Name: isolating and culturing vestibular and spiral ganglion somata from neonatal rodents for patch-clamp recordings
Uploaded: 2023-04-21T12:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating and Culturing Vestibular and Spiral Ganglion Somata from Neonatal Rodents for Patch-Clamp Recordings at JoVE.com

우리는 이러한 방법에 대한 초기 기여에 대해 Jing Bing Xue 박사와 Ruth Anne Eatock 박사에게 감사드립니다. 이 연구는 NIH NIDCD R03 DC012652 및 NIH NIDCD DC012653S, R01 DC0155512 RK 및 T32 DC009975 DB, NN 및 KR의 지원을 받았습니다.

여기에 설명된 모든 동물 사용은 University of Southern California의 Institutional Animal Care and Use Committee의 승인을 받았습니다. 이 프로토콜의 동물은 Charles River Laboratories에서 얻은 남녀 모두의 P3 내지 P25 연령의 Long Evans 쥐이지만, 이러한 방법은 다른 설치류 균주에 적용될 수 있습니다. 모든 절차 중에 실험실 가운과 장갑을 착용해야 하며 용액을 만들 때는 물 튀김 방지 고글을 착용해야 합니다.
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<ol>
	<li>Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-neuron+labeling+in+the+cat+auditory+nerve.">Single-neuron labeling in the cat auditory nerve.</a> Science. 216 (4551), 1239-1241 (1982).</li><li>Goldberg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Afferent+diversity+and+the+organization+of+central+vestibular+pathways.">Afferent diversity and the organization of central vestibular pathways.</a> Experimental Brain Research. 130 (3), 277-297 (2000).</li><li>Kalluri, R., Xue, J., Eatock, R. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+firing+patterns+of+murine+spiral+ganglion+neurons.">Endogenous firing patterns of murine spiral ganglion neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 77 (3), 1294-1305 (1997).</li><li>Almanza, A., Luis, E., Mercado, F., Vega, R., Soto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+identity,+ontogeny,+and+cAMP+modulation+of+the+hyperpolarization-activated+current+in+vestibular+ganglion+neurons.">Molecular identity, ontogeny, and cAMP modulation of the hyperpolarization-activated current in vestibular ganglion neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 108 (8), 2264-2275 (2012).</li><li>Horn, R., Marty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscarinic+activation+of+ionic+currents+measured+by+a+new+whole-cell+recording+method.">Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method.</a> The Journal of General Physiology. 92 (2), 145-159 (1988).</li><li>Grant, L., Yi, E., Goutman, J. D., Glowatzki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+recordings+at+afferent+dendrites+contacting+cochlear+inner+hair+cells:+Monitoring+multivesicular+release+at+a+ribbon+synapse.">Postsynaptic recordings at afferent dendrites contacting cochlear inner hair cells: Monitoring multivesicular release at a ribbon synapse.</a> Journal of Visualized Experiments. (48), e2442 (2010).</li><li>Bronson, D., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscarinic+acetylcholine+receptors+modulate+HCN+channel+properties+in+vestibular+ganglion+neurons.">Muscarinic acetylcholine receptors modulate HCN channel properties in vestibular ganglion neurons.</a> The Journal of Neuroscience. 43 (6), 902-917 (2023).</li><li>Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+components+of+membrane+conductance+in+the+giant+axon+of+Loligo.">The components of membrane conductance in the giant axon of Loligo.</a> The Journal of Physiology. 116 (4), 473-496 (1952).</li><li>Chabbert, C., Chambard, J. M., Valmier, J., Sans, A., Desmadryl, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-activated+sodium+currents+in+acutely+isolated+mouse+vestibular+ganglion+17eurons.">Voltage-activated sodium currents in acutely isolated mouse vestibular ganglion 17eurons.</a> Neuroreport. 8 (5), 1253-1256 (1997).</li><li>Bean, B. 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M., Sans, A., Desmadryl, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+types+of+depolarization-activated+potassium+currents+in+acutely+isolated+mouse+vestibular+neurons.">Three types of depolarization-activated potassium currents in acutely isolated mouse vestibular neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 85 (3), 1017-1026 (2001).</li><li>Risner, J. R., Holt, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+potassium+conductances+contribute+to+the+diverse+firing+properties+of+postnatal+mouse+vestibular+ganglion+neurons.">Heterogeneous potassium conductances contribute to the diverse firing properties of postnatal mouse vestibular ganglion neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 96 (5), 2364-2376 (2006).</li><li>Iwasaki, S., Chihara, Y., Komuta, Y., Ito, K., Sahara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-voltage-activated+potassium+channels+underlie+the+regulation+of+intrinsic+firing+properties+of+rat+vestibular+ganglion+cells.">Low-voltage-activated potassium channels underlie the regulation of intrinsic firing properties of rat vestibular ganglion cells.