Name: isolating and culturing vestibular and spiral ganglion somata from neonatal rodents for patch-clamp recordings
Uploaded: 2023-04-21T12:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating and Culturing Vestibular and Spiral Ganglion Somata from Neonatal Rodents for Patch-Clamp Recordings at JoVE.com

Vi anerkender Dr. Jing Bing Xue og Ruth Anne Eatock for deres tidlige bidrag til disse metoder. Dette arbejde blev støttet af NIH NIDCD R03 DC012652 og NIH NIDCD DC012653S, og R01 DC0155512 til RK og T32 DC009975 til DB, NN og KR.

Al brug af dyr, der er beskrevet her, er godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved University of Southern California. Dyr i denne protokol er P3- til P25-alderen Long Evans rotter af begge køn opnået fra Charles River Laboratories, men disse metoder kan anvendes på andre gnaverstammer. En laboratoriefrakke og handsker skal bæres under alle procedurer samt stænkbeskyttende beskyttelsesbriller, når der laves løsninger.
1. Forberedelser
<p class="jove_c...

<ol>
	<li>Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-neuron+labeling+in+the+cat+auditory+nerve.">Single-neuron labeling in the cat auditory nerve.</a> Science. 216 (4551), 1239-1241 (1982).</li><li>Goldberg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Afferent+diversity+and+the+organization+of+central+vestibular+pathways.">Afferent diversity and the organization of central vestibular pathways.</a> Experimental Brain Research. 130 (3), 277-297 (2000).</li><li>Kalluri, R., Xue, J., Eatock, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channels+set+spike+timing+regularity+of+mammalian+vestibular+afferent+neurons.">Ion channels set spike timing regularity of mammalian vestibular afferent neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 104 (4), 2034-2051 (2010).</li><li>Smith, C. E., Goldberg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stochastic+afterhyperpolarizaton+model+of+repetitive+activity+in+vestibular+afferents.">A stochastic afterhyperpolarizaton model of repetitive activity in vestibular afferents.</a> Biological Cybernetics. 54 (1), 41-51 (1986).</li><li>Berglund, A. M., Ryugo, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+cell+innervation+by+spiral+ganglion+neurons+in+the+mouse.">Hair cell innervation by spiral ganglion neurons in the mouse.</a> The Journal of Comparative Neurology. 255 (4), 560-570 (1987).</li><li>Jagger, D. J., Housley, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+properties+of+type+II+spiral+ganglion+neurones+identified+in+a+neonatal+rat+cochlear+slice.">Membrane properties of type II spiral ganglion neurones identified in a neonatal rat cochlear slice.</a> Journal of Physiology. 552, 525-533 (2003).</li><li>Reid, M. A., Flores-Otero, J., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firing+patterns+of+type+II+spiral+ganglion+neurons+in+vitro).">Firing patterns of type II spiral ganglion neurons in vitro).</a> The Journal of Neuroscience. 24 (3), 733-742 (2004).</li><li>Lv, P., Wei, D., Yamoah, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kv7-type+channel+currents+in+spiral+ganglion+neurons:+involvement+in+sensorineural+hearing+loss.">Kv7-type channel currents in spiral ganglion neurons: involvement in sensorineural hearing loss.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285 (45), 34699-34707 (2010).</li><li>Mo, Z. L., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+firing+patterns+of+murine+spiral+ganglion+neurons.">Endogenous firing patterns of murine spiral ganglion neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 77 (3), 1294-1305 (1997).</li><li>Almanza, A., Luis, E., Mercado, F., Vega, R., Soto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+identity,+ontogeny,+and+cAMP+modulation+of+the+hyperpolarization-activated+current+in+vestibular+ganglion+neurons.">Molecular identity, ontogeny, and cAMP modulation of the hyperpolarization-activated current in vestibular ganglion neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 108 (8), 2264-2275 (2012).