Name: isolating and culturing vestibular and spiral ganglion somata from neonatal rodents for patch-clamp recordings
Uploaded: 2023-04-21T12:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating and Culturing Vestibular and Spiral Ganglion Somata from Neonatal Rodents for Patch-Clamp Recordings at JoVE.com

Мы выражаем признательность докторам Цзин Бин Сюэ и Рут Энн Иток за их ранний вклад в эти методы. Эта работа была поддержана NIH NIDCD R03 DC012652 и NIH NIDCD DC012653S, а также R01 DC0155512 для РК и T32 DC009975 для DB, NN и KR.

Все виды использования животных, описанные здесь, были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию в Университете Южной Калифорнии. Животными в этом протоколе являются крысы Лонг Эванс обоих полов в возрасте от P3 до P25, полученные из лабораторий Чарльз Ривер, но эти мето?...

<ol>
	<li>Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-neuron+labeling+in+the+cat+auditory+nerve.">Single-neuron labeling in the cat auditory nerve.</a> Science. 216 (4551), 1239-1241 (1982).</li><li>Goldberg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Afferent+diversity+and+the+organization+of+central+vestibular+pathways.">Afferent diversity and the organization of central vestibular pathways.</a> Experimental Brain Research. 130 (3), 277-297 (2000).</li><li>Kalluri, R., Xue, J., Eatock, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channels+set+spike+timing+regularity+of+mammalian+vestibular+afferent+neurons.">Ion channels set spike timing regularity of mammalian vestibular afferent neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 104 (4), 2034-2051 (2010).</li><li>Smith, C. E., Goldberg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stochastic+afterhyperpolarizaton+model+of+repetitive+activity+in+vestibular+afferents.">A stochastic afterhyperpolarizaton model of repetitive activity in vestibular afferents.</a> Biological Cybernetics. 54 (1), 41-51 (1986).</li><li>Berglund, A. M., Ryugo, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+cell+innervation+by+spiral+ganglion+neurons+in+the+mouse.">Hair cell innervation by spiral ganglion neurons in the mouse.</a> The Journal of Comparative Neurology. 255 (4), 560-570 (1987).</li><li>Jagger, D. J., Housley, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+properties+of+type+II+spiral+ganglion+neurones+identified+in+a+neonatal+rat+cochlear+slice.">Membrane properties of type II spiral ganglion neurones identified in a neonatal rat cochlear slice.</a> Journal of Physiology. 552, 525-533 (2003).</li><li>Reid, M. A., Flores-Otero, J., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firing+patterns+of+type+II+spiral+ganglion+neurons+in+vitro).">Firing patterns of type II spiral ganglion neurons in vitro).</a> The Journal of Neuroscience. 24 (3), 733-742 (2004).</li><li>Lv, P., Wei, D., Yamoah, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kv7-type+channel+currents+in+spiral+ganglion+neurons:+involvement+in+sensorineural+hearing+loss.">Kv7-type channel currents in spiral ganglion neurons: involvement in sensorineural hearing loss.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285 (45), 34699-34707 (2010).</li><li>Mo, Z. L., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+firing+patterns+of+murine+spiral+ganglion+neurons.">Endogenous firing patterns of murine spiral ganglion neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 77 (3), 1294-1305 (1997).</li><li>Almanza, A., Luis, E., Mercado, F., Vega, R., Soto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+identity,+ontogeny,+and+cAMP+modulation+of+the+hyperpolarization-activated+current+in+vestibular+ganglion+neurons.">Molecular identity, ontogeny, and cAMP modulation of the hyperpolarization-activated current in vestibular ganglion neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 108 (8), 2264-2275 (2012).