Name: isolating and culturing vestibular and spiral ganglion somata from neonatal rodents for patch-clamp recordings
Uploaded: 2023-04-21T12:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating and Culturing Vestibular and Spiral Ganglion Somata from Neonatal Rodents for Patch-Clamp Recordings at JoVE.com

Jing Bing Xue博士とRuth Anne Eatock博士には、これらの方法への初期の貢献に感謝します。この研究は、NIH NIDCD R03 DC012652とNIH NIDCD DC012653S、R01 DC0155512 から RK に、T32 DC009975 から DB、NN、および KR の支援を受けました。

ここに記載されているすべての動物の使用は、南カリフォルニア大学の施設動物管理および使用委員会によって承認されています。このプロトコルの動物は、チャールズリバー研究所から入手した雌雄のP3〜P25年齢のロングエバンスラットですが、これらの方法は他のげっ歯類株にも適用できます。すべての手順では白衣と手袋を着用し、溶液を作るときは飛沫防止ゴーグルを着用する必要?...

<ol>
	<li>Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-neuron+labeling+in+the+cat+auditory+nerve.">Single-neuron labeling in the cat auditory nerve.</a> Science. 216 (4551), 1239-1241 (1982).</li><li>Goldberg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Afferent+diversity+and+the+organization+of+central+vestibular+pathways.">Afferent diversity and the organization of central vestibular pathways.</a> Experimental Brain Research. 130 (3), 277-297 (2000).</li><li>Kalluri, R., Xue, J., Eatock, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channels+set+spike+timing+regularity+of+mammalian+vestibular+afferent+neurons.">Ion channels set spike timing regularity of mammalian vestibular afferent neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 104 (4), 2034-2051 (2010).</li><li>Smith, C. E., Goldberg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stochastic+afterhyperpolarizaton+model+of+repetitive+activity+in+vestibular+afferents.">A stochastic afterhyperpolarizaton model of repetitive activity in vestibular afferents.</a> Biological Cybernetics. 54 (1), 41-51 (1986).</li><li>Berglund, A. M., Ryugo, D. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+firing+patterns+of+murine+spiral+ganglion+neurons.">Endogenous firing patterns of murine spiral ganglion neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 77 (3), 1294-1305 (1997).</li><li>Almanza, A., Luis, E., Mercado, F., Vega, R., Soto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+identity,+ontogeny,+and+cAMP+modulation+of+the+hyperpolarization-activated+current+in+vestibular+ganglion+neurons.">Molecular identity, ontogeny, and cAMP modulation of the hyperpolarization-activated current in vestibular ganglion neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 108 (8), 2264-2275 (2012).</li><li>Horn, R., Marty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscarinic+activation+of+ionic+currents+measured+by+a+new+whole-cell+recording+method.">Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method.</a> The Journal of General Physiology. 92 (2), 145-159 (1988).</li><li>Grant, L., Yi, E., Goutman, J. D., Glowatzki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+recordings+at+afferent+dendrites+contacting+cochlear+inner+hair+cells:+Monitoring+multivesicular+release+at+a+ribbon+synapse.">Postsynaptic recordings at afferent dendrites contacting cochlear inner hair cells: Monitoring multivesicular release at a ribbon synapse.</a> Journal of Visualized Experiments. (48), e2442 (2010).</li><li>Bronson, D., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscarinic+acetylcholine+receptors+modulate+HCN+channel+properties+in+vestibular+ganglion+neurons.">Muscarinic acetylcholine receptors modulate HCN channel properties in vestibular ganglion neurons.</a> The Journal of Neuroscience. 43 (6), 902-917 (2023).</li><li>Hodgkin, A. L., Huxley, A. 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M., Sans, A., Desmadryl, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+types+of+depolarization-activated+potassium+currents+in+acutely+isolated+mouse+vestibular+neurons.">Three types of depolarization-activated potassium currents in acutely isolated mouse vestibular neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 85 (3), 1017-1026 (2001).</li><li>Risner, J. R., Holt, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+potassium+conductances+contribute+to+the+diverse+firing+properties+of+postnatal+mouse+vestibular+ganglion+neurons.">Heterogeneous potassium conductances contribute to the diverse firing properties of postnatal mouse vestibular ganglion neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 96 (5), 2364-2376 (2006).</li><li>Iwasaki, S., Chihara, Y., Komuta, Y., Ito, K., Sahara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-voltage-activated+potassium+channels+underlie+the+regulation+of+intrinsic+firing+properties+of+rat+vestibular+ganglion+cells.">Low-voltage-activated potassium channels underlie the regulation of intrinsic firing properties of rat vestibular ganglion cells.