</a> Journal of Neurophysiology. 100 (4), 2192-2204 (2008).</li><li>Cervantes, B., Vega, R., Lim&#243;n, A., Soto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identity,+expression+and+functional+role+of+the+sodium-activated+potassium+current+in+vestibular+ganglion+afferent+neurons.">Identity, expression and functional role of the sodium-activated potassium current in vestibular ganglion afferent neurons.</a> Neuroscience. 240, 163-175 (2013).</li><li>Biel, M., Wahl-Schott, C., Michalakis, S., Zong, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperpolarization-activated+cation+channels:+From+genes+to+function.">Hyperpolarization-activated cation channels: From genes to function.</a> Physiological Reviews. 89 (3), 847-885 (2009).</li><li>Davis, R. L., Crozier, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+firing+properties+of+type+I+spiral+ganglion+neurons.">Dynamic firing properties of type I spiral ganglion neurons.</a> Cell and Tissue Research. 361 (1), 115-127 (2015).</li><li>Reijntjes, D. O. J., Pyott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+afferent+signaling+complex:+Regulation+of+type+I+spiral+ganglion+neuron+responses+in+the+auditory+periphery.">The afferent signaling complex: Regulation of type I spiral ganglion neuron responses in the auditory periphery.</a> Hearing Research. 336, 1-16 (2016).</li><li>Eatock, R. A., Christov, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ionic Conductances of Vestibular Afferent Neurons: Shaping Head Motion Signals From the Inner Ear. , (2020).</li><li>Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similarities+in+the+biophysical+properties+of+spiral-ganglion+and+vestibular-ganglion+neurons+in+neonatal+rats.">Similarities in the biophysical properties of spiral-ganglion and vestibular-ganglion neurons in neonatal rats.</a> Frontiers in Neuroscience. 15, 710275 (2021).</li><li>Armstrong, C. E., Roberts, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+properties+of+frog+saccular+hair+cells:+distortion+by+enzymatic+dissociation.">Electrical properties of frog saccular hair cells: distortion by enzymatic dissociation.</a> The Journal of Neuroscience. 18 (8), 2962-2973 (1998).</li><li>Rocha-Sanchez, S. M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+expression+of+Kcnq4+in+vestibular+neurons+and+neurosensory+epithelia.">Developmental expression of Kcnq4 in vestibular neurons and neurosensory epithelia.</a> Brain Research. 1139, 117-125 (2007).</li><li>Meredith, F. L., Rennie, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zonal+variations+in+K++currents+in+vestibular+crista+calyx+terminals.">Zonal variations in K+ currents in vestibular crista calyx terminals.</a> Journal of Neurophysiology. 113 (1), 264-276 (2015).</li><li>Cai, H. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-dependent+activity+of+primary+auditory+neurons+in+the+presence+of+neurotrophins+and+antibiotics.">Time-dependent activity of primary auditory neurons in the presence of neurotrophins and antibiotics.</a> Hearing Research. 350, 122-132 (2017).</li><li>Needham, K., Nayagam, B. A., Minter, R. L., O'Leary, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+application+of+brain-derived+neurotrophic+factor+and+neurotrophin-3+and+its+impact+on+spiral+ganglion+neuron+firing+properties+and+hyperpolarization-activated+currents.">Combined application of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 and its impact on spiral ganglion neuron firing properties and hyperpolarization-activated currents.</a> Hearing Research. 291 (1-2), 1-14 (2012).</li><li>Adamson, C. L., Reid, M. A., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposite+actions+of+brain-derived+neurotrophic+factor+and+neurotrophin-3+on+firing+features+and+ion+channel+composition+of+murine+spiral+ganglion+neurons.">Opposite actions of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 on firing features and ion channel composition of murine spiral ganglion neurons.</a> The Journal of Neuroscience. 22 (4), 1385-1396 (2002).</li><li>Zhou, Z., Liu, Q., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+regulation+of+spiral+ganglion+neuron+firing+patterns+by+neurotrophin-3.">Complex regulation of spiral ganglion neuron firing patterns by neurotrophin-3.</a> The Journal of Neuroscience. 25 (33), 7558-7566 (2005).</li><li>Liu, X. -. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+channel+diversity+in+the+vestibular+ganglion:+NaV1.5,+NaV1.8,+and+tetrodotoxin-sensitive+currents.">Sodium channel diversity in the vestibular ganglion: NaV1.5, NaV1.8, and tetrodotoxin-sensitive currents.</a> Journal of Neurophysiology. 115 (5), 2536-2555 (2016).</li></ol>