</li><li>Horn, R., Marty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscarinic+activation+of+ionic+currents+measured+by+a+new+whole-cell+recording+method.">Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method.</a> The Journal of General Physiology. 92 (2), 145-159 (1988).</li><li>Grant, L., Yi, E., Goutman, J. D., Glowatzki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+recordings+at+afferent+dendrites+contacting+cochlear+inner+hair+cells:+Monitoring+multivesicular+release+at+a+ribbon+synapse.">Postsynaptic recordings at afferent dendrites contacting cochlear inner hair cells: Monitoring multivesicular release at a ribbon synapse.</a> Journal of Visualized Experiments. (48), e2442 (2010).</li><li>Bronson, D., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscarinic+acetylcholine+receptors+modulate+HCN+channel+properties+in+vestibular+ganglion+neurons.">Muscarinic acetylcholine receptors modulate HCN channel properties in vestibular ganglion neurons.</a> The Journal of Neuroscience. 43 (6), 902-917 (2023).</li><li>Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+components+of+membrane+conductance+in+the+giant+axon+of+Loligo.">The components of membrane conductance in the giant axon of Loligo.</a> The Journal of Physiology. 116 (4), 473-496 (1952).</li><li>Chabbert, C., Chambard, J. M., Valmier, J., Sans, A., Desmadryl, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-activated+sodium+currents+in+acutely+isolated+mouse+vestibular+ganglion+17eurons.">Voltage-activated sodium currents in acutely isolated mouse vestibular ganglion 17eurons.</a> Neuroreport. 8 (5), 1253-1256 (1997).</li><li>Bean, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+action+potential+in+mammalian+central+neurons.">The action potential in mammalian central neurons.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 8 (6), 451-465 (2007).</li><li>Izhikevich, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Dynamical Systems in Neuroscience. , (2018).</li><li>Chabbert, C., Chambard, J. M., Sans, A., Desmadryl, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+types+of+depolarization-activated+potassium+currents+in+acutely+isolated+mouse+vestibular+neurons.">Three types of depolarization-activated potassium currents in acutely isolated mouse vestibular neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 85 (3), 1017-1026 (2001).</li><li>Risner, J. R., Holt, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+potassium+conductances+contribute+to+the+diverse+firing+properties+of+postnatal+mouse+vestibular+ganglion+neurons.">Heterogeneous potassium conductances contribute to the diverse firing properties of postnatal mouse vestibular ganglion neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 96 (5), 2364-2376 (2006).</li><li>Iwasaki, S., Chihara, Y., Komuta, Y., Ito, K., Sahara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-voltage-activated+potassium+channels+underlie+the+regulation+of+intrinsic+firing+properties+of+rat+vestibular+ganglion+cells.">Low-voltage-activated potassium channels underlie the regulation of intrinsic firing properties of rat vestibular ganglion cells.</a> Journal of Neurophysiology. 100 (4), 2192-2204 (2008).</li><li>Cervantes, B., Vega, R., Lim&#243;n, A., Soto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identity,+expression+and+functional+role+of+the+sodium-activated+potassium+current+in+vestibular+ganglion+afferent+neurons.">Identity, expression and functional role of the sodium-activated potassium current in vestibular ganglion afferent neurons.</a> Neuroscience. 240, 163-175 (2013).</li><li>Biel, M., Wahl-Schott, C., Michalakis, S., Zong, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperpolarization-activated+cation+channels:+From+genes+to+function.">Hyperpolarization-activated cation channels: From genes to function.</a> Physiological Reviews. 89 (3), 847-885 (2009).