</li><li>Horn, R., Marty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscarinic+activation+of+ionic+currents+measured+by+a+new+whole-cell+recording+method.">Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method.</a> The Journal of General Physiology. 92 (2), 145-159 (1988).</li><li>Grant, L., Yi, E., Goutman, J. D., Glowatzki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+recordings+at+afferent+dendrites+contacting+cochlear+inner+hair+cells:+Monitoring+multivesicular+release+at+a+ribbon+synapse.">Postsynaptic recordings at afferent dendrites contacting cochlear inner hair cells: Monitoring multivesicular release at a ribbon synapse.</a> Journal of Visualized Experiments. (48), e2442 (2010).</li><li>Bronson, D., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscarinic+acetylcholine+receptors+modulate+HCN+channel+properties+in+vestibular+ganglion+neurons.">Muscarinic acetylcholine receptors modulate HCN channel properties in vestibular ganglion neurons.</a> The Journal of Neuroscience. 43 (6), 902-917 (2023).</li><li>Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+components+of+membrane+conductance+in+the+giant+axon+of+Loligo.">The components of membrane conductance in the giant axon of Loligo.</a> The Journal of Physiology. 116 (4), 473-496 (1952).</li><li>Chabbert, C., Chambard, J. M., Valmier, J., Sans, A., Desmadryl, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-activated+sodium+currents+in+acutely+isolated+mouse+vestibular+ganglion+17eurons.">Voltage-activated sodium currents in acutely isolated mouse vestibular ganglion 17eurons.</a> Neuroreport. 8 (5), 1253-1256 (1997).</li><li>Bean, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+action+potential+in+mammalian+central+neurons.">The action potential in mammalian central neurons.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 8 (6), 451-465 (2007).</li><li>Izhikevich, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Dynamical Systems in Neuroscience. , (2018).</li><li>Chabbert, C., Chambard, J. M., Sans, A., Desmadryl, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+types+of+depolarization-activated+potassium+currents+in+acutely+isolated+mouse+vestibular+neurons.">Three types of depolarization-activated potassium currents in acutely isolated mouse vestibular neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 85 (3), 1017-1026 (2001).</li><li>Risner, J. R., Holt, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+potassium+conductances+contribute+to+the+diverse+firing+properties+of+postnatal+mouse+vestibular+ganglion+neurons.">Heterogeneous potassium conductances contribute to the diverse firing properties of postnatal mouse vestibular ganglion neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 96 (5), 2364-2376 (2006).</li><li>Iwasaki, S., Chihara, Y., Komuta, Y., Ito, K., Sahara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-voltage-activated+potassium+channels+underlie+the+regulation+of+intrinsic+firing+properties+of+rat+vestibular+ganglion+cells.">Low-voltage-activated potassium channels underlie the regulation of intrinsic firing properties of rat vestibular ganglion cells.</a> Journal of Neurophysiology. 100 (4), 2192-2204 (2008).</li><li>Cervantes, B., Vega, R., Lim&#243;n, A., Soto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identity,+expression+and+functional+role+of+the+sodium-activated+potassium+current+in+vestibular+ganglion+afferent+neurons.">Identity, expression and functional role of the sodium-activated potassium current in vestibular ganglion afferent neurons.</a> Neuroscience. 240, 163-175 (2013).</li><li>Biel, M., Wahl-Schott, C., Michalakis, S., Zong, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperpolarization-activated+cation+channels:+From+genes+to+function.">Hyperpolarization-activated cation channels: From genes to function.</a> Physiological Reviews. 