여기에 제시된 방법은 고립된 뉴런의 기록에 특화되어 있습니다. 이전 연구는 반온전한 준비에서 축삭 말단의 기록에 중점을 두었습니다. 기존 터미널 기록 기술과 비교할 때 절연 기록은 우수한 공간 클램프 및 등전위 동작을 제공합니다. 또한, 이 프로토콜은 전정 상피의 반온전한 기록에서 꽃받침을 함유한 하위 집단만 접근할 수 있기 때문에 더 광범위한 뉴런 샘플에 대한 접근을 제공합니다....

전정 신경의 양극성 뉴런은 내이의 감각 유모 세포를 뇌간에 연결합니다. 그들은 소리와 머리 움직임에 대한 정보의 주요 운반자입니다. 이러한 중요한 세포가 손상되면 난청과 균형 장애가 발생합니다. 신경의 전정 및 청각 부분은 각각 형태학적으로나 기능적으로 다양한 뚜렷한 세포 유형으로 구성되어 있습니다 1,2. 전정계(vestibular system)에서는 두 개의 구심성 하위집단(afferent subpopulation)이 규칙적이거나 불규칙한 간격으로 자발적으로 발화한다2. 구심성 스파이크 타이밍은 이온 채널 조성 3,4의 근본적인 다양성을 반영하는 것으로 생각됩니다. 청각 시스템에는 나선형 신경절 뉴런(SGN)의 두 가지 주요 하위 집단이 있습니다. 반면, I형 SGN은 개별적인 내모세포5와 접촉하는 반면, II형 SGN은 다수의 외유모세포5와 접촉한다. 반원형 및 유기형 배양에서 얻은 시험관 내 기록은 유형 I 및 유형 II SGN의 막 특성의 차이를 시사합니다 6,7.
이러한 뉴런의 말단에서 발견되는 많은 이온 채널과 신경 전달 물질 수용체는 세포체에서도 발견됩니다. 따라서 고립된 전정 및 나선형 신경절 소마타의 배양은 이온 채널과 신경 전달 물질 수용체가 이러한 뉴런의 반응에 어떻게 기여하는지 이해하기 위해 시험관 내에서 연구할 수 있습니다. 분리된 세포체의 조밀한 형태는 고품질 전기 기록이 가능하며, 전압 개폐 이온 채널 및 신경 전달 물질 수용체의 상세한 특성 분석에 적합합니다. 대표적인 다양한 뉴런 아형에 쉽게 접근할 수 있어 세포 다양성에 대한 고처리량 분석이 가능합니다.
이 논문은 출생 후 (P)9에서 P20까지 쥐의 전정 신경절의 상부에서 해리된 신경절 세포체를 분리하고 배양하는 방법을 제시합니다. 또한 이러한 방법을 나선형 신경절로 확장하기 위한 제안과 함께 신경절 세포를 성공적으로 추출, 해리 및 도금하는 데 필요한 단계가 제공됩니다. 이러한 방법은 다양한 실험실 8,9,10의 간행물에서 고안된 방법의 진화입니다. 또한 이 문서에는 패치 클램프 기록을 위한 건강한 세포를 선택하기 위한 지침이 포함되어 있습니다.
마지막으로, 프로토콜은 천공-패치 구성(perforated-patch configuration)(11)을 이용한 패치-클램프 기록에 대한 절차를 개략적으로 설명한다. 천공 패치 구성은 일반적인 파열 패치 구성보다 시간이 많이 걸리고 기술적으로 더 까다롭지만 길고 안정적인 기록 세션을 허용하는 세포질 환경을 유지하는 데 더 좋습니다. 이 기록 구성의 이점은 파열 패치 기록에 비해 천공 패치에서 과분극 활성화 양이온 전류의 향상된 안정성을 통해 설명됩니다.
이 프로토콜은 5개의 섹션으로 구성되어 있습니다. 섹션 1-3에서는 미리 준비하고 저장할 수 있는 솔루션과 도구에 대해 설명합니다. 섹션 4는 전정 및 SGN을 해부하고 도금하는 단계를 설명합니다. 섹션 5는 배양 기간 후 뉴런에서 기록하는 단계를 설명합니다. 우리 손에서 섹션 4와 섹션 5는 연속 2 일 동안 수행됩니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amphotericin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4888-100MG</td>
			<td>For perforated patch recordings.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP di-sodium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7699</td>
			<td>Additive to internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement (50x), serum free</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td>additive to culture medium, for SGN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beakers (1000, 100, 10) milliliter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bench-top centrifuge</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2641-0016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen burner</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>1311-01</td>
			<td>Additive to internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5318</td>
			<td>one out of three enzyme to digest tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass, rectangular, #1 thickness, 22x40&#160;</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>90082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I,from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11284932001</td>
			<td>one out of three enzyme to digest tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #3 Forceps (Blunt)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11231-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps (Fine)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 Forceps (Fine)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E0396</td>
			<td>Additive to internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Puller</td>
			<td>Narashige</td>
			<td>PC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epi-illumination light source&#160;</td>
			<td>Zeiss&#160;</td>
			<td>CL 1500 ECO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2716</td>
			<td>for cleaning head and around dissection bench</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filamented Borosilicate Capillaries for electrodes</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF140-117-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-edged dissection blade</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10010-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur Pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14673-010</td>
			<td>to pull trituration pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16140063</td>
			<td>additive to culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375-100G</td>
			<td>for pH buffering all solutions in protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate / magnetic stirrers&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76549-914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulated bucket filled with ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>to keep all samples and solutions cool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2SO4, Potassium Sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9458-250G</td>
			<td>Additive to internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P93333</td>
			<td>Additive to internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH (1 M)</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>319376-500ML</td>
			<td>To bring internal solution to desired pH.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14133-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz medium&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L4386</td>