</a> Journal of Neurophysiology. 100 (4), 2192-2204 (2008).</li><li>Cervantes, B., Vega, R., Lim&#243;n, A., Soto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identity,+expression+and+functional+role+of+the+sodium-activated+potassium+current+in+vestibular+ganglion+afferent+neurons.">Identity, expression and functional role of the sodium-activated potassium current in vestibular ganglion afferent neurons.</a> Neuroscience. 240, 163-175 (2013).</li><li>Biel, M., Wahl-Schott, C., Michalakis, S., Zong, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperpolarization-activated+cation+channels:+From+genes+to+function.">Hyperpolarization-activated cation channels: From genes to function.</a> Physiological Reviews. 89 (3), 847-885 (2009).</li><li>Davis, R. L., Crozier, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+firing+properties+of+type+I+spiral+ganglion+neurons.">Dynamic firing properties of type I spiral ganglion neurons.</a> Cell and Tissue Research. 361 (1), 115-127 (2015).</li><li>Reijntjes, D. O. J., Pyott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+afferent+signaling+complex:+Regulation+of+type+I+spiral+ganglion+neuron+responses+in+the+auditory+periphery.">The afferent signaling complex: Regulation of type I spiral ganglion neuron responses in the auditory periphery.</a> Hearing Research. 336, 1-16 (2016).</li><li>Eatock, R. A., Christov, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ionic Conductances of Vestibular Afferent Neurons: Shaping Head Motion Signals From the Inner Ear. , (2020).</li><li>Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similarities+in+the+biophysical+properties+of+spiral-ganglion+and+vestibular-ganglion+neurons+in+neonatal+rats.">Similarities in the biophysical properties of spiral-ganglion and vestibular-ganglion neurons in neonatal rats.</a> Frontiers in Neuroscience. 15, 710275 (2021).</li><li>Armstrong, C. E., Roberts, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+properties+of+frog+saccular+hair+cells:+distortion+by+enzymatic+dissociation.">Electrical properties of frog saccular hair cells: distortion by enzymatic dissociation.</a> The Journal of Neuroscience. 18 (8), 2962-2973 (1998).</li><li>Rocha-Sanchez, S. M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+expression+of+Kcnq4+in+vestibular+neurons+and+neurosensory+epithelia.">Developmental expression of Kcnq4 in vestibular neurons and neurosensory epithelia.</a> Brain Research. 1139, 117-125 (2007).</li><li>Meredith, F. L., Rennie, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zonal+variations+in+K++currents+in+vestibular+crista+calyx+terminals.">Zonal variations in K+ currents in vestibular crista calyx terminals.</a> Journal of Neurophysiology. 113 (1), 264-276 (2015).</li><li>Cai, H. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-dependent+activity+of+primary+auditory+neurons+in+the+presence+of+neurotrophins+and+antibiotics.">Time-dependent activity of primary auditory neurons in the presence of neurotrophins and antibiotics.</a> Hearing Research. 350, 122-132 (2017).</li><li>Needham, K., Nayagam, B. A., Minter, R. L., O'Leary, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+application+of+brain-derived+neurotrophic+factor+and+neurotrophin-3+and+its+impact+on+spiral+ganglion+neuron+firing+properties+and+hyperpolarization-activated+currents.">Combined application of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 and its impact on spiral ganglion neuron firing properties and hyperpolarization-activated currents.</a> Hearing Research. 291 (1-2), 1-14 (2012).</li><li>Adamson, C. L., Reid, M. A., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposite+actions+of+brain-derived+neurotrophic+factor+and+neurotrophin-3+on+firing+features+and+ion+channel+composition+of+murine+spiral+ganglion+neurons.">Opposite actions of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 on firing features and ion channel composition of murine spiral ganglion neurons.</a> The Journal of Neuroscience. 22 (4), 1385-1396 (2002).</li><li>Zhou, Z., Liu, Q., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+regulation+of+spiral+ganglion+neuron+firing+patterns+by+neurotrophin-3.">Complex regulation of spiral ganglion neuron firing patterns by neurotrophin-3.</a> The Journal of Neuroscience. 25 (33), 7558-7566 (2005).</li><li>Liu, X. -. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+channel+diversity+in+the+vestibular+ganglion:+NaV1.5,+NaV1.8,+and+tetrodotoxin-sensitive+currents.">Sodium channel diversity in the vestibular ganglion: NaV1.5, NaV1.8, and tetrodotoxin-sensitive currents.</a> Journal of Neurophysiology. 115 (5), 2536-2555 (2016).</li></ol>