89 (3), 847-885 (2009).</li><li>Davis, R. L., Crozier, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+firing+properties+of+type+I+spiral+ganglion+neurons.">Dynamic firing properties of type I spiral ganglion neurons.</a> Cell and Tissue Research. 361 (1), 115-127 (2015).</li><li>Reijntjes, D. O. J., Pyott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+afferent+signaling+complex:+Regulation+of+type+I+spiral+ganglion+neuron+responses+in+the+auditory+periphery.">The afferent signaling complex: Regulation of type I spiral ganglion neuron responses in the auditory periphery.</a> Hearing Research. 336, 1-16 (2016).</li><li>Eatock, R. A., Christov, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ionic Conductances of Vestibular Afferent Neurons: Shaping Head Motion Signals From the Inner Ear. , (2020).</li><li>Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similarities+in+the+biophysical+properties+of+spiral-ganglion+and+vestibular-ganglion+neurons+in+neonatal+rats.">Similarities in the biophysical properties of spiral-ganglion and vestibular-ganglion neurons in neonatal rats.</a> Frontiers in Neuroscience. 15, 710275 (2021).</li><li>Armstrong, C. E., Roberts, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+properties+of+frog+saccular+hair+cells:+distortion+by+enzymatic+dissociation.">Electrical properties of frog saccular hair cells: distortion by enzymatic dissociation.</a> The Journal of Neuroscience. 18 (8), 2962-2973 (1998).</li><li>Rocha-Sanchez, S. M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+expression+of+Kcnq4+in+vestibular+neurons+and+neurosensory+epithelia.">Developmental expression of Kcnq4 in vestibular neurons and neurosensory epithelia.</a> Brain Research. 1139, 117-125 (2007).</li><li>Meredith, F. L., Rennie, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zonal+variations+in+K++currents+in+vestibular+crista+calyx+terminals.">Zonal variations in K+ currents in vestibular crista calyx terminals.</a> Journal of Neurophysiology. 113 (1), 264-276 (2015).</li><li>Cai, H. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-dependent+activity+of+primary+auditory+neurons+in+the+presence+of+neurotrophins+and+antibiotics.">Time-dependent activity of primary auditory neurons in the presence of neurotrophins and antibiotics.</a> Hearing Research. 350, 122-132 (2017).</li><li>Needham, K., Nayagam, B. A., Minter, R. L., O'Leary, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+application+of+brain-derived+neurotrophic+factor+and+neurotrophin-3+and+its+impact+on+spiral+ganglion+neuron+firing+properties+and+hyperpolarization-activated+currents.">Combined application of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 and its impact on spiral ganglion neuron firing properties and hyperpolarization-activated currents.</a> Hearing Research. 291 (1-2), 1-14 (2012).</li><li>Adamson, C. L., Reid, M. A., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposite+actions+of+brain-derived+neurotrophic+factor+and+neurotrophin-3+on+firing+features+and+ion+channel+composition+of+murine+spiral+ganglion+neurons.">Opposite actions of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 on firing features and ion channel composition of murine spiral ganglion neurons.</a> The Journal of Neuroscience. 22 (4), 1385-1396 (2002).</li><li>Zhou, Z., Liu, Q., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+regulation+of+spiral+ganglion+neuron+firing+patterns+by+neurotrophin-3.">Complex regulation of spiral ganglion neuron firing patterns by neurotrophin-3.</a> The Journal of Neuroscience. 25 (33), 7558-7566 (2005).</li><li>Liu, X. -. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+channel+diversity+in+the+vestibular+ganglion:+NaV1.5,+NaV1.8,+and+tetrodotoxin-sensitive+currents.">Sodium channel diversity in the vestibular ganglion: NaV1.5, NaV1.8, and tetrodotoxin-sensitive currents.</a> Journal of Neurophysiology. 115 (5), 2536-2555 (2016).</li></ol>