</li><li>Davis, R. L., Crozier, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+firing+properties+of+type+I+spiral+ganglion+neurons.">Dynamic firing properties of type I spiral ganglion neurons.</a> Cell and Tissue Research. 361 (1), 115-127 (2015).</li><li>Reijntjes, D. O. J., Pyott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+afferent+signaling+complex:+Regulation+of+type+I+spiral+ganglion+neuron+responses+in+the+auditory+periphery.">The afferent signaling complex: Regulation of type I spiral ganglion neuron responses in the auditory periphery.</a> Hearing Research. 336, 1-16 (2016).</li><li>Eatock, R. A., Christov, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ionic Conductances of Vestibular Afferent Neurons: Shaping Head Motion Signals From the Inner Ear. , (2020).</li><li>Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similarities+in+the+biophysical+properties+of+spiral-ganglion+and+vestibular-ganglion+neurons+in+neonatal+rats.">Similarities in the biophysical properties of spiral-ganglion and vestibular-ganglion neurons in neonatal rats.</a> Frontiers in Neuroscience. 15, 710275 (2021).</li><li>Armstrong, C. E., Roberts, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+properties+of+frog+saccular+hair+cells:+distortion+by+enzymatic+dissociation.">Electrical properties of frog saccular hair cells: distortion by enzymatic dissociation.</a> The Journal of Neuroscience. 18 (8), 2962-2973 (1998).</li><li>Rocha-Sanchez, S. M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+expression+of+Kcnq4+in+vestibular+neurons+and+neurosensory+epithelia.">Developmental expression of Kcnq4 in vestibular neurons and neurosensory epithelia.</a> Brain Research. 1139, 117-125 (2007).</li><li>Meredith, F. L., Rennie, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zonal+variations+in+K++currents+in+vestibular+crista+calyx+terminals.">Zonal variations in K+ currents in vestibular crista calyx terminals.</a> Journal of Neurophysiology. 113 (1), 264-276 (2015).</li><li>Cai, H. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-dependent+activity+of+primary+auditory+neurons+in+the+presence+of+neurotrophins+and+antibiotics.">Time-dependent activity of primary auditory neurons in the presence of neurotrophins and antibiotics.</a> Hearing Research. 350, 122-132 (2017).</li><li>Needham, K., Nayagam, B. A., Minter, R. L., O'Leary, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+application+of+brain-derived+neurotrophic+factor+and+neurotrophin-3+and+its+impact+on+spiral+ganglion+neuron+firing+properties+and+hyperpolarization-activated+currents.">Combined application of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 and its impact on spiral ganglion neuron firing properties and hyperpolarization-activated currents.</a> Hearing Research. 291 (1-2), 1-14 (2012).</li><li>Adamson, C. L., Reid, M. A., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposite+actions+of+brain-derived+neurotrophic+factor+and+neurotrophin-3+on+firing+features+and+ion+channel+composition+of+murine+spiral+ganglion+neurons.">Opposite actions of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 on firing features and ion channel composition of murine spiral ganglion neurons.</a> The Journal of Neuroscience. 22 (4), 1385-1396 (2002).</li><li>Zhou, Z., Liu, Q., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+regulation+of+spiral+ganglion+neuron+firing+patterns+by+neurotrophin-3.">Complex regulation of spiral ganglion neuron firing patterns by neurotrophin-3.</a> The Journal of Neuroscience. 25 (33), 7558-7566 (2005).</li><li>Liu, X. -. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+channel+diversity+in+the+vestibular+ganglion:+NaV1.5,+NaV1.8,+and+tetrodotoxin-sensitive+currents.">Sodium channel diversity in the vestibular ganglion: NaV1.5, NaV1.8, and tetrodotoxin-sensitive currents.</a> Journal of Neurophysiology. 115 (5), 2536-2555 (2016).</li></ol>