ここで紹介する方法は、単離されたニューロンからの記録に固有のものです。これまでの研究では、半無傷の調製物における軸索終末からの記録に焦点が当てられてきた。既存の端子記録技術と比較すると、絶縁記録は優れたスペースクランプと等電位挙動を提供します。さらに、このプロトコルは、萼軸受の亜集団のみが前庭上皮の半無傷の記録でアクセス可能であるため、ニューロンの?...

前庭蝸牛神経の双極ニューロンは、内耳の感覚有毛細胞を脳幹に接続します。それらは、音と頭の動きに関する情報の主要な担い手です。これらの重要な細胞の損傷は、難聴や平衡障害につながります。神経の前庭部分と聴覚部分は、それぞれ形態学的および機能的に多様な異なる細胞タイプで構成されています1,2。前庭系では、2つの求心性亜集団が規則的または不規則な間隔で自発的に発火する2。求心性スパイクのタイミングは、イオンチャネル組成の根本的な多様性を反映していると考えられている3,4。聴覚系には、らせん神経節ニューロン(SGN)の2つの主要な亜集団があります。一方、I型SGNは個々の内有毛細胞に接触し5、II型SGNは複数の外有毛細胞5に接触する。セミインタクト培養および器官型培養からのin vitro記録は、I型SGNとII型SGNの膜特性の違いを示唆しています6,7。
これらのニューロンの末端に見られる多くのイオンチャネルと神経伝達物質受容体は、それらの細胞体にも見られます。そのため、単離された前庭およびらせん神経節体細胞の培養を in vitro で研究して、イオンチャネルと神経伝達物質受容体がこれらのニューロンの応答にどのように寄与するかを理解することができます。単離された細胞体のコンパクトな形態により、電位依存性イオンチャネルや神経伝達物質受容体の詳細な特性評価に適した高品質の電気記録が可能になります。代表的なニューロンサブタイプに簡単にアクセスできるため、細胞多様性のハイスループット解析が可能です。
本稿では、ラットの出生後(P)9〜P20に、前庭神経節の上層部から解離した神経節細胞体を単離して培養する方法を紹介します。また、神経節細胞の抽出、解離、およびプレーティングを成功させるために必要なステップに加えて、これらの方法をらせん状神経節に拡張するための提案も提供されています。これらの方法は、さまざまな研究所の出版物で考案された方法の進化形です8,9,10。また、この論文には、パッチクランプ記録用の健康な細胞を選択するためのガイダンスも含まれています。
最後に、プロトコルは、穿孔パッチ構成11を使用したパッチクランプ記録の手順を概説する。穿孔パッチ構成は、より一般的な破裂パッチ構成よりも時間がかかり、技術的にも困難ですが、細胞質環境を維持するのに優れているため、長時間安定した記録セッションが可能です。この記録構成の利点は、破裂パッチ記録と比較して、穴あきパッチの過分極活性化カチオン電流の安定性が向上することで示されています。
このプロトコルは 5 つのセクションに分かれています。セクション 1 から 3 では、事前に準備して保存できるソリューションとツールについて説明します。セクション4では、前庭およびSGNを解剖およびプレーティングするステップについて説明し、セクション5では、培養期間後のニューロンから記録するステップを説明します。私たちの手では、セクション4とセクション5は2日間連続して実行されます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amphotericin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4888-100MG</td>
			<td>For perforated patch recordings.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP di-sodium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7699</td>
			<td>Additive to internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement (50x), serum free</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td>additive to culture medium, for SGN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beakers (1000, 100, 10) milliliter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bench-top centrifuge</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2641-0016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen burner</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>1311-01</td>
			<td>Additive to internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5318</td>
			<td>one out of three enzyme to digest tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass, rectangular, #1 thickness, 22x40&#160;</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>90082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I,from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11284932001</td>
			<td>one out of three enzyme to digest tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #3 Forceps (Blunt)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11231-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps (Fine)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 Forceps (Fine)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E0396</td>
			<td>Additive to internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Puller</td>
			<td>Narashige</td>
			<td>PC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epi-illumination light source&#160;</td>
			<td>Zeiss&#160;</td>
			<td>CL 1500 ECO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2716</td>
			<td>for cleaning head and around dissection bench</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filamented Borosilicate Capillaries for electrodes</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF140-117-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-edged dissection blade</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10010-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur Pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14673-010</td>
			<td>to pull trituration pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16140063</td>
			<td>additive to culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375-100G</td>
			<td>for pH buffering all solutions in protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate / magnetic stirrers&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76549-914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulated bucket filled with ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>to keep all samples and solutions cool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2SO4, Potassium Sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9458-250G</td>
			<td>Additive to internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P93333</td>
			<td>Additive to internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH (1 M)</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>319376-500ML</td>
			<td>To bring internal solution to desired pH.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14133-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz medium&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L4386</td>