De metoder, der præsenteres her, er specifikke for optagelser fra isolerede neuroner; Tidligere undersøgelser har fokuseret på optagelser fra axonterminaler i et semi-intakt præparat. Sammenlignet med eksisterende terminaloptagelsesteknikker tilbyder isolerede optagelser overlegen rumklemme og iso-potentiel adfærd. Derudover giver denne protokol adgang til en bredere prøve af neuroner, da kun calyxbærende subpopulationer er tilgængelige i semi-intakte optagelser af den vestibulære epitel. Endelig giver isolerede...

De bipolære neuroner i vestibulocochlear nerven forbinder de sensoriske hårceller i det indre øre til hjernestammen. De er de vigtigste bærere af information om lyd og hovedbevægelser; Skader på disse vigtige celler fører til døvhed og balanceforstyrrelser. De vestibulære og auditive dele af nerven består hver især af forskellige celletyper, der er morfologisk og funktionelt forskellige 1,2. I det vestibulære system skyder to afferente subpopulationer spontant med intervaller, der enten er regelmæssige eller uregelmæssige2. Afferent spike timing menes at afspejle en underliggende mangfoldighed i ionkanalsammensætning 3,4. I det auditive system er der to hovedunderpopulationer af spiralganglionneuroner (SGN'er); Mens type I SGN'er kommer i kontakt med individuelle indre hårceller5, kommer type II SGN'er i kontakt med flere ydre hårceller5. In vitro-optagelser fra semiintakte og organotypiske kulturer tyder på forskelle i membranegenskaberne af type I og type II SGN 6,7.
Mange ionkanaler og neurotransmitterreceptorer, der findes ved terminalerne af disse neuroner, findes også i deres cellelegemer. Som sådan kan kulturer af den isolerede vestibulære og spiralganglionsomata studeres in vitro for at forstå, hvordan ionkanaler og neurotransmitterreceptorer bidrager til responsen af disse neuroner. Den kompakte morfologi af de isolerede cellelegemer muliggør elektriske optagelser af høj kvalitet, der er egnede til detaljeret karakterisering af spændingsstyrede ionkanaler og neurotransmitterreceptorer. Nem adgang til en repræsentativ række neuronundertyper giver mulighed for high-throughput analyse af cellediversitet.
Denne artikel præsenterer en metode til isolering og dyrkning af dissocierede ganglioncellelegemer fra den overordnede del af den vestibulære ganglion hos rotter på postnatal dag (P)9 til P20. Der gives også forslag til udvidelse af disse metoder til spiralganglion ud over de trin, der kræves for vellykket ekstraktion, dissociering og plettering af ganglioncellerne. Disse metoder er en videreudvikling af dem, der er udtænkt i publikationer fra forskellige laboratorier 8,9,10. Også inkluderet i dette papir er vejledning til udvælgelse af sunde celler til patch-clamp optagelser.
Endelig skitserer protokollen proceduren for patch-clamp-optagelse ved hjælp af perforeret patch-konfiguration11. Selvom konfigurationen med perforeret patch er mere tidskrævende og mere teknisk udfordrende end den mere almindelige ruptured-patch-konfiguration, er den bedre til at opretholde det cytoplasmatiske miljø, der giver mulighed for lange og stabile optagelsessessioner. Fordelene ved denne optagelseskonfiguration illustreres her gennem den forbedrede stabilitet af hyperpolarisationsaktiverede kationiske strømme i perforeret patch i forhold til bristede patch-optagelser.
Denne protokol er organiseret i fem sektioner. Afsnit 1-3 beskriver løsninger og værktøjer, der kan forberedes og opbevares på forhånd. Afsnit 4 beskriver trinene til dissekering og plettering af vestibulære og SGN'er. Afsnit 5 beskriver trinene til optagelse fra neuronerne efter en periode i kultur. I vores hænder udføres afsnit 4 og afsnit 5 over en periode på 2 på hinanden følgende dage.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amphotericin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4888-100MG</td>
			<td>For perforated patch recordings.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP di-sodium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7699</td>
			<td>Additive to internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement (50x), serum free</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td>additive to culture medium, for SGN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beakers (1000, 100, 10) milliliter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bench-top centrifuge</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2641-0016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen burner</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>1311-01</td>
			<td>Additive to internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5318</td>
			<td>one out of three enzyme to digest tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass, rectangular, #1 thickness, 22x40&#160;</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>90082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I,from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11284932001</td>
			<td>one out of three enzyme to digest tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #3 Forceps (Blunt)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11231-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps (Fine)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 Forceps (Fine)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E0396</td>
			<td>Additive to internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Puller</td>
			<td>Narashige</td>
			<td>PC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epi-illumination light source&#160;</td>
			<td>Zeiss&#160;</td>
			<td>CL 1500 ECO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2716</td>
			<td>for cleaning head and around dissection bench</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filamented Borosilicate Capillaries for electrodes</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF140-117-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-edged dissection blade</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10010-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur Pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14673-010</td>
			<td>to pull trituration pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16140063</td>