			<td>dissection and bath solutions&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-profile-bath recording chamber for culture dishes</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>luer-lok syringes, 30 ml</td>
			<td>BD</td>
			<td>302832</td>
			<td>for drawing L-15/HEPES/HEPES solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM + Glutamax Supplement</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>41-090-101</td>
			<td>base of the culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2-Hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1028</td>
			<td>Additive to internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microFil needle for filling micropipettes - 34 gauge&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MF34G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narashige</td>
			<td>MF-90</td>
			<td>For electrode polishing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>additiive to culture medium, for SGN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Additive to internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH (1 M)</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>319511-500ML</td>
			<td>for titration pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmometer</td>
			<td>Advanced Instruments Inc.</td>
			<td>3320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen, Medical grade, with adequate regulator and tubing</td>
			<td>USC Material Management</td>
			<td>MEDOX200 (Identifier: 00015)</td>
			<td>for dissolving into dissection and bath solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette bulb (3 ml)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-448-25</td>
			<td>bulb for trituration pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>additive to prevent contamination of culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital based euthanasia solution (e.g., Fatal Plus. 50 &#8211; 60 mg/kg dosing)&#160;</td>
			<td>MWI Animal Health</td>
			<td>15199</td>
			<td>for euthanasia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PES membrane filters ,&#160; 0.2 micrometer&#160;</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>566-0020</td>
			<td>for filtering solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PES membrane sterile syringe filters, 0.22 um, 30 mm&#160;</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229747</td>
			<td>for filtering solutions drawn into syringes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 35 x 10 mm</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>32-103</td>
			<td>for micro dissection and to hold Tip dip solution in perforated-patch configuration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes, 60 x 15 mm</td>
			<td>Midland Scientific</td>
			<td>P7455</td>
			<td>for gross dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>Model S20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettors (1000, 200, 10) microliter</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-d-lysine coated glass bottomed culture dish</td>
			<td>Mattek</td>
			<td>P35GC-0-10-C</td>
			<td>to plate neurons for culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick change platform, heated base, for 35 mm culture dishes</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reference Cell</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>RC1T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>4-315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scientific Scale</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>XS64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes (10, 25) milliliter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Grease Kit (for sealing coverglass and chamber)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Animal Guillotine</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>DCAP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small animal guillotine</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>DCAP</td>
			<td>for decapitation if dissecting rats older than P15.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Dissection Microscope&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (3, 10, 30) milliliter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1426</td>
			<td>one out of three enzyme to digest tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuberculin syringe&#160;</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>8881500105</td>
			<td>for delivering euthanasia solution by intraperitoneal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissor, 2.5 mm Cutting Edge</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volumetric flask, 1000 milliliter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>VWR</td>
			<td>945300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, sterile u ltrapure, R&#62;18.18 megaOhms cm (e.g., filtered by a Millipore-Sigma water purification system)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>CDUFBI001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating and culturing vestibular and spiral ganglion somata from neonatal rodents for patch-clamp recordings