Методы, представленные здесь, специфичны для записей изолированных нейронов; Предыдущие исследования были сосредоточены на записях с окончаний аксонов в полуинтактном препарате. По сравнению с существующими методами терминальной записи, изолированные записи обеспечивают превосход?...

Биполярные нейроны вестибулокохлеарного нерва соединяют сенсорные волосковые клетки внутреннего уха со стволом мозга. Они являются основными носителями информации о звуках и движениях головы; Повреждение этих важных клеток приводит к глухоте и нарушениям равновесия. Вестибулярная и слуховая части нерва состоят из различных типов клеток, которые морфологически и функционально разнообразны 1,2. В вестибулярном аппарате две афферентные субпопуляции спонтанно возбуждаются с интервалами, которые являются либо регулярными, либо нерегулярными. Считается, что время афферентного спайка отражает основное разнообразие в составе ионных каналов 3,4. В слуховой системе выделяют две основные субпопуляции нейронов спиральных ганглиозов (СГН); в то время как SGN типа I контактируют с отдельными внутренними волосковыми клетками5, SGN типа II контактируют с несколькими внешними волосковыми клетками5. Записи in vitro из полуинтактных и органотипических культур свидетельствуют о различиях в мембранных свойствах SGN I и II типов 6,7.
Многие ионные каналы и рецепторы нейротрансмиттеров, обнаруженные на концах этих нейронов, также находятся в их клеточных телах. Таким образом, культуры изолированных вестибулярных и спиральных ганглиозных сомат могут быть изучены in vitro , чтобы понять, как ионные каналы и рецепторы нейротрансмиттеров способствуют ответу этих нейронов. Компактная морфология изолированных клеточных тел позволяет получать высококачественные электрические записи, подходящие для детальной характеристики потенциал-зависимых ионных каналов и рецепторов нейротрансмиттеров. Легкий доступ к репрезентативному разнообразию подтипов нейронов позволяет проводить высокопроизводительный анализ разнообразия клеток.
В данной статье представлен метод выделения и культивирования диссоциированных тел ганглиозных клеток из верхней части вестибулярного ганглия у крыс на постнатальные сутки (Р)9–Р20. Также предлагаются варианты распространения этих методов на спиральный ганглий в дополнение к шагам, необходимым для успешного извлечения, диссоциации и покрытия ганглиозных клеток. Эти методы являются эволюцией методов, разработанных в публикациях различных лабораторий 8,9,10. Кроме того, в этот документ включено руководство по выбору здоровых клеток для записи с помощью патч-клэмпа.
Наконец, протокол описывает процедуру записи с использованием конфигурации 11 с использованием конфигурации11 с перфорированным патчем. Несмотря на то, что конфигурация с перфорированным пластырем является более трудоемкой и технически сложной, чем более распространенная конфигурация с разорванным пластырем, она лучше подходит для поддержания цитоплазматической среды, которая позволяет проводить длительные и стабильные сеансы записи. Преимущества этой конфигурации записи проиллюстрированы здесь улучшенной стабильностью гиперполяризационно-активированных катионных токов в перфорированном пластыре по сравнению с разорванным патчем.
Этот протокол состоит из пяти разделов. В разделах 1-3 описываются решения и инструменты, которые могут быть подготовлены и сохранены заранее. В разделе 4 описаны этапы препарирования и покрытия вестибулярного аппарата и СГН. В разделе 5 описаны этапы регистрации нейронов после определенного периода культивирования. В наших руках разделы 4 и 5 выполняются в течение 2 дней подряд.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amphotericin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4888-100MG</td>
			<td>For perforated patch recordings.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP di-sodium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7699</td>
			<td>Additive to internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement (50x), serum free</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td>additive to culture medium, for SGN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beakers (1000, 100, 10) milliliter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bench-top centrifuge</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2641-0016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen burner</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>1311-01</td>
			<td>Additive to internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5318</td>
			<td>one out of three enzyme to digest tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass, rectangular, #1 thickness, 22x40&#160;</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>90082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I,from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11284932001</td>
			<td>one out of three enzyme to digest tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #3 Forceps (Blunt)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11231-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps (Fine)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 Forceps (Fine)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E0396</td>
			<td>Additive to internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Puller</td>
			<td>Narashige</td>
			<td>PC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epi-illumination light source&#160;</td>
			<td>Zeiss&#160;</td>
			<td>CL 1500 ECO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2716</td>
			<td>for cleaning head and around dissection bench</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filamented Borosilicate Capillaries for electrodes</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF140-117-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-edged dissection blade</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10010-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur Pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14673-010</td>
			<td>to pull trituration pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16140063</td>
			<td>additive to culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375-100G</td>