			<td>additive to culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375-100G</td>
			<td>for pH buffering all solutions in protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate / magnetic stirrers&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76549-914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulated bucket filled with ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>to keep all samples and solutions cool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2SO4, Potassium Sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9458-250G</td>
			<td>Additive to internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P93333</td>
			<td>Additive to internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH (1 M)</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>319376-500ML</td>
			<td>To bring internal solution to desired pH.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14133-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz medium&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L4386</td>
			<td>dissection and bath solutions&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-profile-bath recording chamber for culture dishes</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>luer-lok syringes, 30 ml</td>
			<td>BD</td>
			<td>302832</td>
			<td>for drawing L-15/HEPES/HEPES solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM + Glutamax Supplement</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>41-090-101</td>
			<td>base of the culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2-Hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1028</td>
			<td>Additive to internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microFil needle for filling micropipettes - 34 gauge&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MF34G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narashige</td>
			<td>MF-90</td>
			<td>For electrode polishing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>additiive to culture medium, for SGN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Additive to internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH (1 M)</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>319511-500ML</td>
			<td>for titration pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmometer</td>
			<td>Advanced Instruments Inc.</td>
			<td>3320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen, Medical grade, with adequate regulator and tubing</td>
			<td>USC Material Management</td>
			<td>MEDOX200 (Identifier: 00015)</td>
			<td>for dissolving into dissection and bath solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette bulb (3 ml)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-448-25</td>
			<td>bulb for trituration pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>additive to prevent contamination of culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital based euthanasia solution (e.g., Fatal Plus. 50 &#8211; 60 mg/kg dosing)&#160;</td>
			<td>MWI Animal Health</td>
			<td>15199</td>
			<td>for euthanasia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PES membrane filters ,&#160; 0.2 micrometer&#160;</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>566-0020</td>
			<td>for filtering solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PES membrane sterile syringe filters, 0.22 um, 30 mm&#160;</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229747</td>
			<td>for filtering solutions drawn into syringes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 35 x 10 mm</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>32-103</td>
			<td>for micro dissection and to hold Tip dip solution in perforated-patch configuration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes, 60 x 15 mm</td>
			<td>Midland Scientific</td>
			<td>P7455</td>
			<td>for gross dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>Model S20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettors (1000, 200, 10) microliter</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-d-lysine coated glass bottomed culture dish</td>
			<td>Mattek</td>
			<td>P35GC-0-10-C</td>
			<td>to plate neurons for culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick change platform, heated base, for 35 mm culture dishes</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reference Cell</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>RC1T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>4-315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scientific Scale</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>XS64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes (10, 25) milliliter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Grease Kit (for sealing coverglass and chamber)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Animal Guillotine</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>DCAP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small animal guillotine</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>DCAP</td>
			<td>for decapitation if dissecting rats older than P15.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Dissection Microscope&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (3, 10, 30) milliliter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1426</td>
			<td>one out of three enzyme to digest tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuberculin syringe&#160;</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>8881500105</td>
			<td>for delivering euthanasia solution by intraperitoneal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissor, 2.5 mm Cutting Edge</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volumetric flask, 1000 milliliter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>VWR</td>
			<td>945300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, sterile u ltrapure, R&#62;18.18 megaOhms cm (e.g., filtered by a Millipore-Sigma water purification system)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>CDUFBI001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating and culturing vestibular and spiral ganglion somata from neonatal rodents for patch-clamp recordings