분리되고 배양된 내이 신경절 뉴런의 조밀한 형태는 이 집단의 세포 다양성에 기여하는 이온 채널과 신경 전달 물질 수용체의 상세한 특성을 분석할 수 있습니다. 이 프로토콜은 패치 클램프 기록을 위해 내이 양극성 뉴런의 소마타를 성공적으로 해부, 해리 및 단기 배양하는 데 필요한 단계를 간략하게 설명합니다. 전정신경절 뉴런을 준비하기 위한 자세한 지침은 나선형 신경절 뉴런을 도금하는 데 필요한 수정과 함께 제공됩니다. 이 프로토콜에는 천공 패치 구성에서 전체 셀 패치 클램프 기록을 수행하기 위한 지침이 포함되어 있습니다. 과분극 활성화 순환 뉴클레오티드 개폐(HCN) 매개 전류의 전압 클램프 기록을 특성화하는 예제 결과는 보다 표준적인 파열 패치 구성과 비교하여 천공 패치 기록 구성의 안정성을 강조합니다. 이러한 방법의 조합인 분리된 소마타와 천공된 패치 클램프 기록은 길고 안정적인 기록과 G-단백질 결합 수용체를 통한 신호 전달과 같은 세포 내 환경의 보존이 필요한 세포 과정을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

전압 단계 제품군을 적용하여 전압 클램프 프로토콜을 실행하면 다양한 전류 제품군의 전압 종속 활성화를 알 수 있습니다. VGN으로부터 유발되고 공개된 기록(13)으로부터 적응된 전체 셀 전류의 대표적인 예들이 도 1A,B에 도시되어 있다. 탈분극 전압을 적용하면(그림 1B) 매우 빠르게 활성화 및 비활성화되는 내부 전류(일...