			<td>dissection and bath solutions&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-profile-bath recording chamber for culture dishes</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>luer-lok syringes, 30 ml</td>
			<td>BD</td>
			<td>302832</td>
			<td>for drawing L-15/HEPES/HEPES solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM + Glutamax Supplement</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>41-090-101</td>
			<td>base of the culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2-Hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1028</td>
			<td>Additive to internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microFil needle for filling micropipettes - 34 gauge&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MF34G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narashige</td>
			<td>MF-90</td>
			<td>For electrode polishing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>additiive to culture medium, for SGN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Additive to internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH (1 M)</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>319511-500ML</td>
			<td>for titration pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmometer</td>
			<td>Advanced Instruments Inc.</td>
			<td>3320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen, Medical grade, with adequate regulator and tubing</td>
			<td>USC Material Management</td>
			<td>MEDOX200 (Identifier: 00015)</td>
			<td>for dissolving into dissection and bath solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette bulb (3 ml)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-448-25</td>
			<td>bulb for trituration pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>additive to prevent contamination of culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital based euthanasia solution (e.g., Fatal Plus. 50 &#8211; 60 mg/kg dosing)&#160;</td>
			<td>MWI Animal Health</td>
			<td>15199</td>
			<td>for euthanasia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PES membrane filters ,&#160; 0.2 micrometer&#160;</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>566-0020</td>
			<td>for filtering solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PES membrane sterile syringe filters, 0.22 um, 30 mm&#160;</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229747</td>
			<td>for filtering solutions drawn into syringes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 35 x 10 mm</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>32-103</td>
			<td>for micro dissection and to hold Tip dip solution in perforated-patch configuration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes, 60 x 15 mm</td>
			<td>Midland Scientific</td>
			<td>P7455</td>
			<td>for gross dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>Model S20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettors (1000, 200, 10) microliter</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-d-lysine coated glass bottomed culture dish</td>
			<td>Mattek</td>
			<td>P35GC-0-10-C</td>
			<td>to plate neurons for culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick change platform, heated base, for 35 mm culture dishes</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reference Cell</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>RC1T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>4-315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scientific Scale</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>XS64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes (10, 25) milliliter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Grease Kit (for sealing coverglass and chamber)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Animal Guillotine</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>DCAP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small animal guillotine</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>DCAP</td>
			<td>for decapitation if dissecting rats older than P15.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Dissection Microscope&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (3, 10, 30) milliliter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1426</td>
			<td>one out of three enzyme to digest tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuberculin syringe&#160;</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>8881500105</td>
			<td>for delivering euthanasia solution by intraperitoneal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissor, 2.5 mm Cutting Edge</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volumetric flask, 1000 milliliter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>VWR</td>
			<td>945300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, sterile u ltrapure, R&#62;18.18 megaOhms cm (e.g., filtered by a Millipore-Sigma water purification system)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>CDUFBI001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating and culturing vestibular and spiral ganglion somata from neonatal rodents for patch-clamp recordings