Den kompakte morfologi af isolerede og dyrkede ganglionneuroner i det indre øre muliggør detaljerede karakteriseringer af ionkanalerne og neurotransmitterreceptorerne, der bidrager til cellediversitet på tværs af denne population. Denne protokol skitserer de trin, der er nødvendige for vellykket dissekering, dissociering og kortvarig dyrkning af somata af bipolære neuroner i det indre øre med henblik på patch-clamp-optagelser. Detaljerede instruktioner til fremstilling af vestibulære ganglionneuroner er forsynet med de nødvendige modifikationer, der er nødvendige til plettering af spiralganglionneuroner. Protokollen indeholder instruktioner til udførelse af helcelle patch-clamp-optagelser i perforeret patch-konfigurationen. Eksempelresultater, der karakteriserer spændingsklemmeoptagelserne af hyperpolariseringsaktiverede cykliske nukleotid-gated (HCN)-medierede strømme, fremhæver stabiliteten af perforeret patch-optagelseskonfiguration sammenlignet med den mere standard ruptured-patch-konfiguration. Kombinationen af disse metoder, isolerede somata plus perforerede patch-clamp-optagelser, kan bruges til at studere cellulære processer, der kræver lange, stabile optagelser og bevarelse af intracellulært miljø, såsom signalering gennem G-proteinkoblede receptorer.

