의 대표적인 유세포 분석 플롯은 모든 단일 세포에서 살아있는 세포의 백분율을 보여줍니다. 모든 살아있는 세포로부터 단리된 인테그린 베타4 및 e-카데린 전구체 세포의 백분율이 여기에 제시되어 있다. 여기에 표시된 유세포 분석 플롯은 분리된 DPP4+ 및 Pdgf 수용체 알파 양성 섬유아세포의 백분율을 나타냅니다.
Pdgf 수용체 알파 H2 BEGFP 양성 섬유아세포와 공동 배양된 오가노이드를 사용한 명시야 이미지는 핵 EGFP 신호를 보여줍니다. 6일째 되는 날 전체 매트릭스 돔의 명시야 이미지가 여기에 표시됩니다. 오가노이드 형성 효율은 이 그래픽 이미지로 표현됩니다.
각 점은 행렬 돔을 나타내고 막대는 조건당 모든 점의 평균을 나타냅니다. Pdgf 수용체 알파 양성 섬유아세포와 공동 배양한 6일째 오가노이드의 명시야 및 형광 이미지가 여기에 표시됩니다. 공동 배양된 오가노이드의 전체 마운트 이미지는 비멘틴 양성 섬유아세포가 오가노이드를 감싸고 밀접하게 접촉하는 오가노이드의 3D 표면을 보여줍니다.
Pdgf 수용체 알파 양성 섬유아세포가 있는 단일 및 공동 배양된 오가노이드의 전체 마운트 염색은 뚜렷한 기저 및 기저상 세포 집단을 나타냅니다. 오가노이드 형성 효율 뿐만 아니라 오가노이드 크기는 공배양에 포함된 섬유아세포에 의해 영향을 받습니다. 다른 섬유아세포 하위 집단을 사용할 때 변형 및 결과가 예상됩니다.
동일한 전략을 사용하여 마우스와 인간 모두에서 종양 관련 섬유아세포를 특성화할 수 있습니다.