単離および培養された内耳神経節ニューロンのコンパクトな形態により、この集団全体の細胞の多様性に寄与するイオンチャネルと神経伝達物質受容体の詳細な特性評価が可能になります。このプロトコルはパッチクランプ記録の為に内耳の両極ニューロンの体細胞の巧妙な解剖、解離および短期培養に必要なステップを概説する。前庭神経節ニューロンを調製するための詳細な指示は、らせん神経節ニューロンをプレーティングするために必要な修正とともに提供される。このプロトコルには、穴あきパッチ構成で全セルパッチクランプ記録を実行するための手順が含まれています。過分極活性化環状ヌクレオチド(HCN)媒介電流の電圧クランプ記録を特徴付ける結果の例は、より標準的な破裂パッチ構成と比較して、穴あきパッチ記録構成の安定性を強調しています。単離体細胞と穿孔パッチクランプ記録というこれらの方法の組み合わせは、Gタンパク質共役受容体を介したシグナル伝達など、長く安定した記録や細胞内環境の保存を必要とする細胞プロセスの研究に使用できます。

電圧ステップのファミリを印加して電圧クランププロトコルを実行すると、さまざまな電流ファミリの電圧依存的なアクティブ化が明らかになります。VGNから誘発され、公開された記録13から適応された全セル電流の代表例を図1A、Bに示す。脱分極電圧(図1B)を印加すると、非常に急速に活性化および不活性化する内?...

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Isolating and Culturing Vestibular and Spiral Ganglion Somata from Neonatal Rodents for Patch-Clamp Recordings

ここでは、内耳の前庭神経節および螺旋神経節ニューロンからの解剖、解離、培養、およびパッチクランプ記録の詳細な手順を提供する方法を示します。

パッチクランプ記録のための新生児げっ歯類からの前庭およびらせん状神経節体細胞の分離と培養

The compact morphology of isolated and cultured inner ear ganglion neurons allows for detailed characterizations of the ion channels and neurotransmitter ...