			<td>for pH buffering all solutions in protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate / magnetic stirrers&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76549-914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulated bucket filled with ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>to keep all samples and solutions cool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2SO4, Potassium Sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9458-250G</td>
			<td>Additive to internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P93333</td>
			<td>Additive to internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH (1 M)</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>319376-500ML</td>
			<td>To bring internal solution to desired pH.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14133-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz medium&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L4386</td>
			<td>dissection and bath solutions&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-profile-bath recording chamber for culture dishes</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>luer-lok syringes, 30 ml</td>
			<td>BD</td>
			<td>302832</td>
			<td>for drawing L-15/HEPES/HEPES solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM + Glutamax Supplement</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>41-090-101</td>
			<td>base of the culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2-Hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1028</td>
			<td>Additive to internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microFil needle for filling micropipettes - 34 gauge&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MF34G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narashige</td>
			<td>MF-90</td>
			<td>For electrode polishing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>additiive to culture medium, for SGN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Additive to internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH (1 M)</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>319511-500ML</td>
			<td>for titration pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmometer</td>
			<td>Advanced Instruments Inc.</td>
			<td>3320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen, Medical grade, with adequate regulator and tubing</td>
			<td>USC Material Management</td>
			<td>MEDOX200 (Identifier: 00015)</td>
			<td>for dissolving into dissection and bath solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette bulb (3 ml)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-448-25</td>
			<td>bulb for trituration pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>additive to prevent contamination of culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital based euthanasia solution (e.g., Fatal Plus. 50 &#8211; 60 mg/kg dosing)&#160;</td>
			<td>MWI Animal Health</td>
			<td>15199</td>
			<td>for euthanasia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PES membrane filters ,&#160; 0.2 micrometer&#160;</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>566-0020</td>
			<td>for filtering solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PES membrane sterile syringe filters, 0.22 um, 30 mm&#160;</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229747</td>
			<td>for filtering solutions drawn into syringes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 35 x 10 mm</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>32-103</td>
			<td>for micro dissection and to hold Tip dip solution in perforated-patch configuration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes, 60 x 15 mm</td>
			<td>Midland Scientific</td>
			<td>P7455</td>
			<td>for gross dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>Model S20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettors (1000, 200, 10) microliter</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-d-lysine coated glass bottomed culture dish</td>
			<td>Mattek</td>
			<td>P35GC-0-10-C</td>
			<td>to plate neurons for culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick change platform, heated base, for 35 mm culture dishes</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reference Cell</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>RC1T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>4-315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scientific Scale</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>XS64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes (10, 25) milliliter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Grease Kit (for sealing coverglass and chamber)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Animal Guillotine</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>DCAP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small animal guillotine</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>DCAP</td>
			<td>for decapitation if dissecting rats older than P15.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Dissection Microscope&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (3, 10, 30) milliliter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1426</td>
			<td>one out of three enzyme to digest tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuberculin syringe&#160;</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>8881500105</td>
			<td>for delivering euthanasia solution by intraperitoneal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissor, 2.5 mm Cutting Edge</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volumetric flask, 1000 milliliter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>VWR</td>
			<td>945300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, sterile u ltrapure, R&#62;18.18 megaOhms cm (e.g., filtered by a Millipore-Sigma water purification system)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>CDUFBI001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating and culturing vestibular and spiral ganglion somata from neonatal rodents for patch-clamp recordings