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Isolating and Culturing Vestibular and Spiral Ganglion Somata from Neonatal Rodents for Patch-Clamp Recordings

여기에 제시된 방법은 내이의 전정 신경절 및 나선형 신경절 뉴런에서 해부, 해리, 배양 및 패치 클램프 기록에 대한 자세한 지침을 제공합니다.

Patch-Clamp 기록을 위해 신생아 설치류에서 전정 및 나선형 신경절 소마타를 분리 및 배양합니다.

The compact morphology of isolated and cultured inner ear ganglion neurons allows for detailed characterizations of the ion channels and neurotransmitter ...

청각 및 전정 구심성 뉴런의 말단에서 발견되는 많은 이온 채널과 신경 전달 물질 수용체는 세포체에서도 발견됩니다. 분리된 세포체의 배양은 이러한 이온 채널과 수용체가 뉴런의 반응에 어떻게 영향을 미치는지 이해하기 위해 시험관에서 연구할 수 있습니다. 세포체의 조밀한 형태는 이온 채널과 신경 전달 물질 수용체의 전압 의존적 특성을 특성화하기 위한 고품질 전기 기록을 가능하게 합니다.또한 다양한 세포 유형에 쉽게 접근할 수 있어 세포 다양성의 물리적 분석을 통해 높은 처리량을 얻을 수 있습니다. 이 절차는 대학원생인 캐서린 레갈라도(Katherine Regalado)와 박사 후 연구원인 다니엘 브론슨(Daniel Bronson) 박사와 나다니엘 노왁(Nathaniel Nowak) 박사가 시연할 예정입니다. 시작하려면 유리 목초지 피펫을 Bunsen 버너의 불꽃에 대고 세포 해리를 위한 삼중 피펫을 준비합니다.유리 팁이 녹기 시작하면 유리를 원하는 팁 직경으로 늘립니다. 피펫의 한쪽 끝을 화염에서 당겨 약간 구부립니다. 구부러진 피펫을 현미경 아래에 놓습니다.점수 타일을 사용하여 원하는 직경으로 유리에 점수를 매기고 깨뜨립니다. 피펫 팁을 버너 불꽃 위에 통과시킵니다. 이렇게 하면 팁 근처의 거친 가장자리가 빠르게 연마됩니다.닫힌 수술용 가위를 사용하여 안락사된 쥐의 뇌를 퍼냅니다. 뇌신경을 절단하고 제거하여 두개골에서 뇌를 완전히 분리합니다. 머리 뒤쪽에서 시작하여 집게로 투명한 막질 물질을 잡아 당긴 다음 수술 용 가위로 두개골 상단을 잘라냅니다.머리와 목 뒤쪽의 여분의 조직을 제거하여 해부 부위와 귀 캡슐을 더 깨끗하고 접근하기 쉽게 만듭니다. 조직을 신선한 L-15 용액이 있는 두 번째 페트리 접시로 옮깁니다. 그런 다음 귀 캡슐과 청각 신경, 상전정 신경, 전정 신경, 하부 전정 신경을 찾습니다.작은 스프링 가위를 사용하여 상신경절과 하신경절을 분리하고 청각 신경을 잘라냅니다. 메스를 사용하여 뼈 융기를 부드럽게 깎아 신경이 뼈 캡슐로 잠수하는 뼈 부위를 약화시킵니다. 메스로 조심스럽게 이물질을 제거하고 신경절의 부풀어 오른 부분 전체를 노출시킵니다.가는 스프링 가위를 사용하여 요실을 향해 잠수하는 말초 신경 가지에서 신경절을 자르고 분리합니다. 미세한 집게를 사용하여 상부 신경절을 제거하고 신선한 L-15 용액과 함께 35mm 페트리 접시에 옮깁니다. 효소 용액을 예열한 후 효소 혼합물을 35mm 페트리 접시에 붓고 섭씨 37도의 인큐베이터에 10-15분 동안 넣습니다.미세한 집게와 작은 스프링 가위를 사용하여 뼈, 과도한 조직, 신경 섬유 및 기타 불필요한 구조물을 제거하여 신경절을 청소하십시오. 신경절 조직의 제거를 최소화하도록 주의하십시오. 세척된 신경절을 예열된 효소 용액에 옮기고 10-40분 동안 인큐베이터에 다시 넣습니다.그런 다음 신경절을 신선한 L-35 용액과 함께 15mm 페트리 접시로 옮깁니다. 2-3분 후, 신경절을 여과된 배양 배지로 채워진 다른 35mm 페트리 접시로 옮깁니다. 약 150마이크로리터의 여과된 배양 배지를 코팅된 유리 바닥 접시에 옮깁니다.그런 다음 원하는 수의 신경절을 커버 슬립에 옮깁니다. 배양 접시에서 소량의 배양 배지를 꺼내고 삼중 피펫을 배지로 헹구어 조직이 유리 피펫의 측면에 달라붙지 않도록 합니다. 