Kørsel af spændingsklemmeprotokoller ved at anvende familier af spændingstrin afslører den spændingsafhængige aktivering af en række forskellige strømfamilier. Repræsentative eksempler på helcellestrømme fremkaldt fra et VGN og tilpasset fra offentliggjorte optagelser13 er vist i figur 1A,B. Anvendelse af depolariserende spændinger (figur 1B) aktiverer en indadgående strøm (negativ ved konvention), der aktiv...

Watch this Scientific Journal Video about Isolating and Culturing Vestibular and Spiral Ganglion Somata from Neonatal Rodents for Patch-Clamp Recordings at JoVE.com

Isolating and Culturing Vestibular and Spiral Ganglion Somata from Neonatal Rodents for Patch-Clamp Recordings

Her præsenteres metoder, der giver detaljerede instruktioner til dissekering, dissociering, dyrkning og patch-clamp-optagelse fra vestibulær ganglion og spiralganglionneuroner i det indre øre.

Isolering og dyrkning af vestibulær og spiralganglionsomata fra neonatale gnavere til patch-clamp-optagelser

The compact morphology of isolated and cultured inner ear ganglion neurons allows for detailed characterizations of the ion channels and neurotransmitter ...

Mange ionkanaler og neurotransmitterreceptorer, der findes ved terminalerne af auditive og vestibulære afferente neuroner, findes også i deres cellelegemer. Kulturer af isolerede cellelegemer kan studeres in vitro for at forstå, hvordan disse ionkanaler og receptorer påvirker neuronernes reaktioner. Cellelegemernes kompakte morfologi giver mulighed for elektriske optagelser af høj kvalitet til at karakterisere de spændingsafhængige egenskaber af ionkanalerne og neurotransmitterreceptorerne.Desuden giver nem adgang til en lang række celletyper mulighed for høj gennemstrømning ved en fysisk analyse af cellediversitet. Procedurerne vil blive demonstreret af kandidatstuderende Katherine Regalado sammen med postdocs, Dr. Daniel Bronson og Nathaniel Nowak fra mit laboratorium. Til at begynde med skal du holde en glasgræspipette til flammen på en Bunsen-brænder for at forberede tritrationspipetter til celledissociation.Når glasspidsen begynder at smelte, strækkes glasset ud til den ønskede spidsdiameter. Træk den ene ende af pipetten væk fra flammen for at skabe en lille bøjning. Placer den bøjede pipette under et mikroskop.Brug en scoringsflise til at score og bryde glasset med den ønskede diameter. Før pipettespidsen over toppen af brænderflammen. Dette vil hurtigt polere de ru kanter nær spidsen.Øs hjernen på den aflivede mus ud ved hjælp af lukket kirurgisk saks. Afbryd og fjern kranienerven for helt at løsne hjernen fra kraniet. Start på bagsiden af hovedet, træk det klare membranøse materiale af med tang, og skær derefter toppen af kraniet ud ved hjælp af kirurgisk saks.Fjern overskydende væv fra bagsiden af hoved og nakke for at gøre dissektionsområdet og otisk kapsel renere og lettere at få adgang til. Overfør vævet til en anden petriskål med frisk L-15-opløsning. Find derefter den otiske kapsel og de auditive, overlegne, vestibulære og ringere vestibulære nerver.Adskil de overlegne og ringere ganglier ved hjælp af en lille fjedersaks og skær den auditive nerve væk. Brug en skalpel til forsigtigt at barbere den benede ryg af for at svække det benede område, hvorunder nerven dykker ned i knoglekapslen. Fjern forsigtigt snavset med en skalpel, og udsæt hele den hævede del af ganglionen.Brug den fine fjedersaks til at klippe og adskille ganglionen fra den perifere nervegren, der dykker mod utricleen. Fjern den overlegne ganglion ved hjælp af fine tang og overfør den til en 35 millimeter petriskål med frisk L-15-opløsning. Efter forvarmning af enzymopløsningen hældes enzymblandingen i en 35 millimeter petriskål og anbringes i en 37 grader Celsius inkubator i 10 til 15 minutter.Rens ganglionen ved hjælp af fine tang og små fjedersaks ved at fjerne knogle, overskydende væv, nervefibre og andre overflødige strukturer. Pas på at minimere fjernelsen af ganglionisk væv. Overfør de rensede ganglier til den forvarmede enzymopløsning og læg den tilbage i inkubatoren i 10 til 40 minutter.Overfør derefter ganglierne til 35 millimeter petriskålen med frisk L-15-opløsning. Efter to til tre minutter overføres ganglierne til en anden 35 millimeter petriskål fyldt med filtrerede kulturmedier. Overfør ca. 150 mikroliter filtrerede kulturmedier til en belagt glasbundskål.Overfør derefter det ønskede antal ganglier til dæksedlen. Træk en lille mængde kulturmedier ud af kulturskålen, og skyl tritrationspipetten med medium for at forhindre, at vævet klæber til siderne af glaspipetten. Triturere ved forsigtigt og gentagne gange at føre vævet gennem pipetten, indtil ganglierne er tilstrækkeligt dissocierede.Efter fem minutter skal du kontrollere under et lysmikroskop for at se, om cellerne har lagt sig på dæksedlen. Placer forsigtigt en kulturskål i en 37-graders Celsius-inkubator i 12 til 24 timer. Find derefter den otiske kapsel efter at have skåret hovedet og ekstraher det fra kraniet ved at skære væk i kanterne ved hjælp af tang.Den spiralformede del af den otiske kapsel huser cochlea med Corti-organet. Chip væk ved knoglen, overliggende cochlear drejninger med fine tang parallelt med knoglens kurve. Brug en lille fjedersaks til at