Компактная морфология изолированных и культивируемых ганглионарных нейронов внутреннего уха позволяет детально охарактеризовать ионные каналы и рецепторы нейротрансмиттеров, которые вносят свой вклад в разнообразие клеток в этой популяции. В этом протоколе описаны шаги, необходимые для успешного препарирования, диссоциации и кратковременного культивирования сомат биполярных нейронов внутреннего уха с целью записи патч-зажимов. Подробная инструкция по подготовке нейронов вестибулярного ганглия снабжена необходимыми модификациями, необходимыми для нанесения покрытия нейронов спиральных ганглиозов. Протокол включает в себя инструкции по выполнению записи с коммутационными зажимами всей ячейки в конфигурации перфорированного патча. Примеры результатов, характеризующих записи токов, опосредованных гиперполяризационными циклическими нуклеотидно-зависимыми (HCN)-опосредованными токами, подчеркивают стабильность конфигурации записи с перфорированным патчем по сравнению с более стандартной конфигурацией с разорванным патчем. Комбинация этих методов, изолированная сомата плюс перфорированные записи с заплатками-зажимами, может быть использована для изучения клеточных процессов, требующих длительных, стабильных записей и сохранения внутриклеточной среды, таких как передача сигналов через рецепторы, связанные с G-белком.