신경절이 충분히 해리될 때까지 피펫을 통해 조직을 부드럽고 반복적으로 통과시켜 삼중 작용합니다.5분 후 광학 현미경으로 세포가 커버 슬립에 정착했는지 확인합니다. 배양 접시를 섭씨 37도의 인큐베이터에 조심스럽게 넣어 12-24시간 동안 보관합니다. 다음으로, 머리를 이등분한 후 귀 캡슐을 찾아 집게를 사용하여 가장자리를 깎아 두개골에서 추출합니다.귀 캡슐의 나선형 부분에는 코르티 기관이 있는 달팽이관이 있습니다. 뼈를 깎아내고, 달팽이관 위에 뼈의 곡선과 평행한 미세한 집게로 회전시킵니다. 작은 스프링 가위를 사용하여 달팽이관 기저부의 모디올러스를 절단하여 나머지 귀 캡슐에서 분리합니다.작은 스프링 가위를 사용하여 코르티의 기관을 두세 바퀴 잘라 평평하게 놓고 각 회전에서 모디올러스를 절제합니다. 미세한 집게로 밑부분의 줄무늬를 꼬집어 선조체 혈관을 제거합니다. 나선형과 정점 주위로 긴장을 풀어 코르티 기관에서 벗겨냅니다.나선신경절 뉴런 섬유관이 유모세포를 향해 돌출된 부분의 가장자리를 잘라 나선신경절을 제거한 다음 앞서 본 것처럼 신경절을 청소합니다. 나선형 신경절을 효소로 처리한 후, N2 및 B27이 보충된 배양 배지에서 나선형 신경절을 트리트레이트합니다. 해리된 신경절이 들어 있는 배양 접시를 섭씨 37도, 5% 이산화탄소 인큐베이터에 12-24시간 동안 놓습니다.피펫 끝을 배양 접시의 깨끗한 용액에 담그고 암포테리신이 포함되지 않은 깨끗한 용액으로 채웁니다. 피펫 뒷면을 암포테리신이 함유된 내부 용액으로 채웁니다. 피펫 팁을 배양 접시의 깨끗한 용액에 다시 담그고 암포테리신은 피펫 뒤쪽에서 팁으로 천천히 들어갑니다.다음으로, 피펫의 2/3에 해당하는 암포테리신 용액을 피펫에 채우는 것을 마칩니다. 피펫을 기록 챔버의 수조로 내리고 시야 중앙에서 피펫 팁을 찾습니다. 팁에 기포나 기타 이물질이 없는지 확인하십시오.피펫을 멤브레인 가까이에 놓고 셀 중앙에 단단히 착지합니다. 주사기 또는 구강 피펫을 사용하여 음압 또는 흡입을 가합니다. 마이너스 60밀리볼트의 유지 전위를 켭니다.씰 저항은 기가 옴을 통과할 때까지 증가해야 합니다. 기가 옴 씰이 형성되면 음압을 해제하십시오. 티로신이 작동하기 전에 입력 저항이 서서히 감소하고 5 밀리 볼트 전압 단계에 응답하여 흐르는 전류는 암포테리신이 멤브레인에 들어가면서 점진적으로 증가합니다.전정신경절 뉴런에서 유발된 전체 세포 전류의 대표적인 예가 이 그림에 나와 있습니다. 순 내부 나트륨 전류는 여기에서 일시적인 활성화 및 비활성화로 식별됩니다. 순 바깥쪽 전류는 주로 칼륨 이온에 의해 운반되며 나트륨 전류보다 활성화 및 불활성화 역학이 훨씬 느립니다.과분극 활성화 고리형 뉴클레오티드 개폐 전류 또는 HCN 전류는 장기간 과분극 전압 계열에 의해 활성화됩니다. 기록 중 서로 다른 시점에서 천공된 패치의 이온 채널 특성 분석의 안정성이 이 그림에 나와 있습니다. HCN 전류의 전압 종속 활성화 곡선은 천공된 패치 구성으로 측정되었습니다.곡선은 시그모이드 모양을 가지고 있으며 긴 녹음 내내 안정적이었습니다. 파열된 패치 모드의 상대적 불안정성은 서로 다른 시점의 겹치지 않는 시그모이드 곡선으로 설명됩니다. 파열된 패치 구성 중 HCN 전류의 활성화 곡선이 여기에 나와 있습니다.5개의 전정신경절 소마라(vestibular ganglion somara), 5개의 나선형 신경절 뉴런(spiral ganglion neuron)의 발화 패턴과 해당 전류 단계가 여기에 나와 있습니다. 이러한 발화 패턴의 이질성은 전정신경절 뉴런과 나선형 신경절 뉴런 모두에서 기저 나트륨 및 칼륨 채널 구성의 근본적인 다양성을 반영합니다. 이 과정에서 세포 생존을 극대화하려면 기포가 형성되지 않도록 하고, 조직을 과도하게 사용하지 말고, 샘플을 인큐베이터에 넣기 전에 세포가 가라앉도록 하십시오.천공된 패치 클램프는 세포질 제2 메신저에 의해 조절되는 이온 채널을 연구할 수 있으며, 이는 신경절 뉴런에 대한 원심성 신경전달물질의 효과를 조사하는 데 중요합니다. 이러한 양극성 뉴런의 패치 클램프 기록은 생물물리학적 다양성이 감각 뉴런의 기능적 다양성에 어떻게 기여하는지 밝히는 데 중요한 역할을 했습니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