聴覚および前庭求心性ニューロンの末端に見られる多くのイオンチャネルおよび神経伝達物質受容体は、それらの細胞体にも見られます。単離された細胞体の培養をin vitroで研究することで、これらのイオンチャネルと受容体がニューロンの応答にどのように影響するかを理解することができます。細胞体のコンパクトな形態により、イオンチャネルと神経伝達物質受容体の電位依存性特性を特徴付けるための高品質の電気記録が可能になります。さらに、多種多様な細胞タイプに容易にアクセスできるため、細胞の多様性を物理的に分析することでハイスループットが可能になります。この手順は、大学院生のキャサリン・レガラドと、私の研究室のポスドク研究員であるダニエル・ブロンソン博士とナサニエル・ノワク博士によって実演されます。まず、ガラス製の牧草地ピペットをブンゼンバーナーの炎にかざし、細胞解離用のトリトレーションピペットを調製します。ガラスの先端が溶け始めたら、ガラスを希望の先端の直径まで伸ばします。ピペットの片方の端を炎から引き離し、小さな曲がりを作ります。曲がったピペットを顕微鏡の下に置きます。スコアリングタイルを使用して、希望の直径でガラスに切り込みを入れて割ります。ピペットチップをバーナーの炎の上に通します。これにより、先端付近の粗いエッジをすばやく磨きます。安楽死させたマウスの脳を、閉じた手術用ハサミですくい取ります。脳神経を切断して除去し、頭蓋骨から脳を完全に切り離します。後頭部から始めて、透明な膜状の材料を鉗子で引き剥がし、外科用ハサミを使用して頭蓋骨の上部を切り取ります。頭頸部の後ろから余分な組織を取り除き、解剖領域と耳嚢をきれいにし、アクセスしやすくします。新鮮なL-15溶液を入れた2番目のペトリ皿に組織を移します。次に、耳嚢と聴覚、上前庭神経、前庭神経、下前庭神経を見つけます。小さなスプリングハサミで上神経節と下神経節を分離し、聴覚神経を切り取ります。メスを使用して、骨の隆起をそっと剃り落とし、神経が骨嚢に潜る骨の領域を弱めます。メスで破片を慎重に取り除き、神経節の腫れた部分全体を露出させます。細いスプリングハサミを使用して、卵形嚢に向かって潜っている末梢神経枝から神経節を切断して分離します。細かい鉗子を使用して上神経節を切除し、新鮮なL-15溶液を入れた35ミリメートルのペトリ皿に移します。酵素溶液を予熱した後、酵素混合物を35ミリメートルのシャーレに注ぎ、摂氏37度のインキュベーターに10〜15分間入れます。細かい鉗子と小さなスプリングハサミを使用して、骨、余分な組織、神経線維、およびその他の余分な構造を取り除き、神経節をきれいにします。神経節組織の除去を最小限に抑えるように注意してください。洗浄した神経節を予熱した酵素溶液に移し、インキュベーターに10〜40分間戻します。次に、神経節を新鮮なL-15溶液を入れた35ミリメートルのシャーレに移します。2〜3分後、神経節をろ過した培地で満たされた別の35ミリメートルのシャーレに移します。約150マイクロリットルのろ過した培地を、コーティングされたガラス底のディッシュに移します。次に、必要な数の神経節をカバースリップに移します。培養皿から少量の培地を取り出し、トリトレーションピペットを培地ですすぎ、組織がガラスピペットの側面にくっつかないようにします。神経節が十分に解離するまで、組織をピペットに穏やかに繰り返し通すことにより、粉砕します。5分後、光学顕微鏡で細胞がカバースリップに沈殿しているかどうかを確認します。培養皿を摂氏37度のインキュベーターに12〜24時間慎重に入れます。次に、頭を二等分した後、耳嚢を見つけ、鉗子を使用して端を削って頭蓋骨から抽出します。耳嚢のらせん状の部分には、コルチの器官を備えた蝸牛があります。骨を削り取り、骨のカーブに平行な細い鉗子で蝸牛ターンを覆います。小さなスプリングハサミを使用して、蝸牛の基部にあるモディオルスを切断し、耳嚢の残りの部分から解放します。コルティの器官を小さなバネハサミを使って平らになるように2〜3回転に切り、各回転からモディオルスを切除します。細い鉗子で基部の線条をつまんで、線条血管を取り除きます。螺旋の周りを巻き、頂点まで巻き戻して、コルティの器官から剥がします。らせん神経節ニューロン線維路が有毛細胞に向かって突出する場所の端を切断してらせん神経節を取り除き、前述のように神経節をきれいにします。らせん状神経節を酵素的に処理した後、N2およびB27を添加した培地中でらせん状神経節をトリトレートします。解離した神経節を含む培養皿を摂氏37度、5%二酸化炭素インキュベーターに12〜24時間置きます。ピペットの先端を培養皿の清浄液に浸し、アムホテリシンを含まない清浄な溶液で満たします。ピペットの背面にアムホテリシンを含む内部溶液を入れます。ピペットの先端を培養皿の清浄な溶液に戻し、アムホテリシンがピペットの背面からゆっくりと先端に入ります。次に、ピペットの3分の2までのアムホテリシン溶液をピペットに充填し終えます。ピペットを記録チャンバーの槽に下ろし、ピペットチップを視野の中央に配置します。先端に気泡やその他の破片がないことを確認してください。ピペットをメンブレンの近くに置き、細胞の中心にしっかりと着地させます。シリンジまたはマウスピペットを使用して陰圧または吸引を加えます。マイナス60ミリボルトの保持電位をオンにします。シール抵抗は、ギガオームを通過するまで増加する必要があります。ギガオームのシールが形成されたら、負圧を解放します。チロシンが働き始める前に、入力抵抗はゆっくりと減少し、5ミリボルトの電圧ステップに応答して流れる電流は、アムホテリシンが膜に入るにつれて徐々に増加します。前庭神経節ニューロンから誘発される全細胞電流の代表例をこの図に示します。ここでは、正味の内向きのナトリウム電流が、その過渡的な活性化と不活性化によって識別されます。正味の外向きの電流は、主にカリウムイオンによって運ばれ、ナトリウム電流よりもはるかに遅い活性化および不活性化速度論を持っています。過分極活性化サイクリックヌクレオチドゲート電流(HCN電流)は、長時間の過分極電圧のファミリーによって活性化されます。この図は、記録中のさまざまな時点での穿孔パッチのイオンチャネル特性評価の安定性を示しています。HCN電流の電圧依存性活性化曲線は、穴の開いたパッチ構成で測定されました。曲線はシグモイド形状をしており、長時間の録音中も安定していました。破裂パッチモードの相対的な不安定性は、異なる時点からの重なり合わないシグモイド曲線によって示されます。破裂パッチ構成中のHCN電流の活性化曲線をここに示します。ここでは、5つの前庭神経節ソマラ、5つの螺旋神経節ニューロンの発火パターンと、対応する現在のステップを示します。この発火パターンの不均一性は、前庭神経節ニューロンと螺旋神経節ニューロンの両方における基礎となるナトリウムチャネルとカリウムチャネルの組成の基本的な多様性を反映しています。この手順で細胞の生存率を最大限に高めるには、気泡の形成を避け、組織を酷使せず、細胞が沈降するのを待ってからサンプルをインキュベーターに入れてください。穴あきパッチクランプは、神経節ニューロンに対する遠心性神経伝達物質の影響を調査するために重要な、細胞質セカンドメッセンジャーによって調節されるイオンチャネルの研究を可能にします。これらの双極ニューロンのパッチクランプ記録は、生物物理学的多様性が感覚ニューロンの機能的多様性にどのように寄与するかを明らかにするのに役立っています。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