Запуск протоколов напряжения-подавления с применением семейств ступеней напряжения выявляет зависимую от напряжения активацию множества различных семейств токов. Репрезентативные примеры токов всей ячейки, вызванных VGN и адаптированных из опубликованных записей13, пока...

Watch this Scientific Journal Video about Isolating and Culturing Vestibular and Spiral Ganglion Somata from Neonatal Rodents for Patch-Clamp Recordings at JoVE.com

Isolating and Culturing Vestibular and Spiral Ganglion Somata from Neonatal Rodents for Patch-Clamp Recordings

Здесь представлены методы, содержащие подробные инструкции по препарированию, диссоциации, культивированию и записи патчей-зажимов из нейронов вестибулярного ганглия и спирального ганглия внутреннего уха.

Выделение и культивирование вестибулярных и спиральных ганглионарных сомат у неонатальных грызунов для записи с помощью патч-клэмпа

The compact morphology of isolated and cultured inner ear ganglion neurons allows for detailed characterizations of the ion channels and neurotransmitter ...

Многие ионные каналы и рецепторы нейротрансмиттеров, которые находятся на концах слуховых и вестибулярных афферентных нейронов, также находятся в их клеточных телах. Культуры изолированных клеточных тел могут быть изучены in vitro, чтобы понять, как эти ионные каналы и рецепторы влияют на реакцию нейронов. Компактная морфология клеточных тел позволяет проводить высококачественные электрические записи для характеристики потенциал-зависимых свойств ионных каналов и рецепторов нейротрансмиттеров.Кроме того, легкий доступ к широкому спектру типов клеток обеспечивает высокую производительность за счет физического анализа разнообразия клеток. Процедуры будут продемонстрированы аспирантом Кэтрин Регаладо вместе с постдокторантами, доктором Дэниелом Бронсоном и Натаниэлем Новаком из моей лаборатории. Для начала поднесите стеклянную пастбищную пипетку к пламени горелки Бунзена, чтобы подготовить тритрирующие пипетки для диссоциации клеток.Как только стеклянный наконечник начнет плавиться, растяните стекло до желаемого диаметра. Оттяните один конец пипетки от пламени, чтобы создать небольшой изгиб. Поместите изогнутую пипетку под микроскоп.С помощью подрезной плитки надрежьте и разбейте стекло нужного диаметра. Пропустите наконечник пипетки над пламенем горелки. Это позволит быстро отполировать шероховатые края возле кончика.Вычерпайте мозг усыпленной мыши с помощью закрытых хирургических ножниц. Отрежьте и удалите черепно-мозговой нерв, чтобы полностью отделить мозг от черепа. Начиная с затылка, снимите прозрачный мембранный материал щипцами, а затем вырежьте верхнюю часть черепа хирургическими ножницами.Удалите лишнюю ткань с затылка и шеи, чтобы сделать область рассечения и капсулу яичной раковины более чистой и легкодоступной. Перенесите ткань во вторую чашку Петри со свежим раствором L-15. Затем локализуют ушную капсулу и слуховой, верхний, вестибулярный и нижний вестибулярные нервы.Отделите верхний и нижний ганглии с помощью маленьких пружинных ножниц и отрежьте слуховой нерв. С помощью скальпеля аккуратно сбрейте костный гребень, чтобы ослабить костный участок, под которым нерв погружается в костную капсулу. Аккуратно удалите обломки скальпелем, обнажив всю опухшую часть ганглия.С помощью тонких пружинных ножниц разрежьте и отделите ганглий от периферической нервной ветви, которая идет к утрикуле. Удалите верхний ганглий с помощью тонких щипцов и перенесите его в 35-миллиметровую чашку Петри со свежим раствором L-15. После предварительного нагрева ферментного раствора перелейте ферментную смесь в 35-миллиметровую чашку Петри и поместите ее в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия на 10-15 минут.Очистите ганглий с помощью тонких щипцов и маленьких пружинных ножниц, удалив кость, лишнюю ткань, нервные волокна и любые другие лишние структуры. Позаботьтесь о том, чтобы свести к минимуму удаление любой ганглионарной ткани. Очищенные ганглии переложите в предварительно подогретый раствор фермента и поместите обратно в инкубатор на 10-40 минут.Затем переложите ганглии в 35-миллиметровую чашку Петри со свежим раствором L-15. Через две-три минуты перенесите ганглии в другую 35-миллиметровую чашку Петри, наполненную отфильтрованными питательными средами. Перелейте примерно 150 микролитров отфильтрованной питательной среды в чашку со стеклянным дном, покрытую покрытием.Затем перенесите нужное количество ганглиев на покровный слип. Возьмите небольшое количество питательной среды из чашки для культивирования и промойте тритрированную пипетку средством, чтобы предотвратить прилипание ткани к стенкам стеклянной пипетки. Растирайте, осторожно и многократно пропуская ткань через пипетку до тех пор, пока ганглии не будут достаточно диссоциированы.Через пять минут проверьте под световым микроскопом, осели ли клетки на покровном листе. Осторожно поместите чашку с культурой в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия на 12–24 часа. Затем найдите ушную капсулу после разделения головы пополам и извлеките ее из черепа, отколов края щипцами.В спиральной части ушной капсулы находится улитка с органом Корти. Откалывают кость, перекрывая кохлеарные витки тонкими щипцами, параллельными изгибу кости. С помощью маленьких пружинных ножниц разрежьте модиол у основания улитки, чтобы освободить его от остальной части ушной капсулы.Разрежьте орган корти на два-три витка маленькими пружинными ножницами так, чтобы он лежал ровно, и удалите модиол из каждого витка. Удалите сосудистую полосу, защипнув ее у основания тонкими щипцами. Раскрутите спираль и поднимитесь к вершине, чтобы освободить ее от органа Корти.