어두운 적응 슬라이스 준비에 마우스 망막 뉴런에서 패치 클램프 레코딩

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

연구

신경과학

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

모터 신경 세포의 이점 패치 클램프 레코딩과 Zebrafish의 대상 골격근

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans

설치류 또는 인간의 네이절 강한 줄기 세포를 분리

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external ...

Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

NRCC 패치 - 클램프 칩에 대한 세포의 Culturing 및 전기 생리학

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard ...

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

귀에 세포의 패치 클램프 녹음 절연 Zebrafish에서

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

<sub&gt; 1</sub&gt; F<sub&gt; O</subSubmitochondrial 소포 막 패치 클램프 녹음을 공연&gt; ATPase의 소포의 준비와 기술

Mitochondria are involved in many important cellular  functions including metabolism, survival1, development and, calcium signaling2. Two of the most ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

의 감각 뉴런의 분리<em&gt; 군소 californica</em&gt; 글루타메이트 전류의 패치 클램프 녹음을위한

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

배아 Zebrafish의 MAUTHNER 세포에서 패치 클램프 녹음

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

Morphologically- 및 Neurochemically 확인 된 해마의 interneurons에서 전체 세포 패치 클램프 녹음

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

급성 뇌 조각에서 신경 세포의 미세 회로의 전기 생리 및 형태 학적 특성은 페어 패치 클램프 녹음을 사용하여

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...