暗順応スライス標本におけるマウス網膜神経細胞からパッチクランプ記録

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

神経科学

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

モーターニューロンとターゲットゼブラフィッシュの骨格筋からの対のパッチクランプ記録

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans

げっ歯類やヒトから鼻嗅覚幹細胞を単離する

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external ...

Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

NRCCパッチクランプチップ上で細胞の培養と電気生理学

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard ...

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

内耳有毛細胞におけるパッチクランプ記録は、単離されたゼブラフィッシュから

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

<sub&gt; 1</sub&gt; F<sub&gt; O</sub亜ミトコンドリアの小胞膜のパッチクランプ記録を実行するための&gt; ATPアーゼ小胞の準備とテクニック

Mitochondria are involved in many important cellular  functions including metabolism, survival1, development and, calcium signaling2. Two of the most ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

の感覚ニューロンの分離<em&gt;アメフラシカリフォルニ</em&gt;グルタミン酸作動電流のパッチクランプ記録のために

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

胚ゼブラフィッシュマウスナー細胞からパッチクランプ記録

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

Morphologically-と神経化学的に特定し海馬介在ニューロンからホールセルパッチクランプ記録

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

急性脳スライスにおけるニューロンマイクロ回路の電気生理学的および形態学的特徴は、ペアパッチクランプ記録を使用して、

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...