Удалите спиральный ганглий, надрезав на краю того места, где спиральные тракты ганглионарных нейронных волокон выступают в сторону волосковых клеток, а затем очистите ганглий, как показано ранее. После ферментативной обработки спирального ганглия тритратируют спиральный ганглий в питательной среде с добавлением N2 и B27. Поместите культуральную чашку, содержащую диссоциированные ганглии, в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия и 5%-ным углекислым газом на 12–24 часа.Опустите кончик пипетки в чистый раствор чашки для закваскивания, чтобы наполнить его чистым раствором, не содержащим амфотерицина. Заполните заднюю часть пипетки внутренним раствором, содержащим амфотерицин. Опустите кончик пипетки обратно в чистый раствор чашки для культивирования, в то время как амфотерицин медленно поступает в наконечник с задней стороны пипетки.Затем заполните пипетку раствором амфотерицина на две трети пипетки. Опустите пипетку в ванну записывающей камеры и расположите наконечник пипетки в центре поля зрения. Убедитесь, что на наконечнике нет пузырьков воздуха или другого мусора.Расположите пипетку близко к мембране и плотно приземлитесь на центр ячейки. Применяйте отрицательное давление или всасывание с помощью шприца или ротовой пипетки. Включите удерживающий потенциал минус 60 милливольт.Сопротивление уплотнения должно увеличиваться до тех пор, пока оно не пройдет гигаом. Как только образуется гигаомное уплотнение, сбросьте отрицательное давление. Прежде чем тирозин начнет действовать, входное сопротивление медленно уменьшается, а ток, протекающий в ответ на шаг напряжения в пять милливольт, постепенно увеличивается по мере того, как амфотерицин входит в мембрану.На рисунке показаны репрезентативные примеры токов всей клетки, вызванных нейроном вестибулярного ганглия. Суммарные входящие натриевые токи идентифицируются здесь по их переходной активации и инактивации. Суммарные внешние токи переносятся в основном ионами калия и имеют гораздо более медленную кинетику активации и инактивации, чем токи натрия.Гиперполяризационные активированные циклические нуклеотидные зависимые токи, или токи HCN, активируются семейством длительных гиперполяризационных напряжений. Стабильность характеризации ионных каналов в перфорированном пятне в разные моменты времени во время регистрации показана на этом рисунке. Кривые активации токов HCN в зависимости от напряжения были измерены в конфигурации перфорированного патча.Кривая имеет сигмоидальную форму и была стабильной на протяжении всей длительной записи. Относительная нестабильность режима разорванного патча иллюстрируется неперекрывающимися сигмоидальными кривыми из разных моментов времени. Здесь показаны кривые активации токов HCN при конфигурации разорванного участка.Здесь показаны паттерны возбуждения в пяти вестибулярных ганглиозных сомарах, пяти спиральных ганглиозных нейронах и соответствующие текущие этапы. Эта гетерогенность в паттернах возбуждения отражает фундаментальное разнообразие в составе нижележащих натриевых и калиевых каналов как в нейронах вестибулярного ганглия, так и в нейронах спиральных ганглиозов. Чтобы максимизировать выживаемость клеток во время этой процедуры, избегайте образования пузырьков воздуха, не переутомляйте ткань и дайте клеткам осесть, прежде чем помещать образцы в инкубатор.Перфорированный патч-зажим позволяет изучать ионные каналы, которые модулируются цитозольными вторичными мессенджерами, что имеет решающее значение для изучения влияния эфферентных нейротрансмиттеров на ганглиозные нейроны. Записи патч-зажимов этих биполярных нейронов сыграли важную роль в выявлении того, как биофизическое разнообразие способствует функциональному разнообразию сенсорных нейронов.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Патч зажим Recordings от мыши нейронов сетчатки в темно-адаптированной фрагмент подготовка

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

Парные Patch Clamp Recordings от Мотор-нейрон и целевые скелетных мышц в данио рерио

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans

Изоляция Носовые Обонятельные стволовых клеток от грызунов и человека

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external ...

Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

Культивирование и электрофизиологии ячеек на NRCC Патч зажим фишки

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard ...

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch Clamp Записи в внутренних волосковых клеток уха, изолированных от данио рерио

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

<sub&gt; 1</sub&gt; F<sub&gt; O</sub&gt; АТФазы Подготовка пузырька и техника исполнительских патч зажим Записи субмитохондриальных мембран везикул

Mitochondria are involved in many important cellular  functions including metabolism, survival1, development and, calcium signaling2. Two of the most ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

Выделение сенсорных нейронах<em&gt; Aplysia саЩогтса</em&gt; Для патч зажим Recordings глутаматергической Токи

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Патч зажим Recordings от эмбриональных данио рерио Mauthner клеток

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

Цельноклеточная Записи патч-зажим от Morphologically- и нейрохимически выявленных гиппокампа Интернейроны

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

Электрофизиологических и морфологических характеристик нейронов микросхем при остром мозга срезов при использовании парных патч-зажим Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...