skære modiolusen i bunden af cochlea for at frigøre den fra resten af den otiske kapsel.Skær Corti-orgelet i to eller tre omgange ved hjælp af en lille fjedersaks, så den ligger fladt, og skær modiolus fra hver tur. Fjern stria vaskularis ved at klemme stria i bunden med fine tang. Slap af rundt om spiralen og op til toppen for at skrælle den fri af Corti-organet.Fjern spiralganglionen ved at skære i kanten af, hvor spiralganglion-neuronfiberkanalerne projicerer mod hårcellerne, og rengør derefter ganglionen som vist tidligere. Efter enzymatisk behandling af spiralganglionen tritrates spiralganglionen i dyrkningsmediet suppleret med N2 og B27. Placer kulturskålen indeholdende de dissocierede ganglier i en 37 grader Celsius, 5% kuldioxidinkubator i 12 til 24 timer.Dyp pipettens spids i den rene opløsning af kulturskålen for at fylde den med en ren opløsning, der ikke indeholder amfotericin. Fyld pipettens bagside med den interne opløsning indeholdende amphotericin. Dyp pipettens spids tilbage i den rene opløsning af kulturskålen, mens amfotericinet langsomt trænger ind i spidsen fra pipettens bagside.Afslut derefter påfyldningen af pipetten med amphoterikinopløsningen på til to tredjedele af pipetten. Sænk pipetten ned i registreringskammerets bad, og placer pipettespidsen midt i synsfeltet. Sørg for, at spidsen er fri for luftbobler eller andet snavs.Placer pipetten tæt på membranen og land fast på midten af cellen. Påfør undertryk eller sug ved hjælp af en sprøjte eller mundpipette. Tænd for holdepotentialet på minus 60 millivolt.Tætningsmodstanden skal øges, indtil den passerer en giga ohm. Når der dannes en giga ohm-tætning, frigøres undertrykket. Før tyrosin begynder at arbejde, falder indgangsmodstanden langsomt, og strømmen, der strømmer som reaktion på spændingstrinnet på fem millivolt, øges gradvist, når amfotericinet kommer ind i membranen.De repræsentative eksempler på helcellestrømme fremkaldt fra en vestibulær ganglionneuron er vist i denne figur. De indadgående natriumstrømme identificeres her ved deres forbigående aktivering og inaktivering. Netto udadgående strømme bæres stort set af kaliumioner og har meget langsommere aktiverings- og inaktiveringskinetik end natriumstrømme.De hyperpolarisationsaktiverede cykliske nukleotidgated strømme eller HCN-strømme aktiveres af en familie af langvarige hyperpolariserende spændinger. Stabiliteten af ionkanalkarakterisering i det perforerede plaster på forskellige tidspunkter under optagelse er vist i denne figur. De spændingsafhængige aktiveringskurver for HCN-strømme blev målt i en perforeret patchkonfiguration.Kurven har en sigmoidal form og var stabil gennem en lang optagelse. Den relative ustabilitet af den bristede patch-tilstand illustreres af ikke-overlappende sigmoide kurver fra forskellige tidspunkter. Aktiveringskurverne for HCN-strømme under en bristet patchkonfiguration er vist her.Affyringsmønstrene i fem vestibulære ganglion somara, fem spiralganglionneuroner og de tilsvarende aktuelle trin er vist her. Denne heterogenitet i fyringsmønstre afspejler en grundlæggende mangfoldighed i sammensætningen af underliggende natrium- og kaliumkanaler i både vestibulære ganglionneuroner og spiralganglionneuroner. For at maksimere celleoverlevelsen under denne procedure skal du undgå at danne luftbobler, ikke overarbejde vævet og lade cellerne slå sig ned, før du placerer prøver i inkubatoren.Perforeret plasterklemme muliggør undersøgelse af ionkanaler, der moduleres af cytosoliske anden budbringere, hvilket er afgørende for at undersøge virkningerne af efferente neurotransmittere på ganglionneuroner. Patch clamp-optagelser af disse bipolære neuroner har været medvirkende til at afsløre, hvordan biofysisk mangfoldighed bidrager til funktionel mangfoldighed i sensoriske neuroner.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external ...

Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

Dyrkning og Elektrofysiologi af celler på NRcC Patch-clamp Chips

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard ...

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch clamp optagelser i indre øre-hårceller isoleret fra zebrafisk

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

<sub&gt; 1</sub&gt; F<sub&gt; O</sub&gt; ATPase Vehikelpræparationen og Teknik for Performing patchclamp Optagelser af Submitochondrial vesikelmembraner

Mitochondria are involved in many important cellular  functions including metabolism, survival1, development and, calcium signaling2. Two of the most ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

Isolering af sensoriske neuroner i<em&gt; Aplysia californica</em&gt; For patchclamp Optagelser af glutamaterge strømforhold

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Patchclamp Optagelser fra embryonale zebrafisk Mauthner Cells

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

Helcelle-patch-clamp Optagelser fra Morphologically- og Neurochemically identificerede Hippocampale interneuroner

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

Elektrofysiologiske og morfologiske karakterisering af neuronal Mikrokredsløb i akut Brain Skiver Brug parrede Patch-clamp optagelser

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...